高氧對小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中根蛋白的影響△

王龍梅 閆琳 楊俠 董曉光 徐海峰

病理性新生血管的形成是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻塞性眼病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等一系列視網(wǎng)膜血管性疾病的主要特征［1］，這些異常新生血管主要在視網(wǎng)膜表面生長，引起視功能損傷和視力嚴重下降［2］。視網(wǎng)膜新生血管的形成過程極為復雜，參與的因子眾多［3-5］。但從細胞增生的角度來講，血管內(nèi)皮細胞增生是新生血管形成的細胞學基礎，這一點與腫瘤的發(fā)生十分類似，均與細胞異常增生有關。研究發(fā)現(xiàn)，根蛋白(Radixin)是細胞膜骨架連接蛋白，它參與了腫瘤細胞的增生、遷移、浸潤過程［6-7］，同時它還參與了血管內(nèi)皮屏障功能改變過程［8-10］。由此推測，Radixin有可能參與視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生，然而目前相關研究甚少。因此本實驗中我們對小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成過程中Radixin的表達情況進行研究，以期為臨床治療新生血管性視網(wǎng)膜疾病提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將健康性成熟SPF級C57BL/6J小鼠(維通利華，北京)按雌雄比例3∶1合籠飼養(yǎng)于山東省眼科研究所實驗動物中心，待母鼠懷孕后分出單獨一籠飼養(yǎng)，取其所生幼鼠制作動物模型。

1.2 主要儀器與試劑 異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐(FD-2000S)(Sigma，美國)，山羊抗小鼠 Radixin一抗(Santa Cruz，美國)，免疫組織化學試劑盒(福州邁新)，RNA 提取試劑盒(Macherey-nagel，德國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)，Real time-PCR 試劑盒(天根，北京)，探針引物(金斯瑞，南京)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，上海)，ECL顯影試劑盒(Thermo scientific，美國)，辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗(Santa Cruz，美國)。LB-CYl2C數(shù)字測氧儀(路博偉業(yè)，青島)，熒光顯微鏡(Nikon，日本)，7500型熒光定量PCR儀(ABI，美國)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將生后7 d的小鼠隨機分為 2組，每組72只，分別為:(1)高氧誘導組:小鼠在生后7 d進入高氧環(huán)境，飼養(yǎng)5 d后回到正常氧環(huán)境中飼養(yǎng);(2)正常對照組:小鼠一直置于正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。兩組小鼠分別于生后 12 d、13 d、17 d、21 d、30 d即氧誘導視網(wǎng)膜新生血管動物模型造模成功后的0 d、1 d、5 d、9 d、18 d 處死小鼠。

1.3.2 動物模型的構建 將生后7 d的小鼠與母鼠同籠放入氧箱中，調(diào)整氧箱內(nèi)氧氣體積分數(shù)為75%±2%，溫度為(23±2)℃。LB-CY12C數(shù)字測氧儀每日監(jiān)測3～4次，保證氧箱內(nèi)含氧體積分數(shù)穩(wěn)定。飼養(yǎng)5 d后返回正常氧環(huán)境中繼續(xù)與母鼠共同飼養(yǎng)。待小鼠出氧箱時行血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片，以視網(wǎng)膜后極部形成大片無灌注區(qū)作為造模成功的標準。

1.3.3 FD-2000S血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片 兩組分別于生后 12 d、13 d、17 d、21 d、30 d 各取 2 只小鼠，腹腔注射麻醉后于手術顯微鏡下自上腔靜脈灌注適量FD-2000S，保持正常血液循環(huán)5 min。頸部脫臼處死小鼠，摘取眼球，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定15 min，手術顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體，完整分離視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜放射狀剪開，玻璃體面向上平鋪于載玻片上，甘油封片后置于熒光顯微鏡下，應用488 nm波長藍光激發(fā)，行形態(tài)學觀察并照相。

1.3.4 視網(wǎng)膜組織病理學檢查 兩組分別于生后12 d、13 d、17 d、21 d、30 d 各取 2 只小鼠，頸部脫臼處死，摘取眼球，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。全眼球矢狀位連續(xù)切片(厚度4 μm)至眼環(huán)呈現(xiàn)不完整圓環(huán)時，每隔15張切片取2張貼片于一張載玻片上，HE染色光鏡下觀察形態(tài)并照相。

1.3.5 免疫組織化學染色檢測Radixin的表達 兩組分別于生后17 d各取2只小鼠，同1.3.4方法制作石蠟切片。將石蠟切片置于60℃溫箱烤片過夜，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫蠟各10 min。梯度酒精復水、高壓修復抗原。體積分數(shù)3%H2O2封閉過氧化物酶，山羊血清封閉抗原后加入羊抗小鼠Radixin一抗(1∶200)，陰性對照以 PBS代替一抗，37℃水浴鍋孵育60 min;PBS洗后滴加增強劑及二抗，37℃水浴鍋孵育30 min，PBS洗后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。

1.3.6 Taqman 法 Real time-PCR 檢測 Radixin mRNA的表達 兩組分別于生后12 d、13 d、17 d、21 d、30 d各取5只小鼠，取出視網(wǎng)膜(方法同1.3.3)，提取視網(wǎng)膜總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，進行Real time-PCR擴增。Radixin引物和探針序列:上游:5’-GAAGAATGAACGCGTGAAG-3’， 下 游:5’-CTCAGCGTGAAGAACATCGT-3’，探針:5’-TCTGAACTCAATGCCTGGAGCTGC-3’，引物間跨度 103 bp;GAPDH引物和探針序列:上游:5’-ACAACTTTGGCATTGTGGAA-3’，下游:5’-GATGCAGGGATGATGTTCTG-3’，探針:5’-CATGCCATCACTGCCACCCA-3’，引物間跨度133 bp。反應條件:預變性95℃ 10 s;PCR反應:95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。

1.3.7 Western-blot檢測Radixin蛋白的表達 兩組分別于生后 12 d、13 d、17 d、21 d、30 d 各取 5 只小鼠，提取視網(wǎng)膜總蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度并定量至 30 μg，100 g·L-1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，4℃、100 mA電轉(zhuǎn)膜3 h將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入羊抗小鼠Radixin一抗(1∶500)4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗膜后將硝酸纖維素膜與辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h，ECL顯影試劑盒顯影并成像。Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)照相，Image J2x軟件測量目的蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參GAPDH灰度值比較。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，高氧誘導組和正常對照組小鼠不同時間點Radixin mRNA及蛋白的表達水平以表示，采用兩因素析因設計資料方差分析進行比較。高氧誘導組和正常對照組相同時間點及組內(nèi)各時間點間Radixin mRNA及蛋白的表達水平的多重比較應用單因素方差分析(LSD-t檢驗)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜鋪片血管形態(tài)觀察 高氧誘導組小鼠在生后12 d視網(wǎng)膜動脈高度收縮，大面積無血管區(qū)形成，僅在周邊部形成小面積的血管網(wǎng)(圖1A);生后13 d視網(wǎng)膜可見大片無灌注區(qū)，中周部血管密度較生后12 d增高，小血管走行紊亂，少量新生血管芽及微血管瘤形成(圖1B);生后17 d視網(wǎng)膜大分支血管迂曲擴張、滲漏明顯，無灌注區(qū)面積減小，中周部血管進入無灌注區(qū)邊緣，血管密度增加，但血管走行更為紊亂，可見滲出斑，大量新生血管芽及微血管瘤形成，達到血管增生反應高峰(圖1C);生后21 d視網(wǎng)膜血管仍可見迂曲、滲漏，無灌注區(qū)幾乎消失，血管走行仍紊亂，但新生血管芽較生后17 d減少(圖1D);生后30 d增生反應基本消退，血管走行大致正常，分布也較均勻，僅殘留部分大分支血管扭曲滲漏改變(圖1E)。正常對照組小鼠生后12 d視網(wǎng)膜血管已分布完全，密度均勻，走形自然，紋路清晰(圖1F)。

Figure 1 Stretched preparation of retinas after FD-2000S intravascular injection(×40).A:OIR group at 12 days;B:OIR group at 13 days;C:OIR group at 17 days;D:OIR group at 21 days;E:OIR group at 30 days;F:Normal control group at 12 days FD-2000S血管灌注視網(wǎng)膜鋪片(×40)。A:高氧誘導組生后12 d視網(wǎng)膜;B:高氧誘導組生后13 d視網(wǎng)膜;C:高氧誘導組生后17 d視網(wǎng)膜;D:高氧誘導組生后21 d視網(wǎng)膜;E:高氧誘導組生后30 d視網(wǎng)膜;F:正常對照組生后12 d視網(wǎng)膜

2.2 視網(wǎng)膜組織病理學檢測 高氧誘導組小鼠生后12 d視網(wǎng)膜較薄，未見突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核(圖2A);生后13 d視網(wǎng)膜內(nèi)界膜變粗糙，偶見突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核和血管管腔(圖2B);生后17 d視網(wǎng)膜可見大量突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，內(nèi)界膜粗糙(圖2C);生后21 d視網(wǎng)膜仍可見大量突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，內(nèi)界膜仍粗糙(圖2D);生后30 d視網(wǎng)膜內(nèi)界膜較平滑，未見突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核(圖2E)。正常對照組小鼠生后17 d視網(wǎng)膜內(nèi)界膜較平整光滑，偶見穿過內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核(圖2F)。

2.3 免疫組織化學染色檢測Radixin在視網(wǎng)膜組織中的表達 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Radixin在兩組中均有表達。高氧誘導組小鼠生后17 d在視網(wǎng)膜新生血管管壁、血管芽、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)節(jié)細胞層均可見大量棕黃色顆粒，Radixin表達明顯增強(圖3A)。正常對照組小鼠生后17 d視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平滑，棕黃色顆粒較少，Radixin表達較弱(圖3B)。

Figure 2 Histopathological examination of retina in mice(HE，×400).The arrows pointed out the proliferated vascular endothelial cells or vessels.A:OIR group at 12 days;B:OIR group at 13 days;C:OIR group at 17 days;D:OIR group at 21 days;E:OIR group at 30 days;F:Normal control group at 17 days 小鼠視網(wǎng)膜組織病理學檢查(箭頭處為增生的血管內(nèi)皮細胞核或血管管腔;HE染色，×400)。A:高氧誘導組生后12 d視網(wǎng)膜;B:高氧誘導組生后13 d視網(wǎng)膜;C:高氧誘導組生后17 d視網(wǎng)膜;D:高氧誘導組生后21 d視網(wǎng)膜;E:高氧誘導組生后30 d視網(wǎng)膜;F:正常對照組生后17 d視網(wǎng)膜

2.4 Taqman法 Real-time PCR 檢測 Radixin mRNA的表達 對兩組小鼠不同時間點Radixin mRNA表達水平進行析因分析結(jié)果顯示，不同組別和不同時間點間Radixin mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(Fgroup=59.273，P=0.000;Ftime=538.071，P=0.000;Finteraction=297.126，P=0.000)。高氧誘導組小鼠視網(wǎng)膜各時間點間Radixin mRNA表達水平呈先升高后降低的趨勢，于生后17 d達到高峰，表達變化趨勢與視網(wǎng)膜新生血管生長趨勢一致。高氧誘導組小鼠生后12 d、13 d Radixin mRNA表達水平較正常對照組同齡小鼠低，生后17 d、21 d Radixin mRNA的表達水平較正常對照組同齡小鼠明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P12d=0.000，P13d=0.000，P17d=0.000，P21d=0.000)。高氧誘導組Radixin mRNA表達水平生后13 d較同組生后12 d增高，生后17 d較同組生后13 d和生后21 d均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P13dvs.12d=0.000，P17dvs.13d=0.000，P17dvs.21d=0.000)。正常對照組Radixin mRNA的表達總體穩(wěn)定在較低水平，生后17 d表達稍高。兩組生后30 d時Radixin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P30d=0.058;見表1)。

Figure 3 Immunohistochemical staining(×400).The arrows pointed out the proliferated vascular endothelial cells or vessels.A:OIR group at 17 days;B:Normal control group at 17 days 免疫組織化學染色結(jié)果(箭頭處為增生的血管內(nèi)皮細胞或管腔;×400)。A:高氧誘導組生后17 d視網(wǎng)膜;B:正常對照組生后17 d視網(wǎng)膜

2.5 Western-blot檢測 Radixin蛋白表達水平

Western-blot檢測結(jié)果見圖4。對兩組小鼠不同時間點Radixin蛋白表達水平析因分析結(jié)果顯示，不同組別和不同時間點間Radixin蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(Fgroup=419.307，P=0.000;Ftime=663.946，P=0.000;Finteraction=354.538，P=0.000)。高氧誘導組小鼠各時間點Radixin蛋白表達水平也呈先升高后降低的趨勢，于生后17 d達到高峰，之后下降，但仍可在較高水平持續(xù)至生后21 d。高氧誘導組小鼠生后12 d、生后13 d Radixin蛋白表達水平低于正常對照組同齡小鼠，生后17 d、生后21 d表達水平明顯高于正常對照組同齡小鼠，差異均有統(tǒng)計學意義(P12d=0.000，P13d=0.001，P17d=0.000，P21d=0.000)。高氧誘導組小鼠視網(wǎng)膜 Radixin蛋白表達水平生后13 d較生后12 d增高，生后17 d較生后13 d和生后21 d均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P13dvs.12d=0.000，P17dvs.13d=0.000，P17dvs.21d=0.000)。正常對照組各時間點Radixin蛋白表達總體穩(wěn)定在較低水平，生后17 d表達稍高。兩組生后30 d時Radixin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P30d=0.082;見表1)。

表1 兩組不同時間點小鼠視網(wǎng)膜Radixin mRNA和Radixin蛋白表達水平Table 1 Expression levels of radixin mRNA and protein in two groups at different time points ()

表1 兩組不同時間點小鼠視網(wǎng)膜Radixin mRNA和Radixin蛋白表達水平Table 1 Expression levels of radixin mRNA and protein in two groups at different time points ()

Group 12 days 13 days 17 days 21 days 30 days Radixin mRNA OIR 0.435±0.051 0.824±0.067 2.656±0.126 1.410±0.136 1.028±0.127 Control 1.000±0.033 1.144±0.106 1.333±0.119 1.184±0.104 0.965±0.064 Radixin protein OIR 0.625±0.037 0.706±0.018 1.855±0.039 1.265±0.013 0.826±0.023 Control 0.827±0.023 0.848±0.031 1.030±0.038 0.804±0.013 0.785±0.010

Figure 4 Expression levels of radixin protein in OIR group and normal control group 高氧誘導組和正常對照組 Radixin蛋白表達

3 討論

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是一類高致盲性眼病，新生血管大量增生會引起牽拉性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體出血、視網(wǎng)膜裂孔等病變導致視力下降或喪失，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前研究該類疾病較成熟的動物模型是Smith等［11］建立的高氧誘導視網(wǎng)膜新生血管動物模型，該模型建模成功率較高，模型鼠視網(wǎng)膜新生血管增生于建模成功后5 d即小鼠生后17 d左右達到高峰［12］，增生反應一直延續(xù)到小鼠生后21 d，以后逐漸消退，30 d時視網(wǎng)膜血管形態(tài)基本穩(wěn)定，接近正常。在本實驗中，我們成功建立了高氧誘導視網(wǎng)膜新生血管模型，選擇小鼠造模成功后0 d、1 d、5 d、9 d、18 d(即生后 12 d、13 d、17 d、21 d、30 d)這5個視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化較顯著的時間點來觀察視網(wǎng)膜組織中Radixin基因和蛋白的動態(tài)表達變化，研究Radixin與視網(wǎng)膜新生血管形成的關系。

Radixin是 ERM(Ezrin/Radixin/moesin)蛋白家族成員之一［13］，它在多種真核細胞內(nèi)表達。作為膜骨架連接蛋白，它可將肌動蛋白骨架與CD43、CD44、細胞黏附分子及多種細胞膜通道和受體相連接［14-15］，參與了多種細胞生物活動。研究已表明，Radixin在腫瘤進展過程中起到了重要作用，參與了腫瘤細胞的增生、遷移、浸潤過程［6-7］，干擾 Radixin基因表達，會抑制前列腺癌和胰腺癌細胞的增生和遷移。同時亦有研究表明，Radixin還參與了血管內(nèi)皮間屏障功能改變過程［8-10］。以上研究表明，Radixin至少與細胞增生、遷移有關，而血管內(nèi)皮細胞的增生、遷移又是視網(wǎng)膜新生血管形成過程的重要環(huán)節(jié)，所以我們推測，Radixin參與了視網(wǎng)膜新生血管的形成。目前雖然相關研究甚少，但我們在前期的實驗研究中已發(fā)現(xiàn)，高氧誘導視網(wǎng)膜新生血管模型鼠視網(wǎng)膜血管增生高峰期伴隨著 Radixin的高表達［16］，本實驗結(jié)果也證實，在正常小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Radixin的表達水平較低，而在高氧誘導組小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成過程中Radixin的表達水平明顯增高，同時視網(wǎng)膜新生血管增生高峰期Radixin基因和蛋白的表達水平也達最高，Radixin的表達變化趨勢與視網(wǎng)膜新生血管增生和衰退趨勢相一致。

雖然目前以血管內(nèi)皮生長因子為靶目標治療眼部新生血管性疾病取得了一定的效果，但是眼內(nèi)新生血管的生成是多種因子相互作用的結(jié)果，如有研究表明氨基胍化合物(aminoguanidine)、NADPH氧化酶［4-5］等因子也參與了眼內(nèi)新生血管形成過程。由此可知單純阻斷某單一因子或受體并不能徹底抑制新生血管的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，Radixin在視網(wǎng)膜新生血管生成過程中高表達，在視網(wǎng)膜新生血管生成高峰期表達水平最高，鑒于Radixin的上述作用及表達情況，通過靶向干擾Radixin的基因表達或者抑制其活性對視網(wǎng)膜新生血管的形成和發(fā)展可能具有重要影響。Radixin有望成為臨床治療新生血管性視網(wǎng)膜疾病的新靶點，但其確切的作用機制尚需進一步研究證實。

1 Gariano RF，Gardner TW.Retinal angiogenesis in development and disease［J］.Nature，2005，438(7070):960-966.

2 Zou H，Otani A，Oishi A，Yodoi Y，Kameda T，Kojima H，et al.Bone marrow-derived cells are differentially involved in pathological and physiological retinal angiogenesis in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(2):1268-1273.

3 Hu J，Song X，He YQ，F(xiàn)reeman C，Parish CR，Yuan L，et al.Heparanase and vascular endothelial growth factor expression is increased in hypoxia-induced retinal neovascularization［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(11):6810-6817.

4 Fu ZJ，Li SY，Kociok N，Wong D，Chung SK，Lo AC.Effects of aminoguanidine on retinal apoptosis in mice with oxygen-induced retinopathy［J］.Int J Ophthalmol，2013，6(4):436-441.

5 Chan EC，van Wijngaarden P，Liu GS，Jiang F，Peshavariya H，Dusting GJ.Involvement of nox2 NADPH oxidase in retinal neovascularization［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(12):7061-7067.

6 Valderrama F，Thevapala S，Ridley AJ.Radixin regulates cell migration and cell-cell adhesion through Rac1［J］.J Cell Sci，2012，125(14):3310-3319.

7 Chen SD，Song MM，Zhong ZQ，Li N，Wang PL，Cheng S，et al.Knockdown of radixin by RNA interference suppresses the growth of human pancreatic cancer cells in vitro and in vivo［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(3):753-759.

8 Adyshev DM，Moldobaeva NK，Elangovan VR，Garcia JG，Dudek SM.Differential involvement of ezrin/radixin/moesin proteins in sphingosine 1-phosphate-induced human pulmonary endothelial cell barrier enhancement［J］.Cell Signal，2011，23(12):2086-2096.

9 Koss M，Pfeiffer GR 2nd，Wang Y，Thomas ST，Yerukhimovich M，Gaarde WA，et al.Ezrin/radixin/moesin proteins are phosphorylated by TNF-alpha and modulate permeability increases in human pulmonary microvascular endothelial cells［J］.J Immunol，2006，176(2):1218-1227.

10 Guo X，Wang L，Chen B，Li Q，Wang J，Zhao M，et al.ERM protein moesin is phosphorylated by advanced glycation end products and modulates endothelial permeability［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(1):238-246.

11 Smith LE，Wesolowski E，McLellan A，Kostyk SK，D’Amato R，Sullivan R，et al.Oxygen-induced retinopathy in the mouse［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1):101-111

12 閆 妍，原公強，董曉光，陳蕊，鄭麗.Evans藍灌注血管造影對改良型高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)觀察［J］.眼科新進展，2007，27(4):658-661

13 Diakowski W，Grzybek M，Sikorski AF.Protein 4.1，a component of the erythrocyte membrane skeleton and its related homologue proteins forming the protein 4.1/FERM superfamily［J］.Folia Histochem Cytobiol，2006，44(4):231-248.

14 Bretscher A，Edwards K，F(xiàn)ehon RG.ERM proteins and merlin:integrators at the cell cortex［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(8):586-599.

15 Tsukita S，Yonemura S.Cortical actin organization:lessons from ERM(ezrin/radixin/moesin)proteins［J］.J Biol Chem，1999，274(49):34507-34510.

16 Yang X，Dong XG，Jia CK，Wang YQ.Profiling of genes associated with the murine model of oxygen induced retinopathy［J］.Mol Vis，2013，19:775-788.