鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量研究

魏歡平+李翠+羅罡+張思思+林星貝+賀筱蓉

摘 要：以軟腳紅桿鐵皮石斛為實驗材料，參考《中國藥典》（I部）標(biāo)準(zhǔn)，對其原球莖、叢生芽、瓶苗莖、煉苗莖和鮮條進(jìn)行多糖和甘露糖含量的檢測。結(jié)果表明：（1）軟腳紅桿鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量都達(dá)到了中國藥典的標(biāo)準(zhǔn)。（2）軟腳紅桿鐵皮石斛植株在不同生長階段，多糖和甘露糖含量差異較小。（3）人工組培的石斛不同階段中，都含有豐富的多糖和甘露糖，具有較高的營養(yǎng)價值；原球莖與鮮條的多糖和甘露糖含量差異雖然不大，但與鮮條相比，具有生長時間短、簡單易得等優(yōu)勢。（4）在當(dāng)今野生鐵皮石斛緊缺的情況下，通過組培方式獲得的鐵皮石斛原球莖和叢生芽，可以彌補(bǔ)野生鐵皮石斛資源不足的問題。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；不同階段；多糖；甘露糖

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）20-29-03

Study on the Polysaccharide and Mannose Content of Dendrobium officinale at Different Stages

Wei Huanping et al.

（Science and Technology of Institute，Zhejiang International Studies University，Hangzhou 310012，China）

Abstract：With soft feet red bar Dendrobium officinale as experiment material，referring to the Chinese pharmacopoeia I standard，we test the contents of polysaccharide and mannose of the soft feet red bar Dendrobium officinale protocorm，multiple shoot clumps，Container seedlings stem，refined seedling stem and article fresh. The results show that：（1）polysaccharide and mannose content of soft foot red bar Dendrobium officinale at different stages all reach the standard of Chinese pharmacopoeia.（2）difference among soft foot red bar Dendrobium officinale plant polysaccharide and mannose content in the different stages of growth is small.（3）Dendrobium officinale from tissue culture at different stages all contain abundant polysaccharide and mannose with high nutritional value. Especially，the difference between the content of polysaccharide and mannose in Dendrobium officinale protocorm and fresh is not big. But compared with fresh article，it has the advantages of simple and easy with a short growth time.（4）In today's situation of shortage of wild Dendrobium officinale，protocorm and multiple shoot clumps of Dendrobium officinale from tissue culture can make up for the deficiency of wild Dendrobium officinale resources.

Key words：Dendrobium officinale；Different stages；Polysaccharide；Mannose

1 引言

鐵皮石斛（Dendr0bium 0fficinale Kimura et Migo），俗稱鐵皮楓斗，是被中國藥典收載的5種石斛屬植物之一，為常用名貴中藥[1]，其有效成分為石斛多糖[2]。華允芬、呂洪飛等人比較了石斛屬的多種植物，發(fā)現(xiàn)多糖是鐵皮石斛的特征性成分[3-6]。李彩霞、竹劍平在不同采收期鐵皮石斛多糖含量比較研究中提到，鐵皮石斛采摘以冬季為最佳[7]。甘露糖是目前唯一用于臨床上的糖質(zhì)營養(yǎng)素，廣泛分布于體液和組織中，尤其是在神經(jīng)、皮膚、睪丸、視網(wǎng)膜、肝和腸[8]。龔慶芳等在不同產(chǎn)地鐵皮石斛的品質(zhì)比較研究中提到，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛多糖和甘露糖的含量差異顯著，一般在18.00%～32.35%[9]，其中采自云南、浙江的種質(zhì)在多糖和甘露糖方面有著優(yōu)良的遺傳基礎(chǔ)。

目前對鐵皮石斛不同階段（原球莖、叢生芽、瓶苗莖、煉苗莖、鮮條）多糖和甘露糖的含量的研究并沒有涉及。為此，筆者按照《中國藥典》（I部）的標(biāo)準(zhǔn)中鐵皮石斛多糖和甘露糖含量測定的方法。對實驗室鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量進(jìn)行檢測，以期為鐵皮石斛進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料 本實驗采用的材料為軟腳紅桿鐵皮石斛的原球莖、叢生芽、瓶苗莖、煉苗莖和鮮條。原球莖、叢生芽和瓶苗莖為在1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得；煉苗莖為鐵皮石斛瓶苗煉苗1a后所得；鮮條為鐵皮石斛成品新鮮莖條。endprint

2.2 實驗方法

2.2.1 鐵皮石斛多糖含量檢測 取待檢測粉末約0.3g，加水200mL，加熱回流2h，定容至250mL；精密量取2mL，加入無水乙醇10mL，冷藏1h，離心（轉(zhuǎn)速為4 000r/min）20min，沉淀加80%乙醇洗滌2次，沉淀加熱水溶解，定容至25mL備用。取供試品溶液1mL，加入5%苯酚溶液1mL、硫酸5mL，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，在488nm的波長處測定吸光度。供試品溶液中無水葡萄糖含量為：葡萄糖含量（%）=C×V總×D/（W×V測×106）×100。

式中，C：在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的葡萄糖含量；V總：提取液總體積；V測：測定時取用的體積；D：稀釋倍數(shù)；W：樣品重量（g）。

2.2.2 鐵皮石斛甘露糖檢測方法

2.2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.02mol/L的乙酸銨溶液（20∶80）為流動相；檢測波長為250nm。

2.2.2.2 鐵皮石斛甘露糖含量測定方法 取待檢粉末約0.12g，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄乙醇液，加水100mL，煎煮1h放冷，離心，吸取上清液1mL，置安瓿瓶或頂空瓶中，加3.0mol/L的鹽酸溶液0.5mL，封口，110℃水解1h，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400μL，加0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液200μL與0.3mol/L的氫氧化鈉溶液400μL，70℃水浴反應(yīng)100min。再加0.3mol/L的鹽酸溶液500μL，用三氯甲烷洗滌3次，取上清液10μL，注入液相色譜儀測定。供試品溶液中無水甘露糖含量為：甘露糖含量（%）=CR×V×D/（W×106）×100。

式中，CR：對照品濃度；V：在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的相對甘露糖溶液體積；D：稀釋倍數(shù)；W：樣品重量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵皮石斛不同階段多糖含量的比較

3.1.1 葡萄糖濃度與吸光度的線性關(guān)系考察 以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并得到回歸方程：y=5.708x-0.0160。

3.1.2 鐵皮石斛不同階段多糖含量分析 從圖1可知，鐵皮石斛不同階段多糖含量在26.581 4%～36.459 6%，其中瓶苗莖中多糖的含量最高，為36.459 6%；其次為煉苗莖，多糖含量為29.542 8%；再次為叢生芽和鮮條，多糖含量分別為27.662 1%和26.959 2%；原球莖中多糖含量相對其他階段較低，為26.581 4%。按照《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，鐵皮石斛按干燥品算，含鐵皮石斛多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計不少于25.00%。本次實驗結(jié)果說明，鐵皮石斛不同階段的多糖含量都達(dá)到并超過《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中的要求；同時也說明軟腳紅桿鐵皮石斛植株中的多糖含量在不同生長階段差異較小。

從圖1還可以看出，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖多糖含量略低于其他階段的多糖含量，而固體培養(yǎng)的原球莖多糖含量與鐵皮石斛鮮條多糖含量相當(dāng)。高建平等[10]通過免疫藥理的研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛原球莖與原藥材作用相似，能提高機(jī)體的非特異性免疫功能和細(xì)胞免疫功能。何鐵光等[11]通過對鐵皮石斛不同來源材料的主要藥用成分多糖和氨基酸含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明，鐵皮石斛不同來源材料的多糖含量不同，原球莖與野生品的多糖和總氨基酸含量相近，初步證明以組織培養(yǎng)獲得的鐵皮石斛原球莖代替其野生品是解決鐵皮石斛資源緊缺的有效途徑。因此，對于鐵皮石斛固體培養(yǎng)基不同階段培養(yǎng)物有效成分的研究，值得進(jìn)一步深入探討。

<＼＼Pc10＼文檔 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼2014-20農(nóng)學(xué)通報內(nèi)文＼w294-1.tif> [多糖含量（%）][生長階段]

圖1 鐵皮石斛不同階段多糖含量

3.2 鐵皮石斛不同階段甘露糖含量的比較 在采用內(nèi)標(biāo)法測定鐵皮石斛不同階段甘露糖的含量時，由于內(nèi)標(biāo)物的峰在HPLC圖譜沒有出現(xiàn)而不能計算校正因子，進(jìn)而采用外標(biāo)法測定鐵皮石斛不同階段甘露糖的含量。

3.2.1 甘露糖濃度與峰值的線性關(guān)系考察 以甘露糖濃度為縱坐標(biāo)（Y），以液相色譜峰高為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并得到回歸方程：y=5.8743x+651.73。

3.2.2 鐵皮石斛不同階段甘露糖含量分析 從圖2可知，瓶苗莖中甘露糖的含量最高，為32.414%；鮮條甘露糖含量為28.775%；煉苗莖、叢生芽和原球莖的甘露糖含量分別為24.051%、23.853%和22.946%。按照《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，鐵皮石斛按干燥品算，甘露糖（C6H12O6）含量為13.0%～38.0%。本次試驗結(jié)果表明，鐵皮石斛不同階段甘露糖的含量均達(dá)到《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)；同時說明鐵皮石斛從人工培養(yǎng)的初始階段就已經(jīng)開始了次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，而且也有一定的藥用價值，這也是目前采用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)和提取石斛甘露糖的一個主要依據(jù)。

<＼＼Pc10＼文檔 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼2014-20農(nóng)學(xué)通報內(nèi)文＼w294-2.tif> [甘露糖含量（%）][生長階段]

圖2 鐵皮石斛不同階段甘露糖含量

4 結(jié)論與討論

（1）由本次試驗結(jié)果可知，鐵皮石解不同階段的多糖和甘露糖含量均達(dá)到并明顯高于《中國藥典》（I部）標(biāo)準(zhǔn)，其中瓶苗莖的多糖含量和甘露糖含量都高于鐵皮石斛其他階段的多糖和甘露糖含量。但是鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量有一定的差異，說明軟腳紅桿鐵皮石斛植株中的多糖和甘露糖含量隨取材時間不同，差異還是較大的。

（2）目前鐵皮石斛鮮條主要通過大棚植培的方式得到，前期利用培養(yǎng)基促進(jìn)種子萌發(fā)，經(jīng)過6～9個月的時間獲得組培苗，再經(jīng)過1a的煉苗將鐵皮石斛幼苗移栽到基質(zhì)中，進(jìn)行大棚種植，種植后的第3年秋冬開始收獲石斛鮮條。以植培生長模式代替野生生長是近年來解決珍稀中藥材的有效途徑之一，相對于野生生長，植培具有以下優(yōu)勢：一是易控溫控濕，栽培過程中可以通過人工逐步調(diào)整并解決其生長的基本條件；二是種植過程方便控制、應(yīng)用較廣、產(chǎn)量較高。而植培的劣勢則在于：一是種植時間長，存活率低；二是大棚種植占地面積大，會在一定程度上造成土地資源浪費(fèi)；三是鐵皮石斛對其生長環(huán)境要求苛刻，在種植過程中遇到高溫、冰凍或連續(xù)降雨等極端天氣都有可能對鐵皮石斛的種植造成重大損失。endprint

（3）相對于鮮條，原球莖和叢生芽的獲取更為簡單易得，并且原球莖和叢生芽一旦獲取，我們可以利用其增殖的特點獲取大量的原球莖和叢生芽，并直接從原球莖和叢生芽獲取多糖等有效成分，大大節(jié)省了時間和成本。

（4）與原藥材相比，組培物是否具有同樣的藥用價值是必須考慮的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的鐵皮石斛在不同階段與鐵皮石斛原藥材的多糖和甘露糖含量相當(dāng)，人工組培的鐵皮石斛不同階段都含有豐富的多糖和甘露糖，具有較高的營養(yǎng)價值。鐵皮石斛原球莖與鮮條的多糖含量差異不大，但與鮮條相比，具有生長時間短、簡單易得等特點。在當(dāng)今野生鐵皮石斛緊缺的情況下，通過組培方式獲得的鐵皮石斛可以彌補(bǔ)野生鐵皮石斛資源不足的問題。

參考文獻(xiàn)

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[11]何鐵光，蘇江，王燦琴，等.鐵皮石斛不同來源材料多糖和氨基酸含量的比較[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（1）：322341

（責(zé)編：張宏民）endprint

（3）相對于鮮條，原球莖和叢生芽的獲取更為簡單易得，并且原球莖和叢生芽一旦獲取，我們可以利用其增殖的特點獲取大量的原球莖和叢生芽，并直接從原球莖和叢生芽獲取多糖等有效成分，大大節(jié)省了時間和成本。

（4）與原藥材相比，組培物是否具有同樣的藥用價值是必須考慮的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的鐵皮石斛在不同階段與鐵皮石斛原藥材的多糖和甘露糖含量相當(dāng)，人工組培的鐵皮石斛不同階段都含有豐富的多糖和甘露糖，具有較高的營養(yǎng)價值。鐵皮石斛原球莖與鮮條的多糖含量差異不大，但與鮮條相比，具有生長時間短、簡單易得等特點。在當(dāng)今野生鐵皮石斛緊缺的情況下，通過組培方式獲得的鐵皮石斛可以彌補(bǔ)野生鐵皮石斛資源不足的問題。

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[11]何鐵光，蘇江，王燦琴，等.鐵皮石斛不同來源材料多糖和氨基酸含量的比較[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（1）：322341

（責(zé)編：張宏民）endprint

（3）相對于鮮條，原球莖和叢生芽的獲取更為簡單易得，并且原球莖和叢生芽一旦獲取，我們可以利用其增殖的特點獲取大量的原球莖和叢生芽，并直接從原球莖和叢生芽獲取多糖等有效成分，大大節(jié)省了時間和成本。

（4）與原藥材相比，組培物是否具有同樣的藥用價值是必須考慮的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的鐵皮石斛在不同階段與鐵皮石斛原藥材的多糖和甘露糖含量相當(dāng)，人工組培的鐵皮石斛不同階段都含有豐富的多糖和甘露糖，具有較高的營養(yǎng)價值。鐵皮石斛原球莖與鮮條的多糖含量差異不大，但與鮮條相比，具有生長時間短、簡單易得等特點。在當(dāng)今野生鐵皮石斛緊缺的情況下，通過組培方式獲得的鐵皮石斛可以彌補(bǔ)野生鐵皮石斛資源不足的問題。

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（責(zé)編：張宏民）endprint