高寒草地禾草內(nèi)生細菌B-401的鑒定及生物防治潛力評價

暢濤，王涵琦，楊成德，王穎，楊小利，薛莉，陳秀蓉，徐長林

（草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 甘肅省草業(yè)工程實驗室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量、頻繁使用，造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和增加抗性等問題也越來越嚴重，促使人們不斷地倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)［1-3］。因此，植物病害的生物防治成為了研究熱點，其中尤以植物內(nèi)生菌作為拮抗菌的研究得到眾多學(xué)者的青睞。植物內(nèi)生細菌是指生活在植物的根、莖、葉、花、果實和種子中，但對植物沒有任何實質(zhì)性傷害的細菌［4］。植物內(nèi)生菌與植物能夠互利互惠，究其原因則是由于植物為內(nèi)生細菌提供生長必需的場所和營養(yǎng)等，而內(nèi)生細菌則通過其固氮、溶磷、抑菌及產(chǎn)生生物活性物質(zhì)等生物功能，增強宿主植物的抗病性、抗蟲性、抗旱性及生長競爭能力等［5-6］。學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌對植物的促生作用體現(xiàn)在產(chǎn)IAA來促進植物種子的發(fā)芽和植株幼苗的生長［7-10］、通過聯(lián)合固氮作用進行生物固氮［11-13］和通過解磷或溶磷作用［14-15］使植物能夠盡可能地得到養(yǎng)分的補充［16-17］，從而使植物對生物量進行了積累。同時也有學(xué)者分離得到了具有良好拮抗作用或抑菌作用的內(nèi)生 細 菌。 據(jù) 報 道，已 從 人 參 （Panax ginseng）［18］、棉 花 （Gossypium）［19］、桔 梗 （Platycodon grandiflorum）［20］、向日 葵 （Helianthus annuus）［21］、茄子 （Solanum melongena）［22］、小 麥 （Triticum aestivum）［23］、甜 菜（Beta vulgaris）［24］、水稻（Oryza sativa）［25］和西紅柿（Lycopersicon esculentum）［26］等植物體內(nèi)分離得到內(nèi)生菌可以抑制病原菌對宿主植物進行侵染，從苦參（Sophorae flavescentis）［27］、紅樹（Rhizophoraceae）［28］和珠芽蓼（Polygonum viviparum）［29］等植物體內(nèi)分離得到的內(nèi)生菌可以抑制病原菌對其他植物的侵染。這些內(nèi)生菌主要是通過其核糖體途徑產(chǎn)生某些細菌素和酶類及活性蛋白質(zhì)類來溶解病原菌的細胞壁、抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)或造成畸形，也可以通過非核糖體途徑產(chǎn)生的抗菌肽、脂肽物質(zhì)或抗菌素通過鋅離子通道或其他機制作用于病原菌的細胞膜［30-31］；從而對植物起到防病作用。由此可見，植物內(nèi)生菌具有眾多的生物學(xué)功能值得挖掘，而高寒草地禾草作為優(yōu)質(zhì)牧草具有重要的應(yīng)用價值，由于其內(nèi)生菌的特殊生境，使內(nèi)生菌具有耐低溫等特性。因此，本試驗以高寒草地禾草內(nèi)生菌B-401為研究對象，對其生防能力和其他生物學(xué)功能進行了測定，并進行了鑒定，以期為植物病害的生物防治和生物菌肥的研發(fā)提供菌種資源，也為高寒草地牧草內(nèi)生細菌資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試病原菌：馬鈴薯壞疽病菌（Phoma foveata）、馬鈴薯褐腐病菌（Stysanusstemonitis）、馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）、馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium avenaceum）、馬鈴薯干腐病菌（Fusarium oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、孜然根腐病菌（Fusarium solani）和黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）。供試拮抗菌：B-401，為高寒草地禾草內(nèi)生菌。

以上供試病原菌和供試拮抗菌均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

供試農(nóng)藥：10%氟硅唑（乳油，先正達有限公司）；50%嘧菌酯（懸浮劑，先正達有限公司），均為馬鈴薯壞疽病室內(nèi)毒力測定較好的藥劑［32］。

供試植物及品種：馬鈴薯（Solannm tuberosum）新大坪，為來自于重病田的二級種薯。

1.1.2 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液和PDA培養(yǎng)基，按參考文獻［33］配制。

1.2 B-401生防能力的評價

1.2.1 B-401抑菌能力的測定 采用平板對峙法，指示菌為馬鈴薯壞疽病菌、番茄早疫病菌、馬鈴薯干腐病菌、黃瓜枯萎病菌、孜然根腐病菌、馬鈴薯褐腐病菌、馬鈴薯炭疽病菌、小麥根腐病菌和馬鈴薯枯萎病菌。將活化后的指示菌打成6 mm菌餅置于PDA培養(yǎng)基的中央，與指示菌菌餅相隔2.5 cm的圓周上等距離點接4次B-401，每個處理3次重復(fù)，25℃下黑暗培養(yǎng)。采用十字交叉法測量抑菌直徑并計算抑制率。

1.2.2 B-401穩(wěn)定性測定 將B-401培養(yǎng)于NB平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接（每隔3 d轉(zhuǎn)接1次）10代，后測定其對馬鈴薯壞疽病菌的抑菌能力，并利用SPSS 16.0軟件分析其穩(wěn)定性。

1.2.3 B-401對病原菌菌絲生長的影響 采用平板對峙法于接種后9 d觀察病原菌菌絲形態(tài)并顯微拍照。

1.2.4 貯藏期防效試驗 在甘肅省定西市馬鈴薯貯藏庫進行；選擇來自于重病田的200個均勻一致的薯塊，將B-401的發(fā)酵液（CFU＝7.83×1012）配制成10倍液噴于薯塊表面，用50%嘧菌酯懸浮劑3000倍液和10%氟硅唑乳油5000倍液作藥劑對照，清水為空白對照，于2010年11月15日噴藥，2011年3月23日檢查發(fā)病率，利用防效結(jié)果來評價B-401的防病能力。

1.3 B-401產(chǎn)IAA、溶磷和固氮能力測定

1.3.1 產(chǎn)IAA的定性測定 采用Salkowski比色法，對B-401進行產(chǎn)IAA的測定，3個重復(fù)均變紅為陽性，表示能分泌生長激素IAA，均不變色為陰性，表示不分泌IAA，顏色越深表示分泌數(shù)量越多。

1.3.2 產(chǎn)IAA的定量測定 采用純3-IAA制作標準曲線。配制2組濃度依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 mg／L和25，50，75，100，125，150，175 mg／L的標準液，分別取4 m L，在1組中加入PC比色液4 m L，另一組中加入S2比色液4 m L，黑暗靜置0.5 h，取出后測定其OD530值，制作標準曲線。將培養(yǎng)12 d的B-401的菌懸浮液和空白對照離心10 min，轉(zhuǎn)速為10000 r／min，取上清液4 m L分別加入等量比色液，黑暗靜置30 min后測定OD530值，以加了比色液的空白為對照。用相應(yīng)的標準曲線計算菌株分泌IAA的量。

1.3.3 溶磷能力的定性測定 將B-401點接于PKO（或蒙金娜）平板培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，觀察菌株在培養(yǎng)基平板上形成的溶磷圈，有溶磷圈的記為陽性。

1.3.4 固氮能力的定性測定 將B-401用點接法接種在阿須貝培養(yǎng)基上，同時將200μL B-401菌懸液接入阿須貝液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，以無菌水接種做對照，28℃培養(yǎng)，在第3，5，7天目測其生長狀況，在無氮培養(yǎng)基上明顯生長者和能使液體培養(yǎng)基變渾濁的記為陽性，繼代培養(yǎng)3代仍為陽性，則認為具有固氮能力。

1.4 B-401的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征 B-401活化后分別接種于NA平板、斜面及NB培養(yǎng)液，于28℃下培養(yǎng)5 d后觀察培養(yǎng)性狀。將B-401在NA平板上活化培養(yǎng)18～24 h后進行革蘭氏染色和芽孢染色，觀察菌體和測量菌體的大?。?0個），并顯微拍照。

1.4.2 生理生化測定 具體方法參照《伯杰細菌鑒定手冊》［34］和《常見系統(tǒng)細菌鑒定手冊》［35］進行。

1.4.3 16S r DNA序列分析 按上海生工提供的試劑盒（Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，批號：82561202）提取DNA并檢測，對具有特異性DNA條帶的保存于－20℃的冰箱備用。

使用引物1（5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′）和引物2（5′-CGGGATCCT ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性10 s，54℃退火20 s，68℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后在68℃下延伸7 min，終止反應(yīng)。反應(yīng)體系：10×buffer（含 MgCl2）：5μL，d NTP（2.5 mmol／L）：1μL。primer 1（10μmol／L）：1μL，primer 2（10μmol／L）：1μL，Taq poly-merse（2 U／μL）：0.4μL，Target DNA（10 ng／μL）：1μL，dd H2O：40.6μL，總體積為50μL。經(jīng)檢測，將具特異性條帶的擴增產(chǎn)物送上海生工測序，所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的序列進行同源性比較，采用Clustal 1.8軟件和Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定B-401的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-401的生防能力評價

2.1.1 B-401抑菌譜的測定 禾草內(nèi)生菌B-401對馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯褐腐病菌、馬鈴薯炭疽病菌、小麥根腐病菌和番茄早疫病菌的抑制效果明顯，分別達74.45%，71.97%，70.05%，64.65%和60.25%；對孜然根腐病菌、馬鈴干腐病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑制效果在45%以上；對黃瓜枯萎病菌具有一定的抑制效果（表1，圖1）。表明B-401對馬鈴薯上多種病原菌及其他病原菌都具有抑制作用，可以一菌多防。

表1 B-401的抑菌能力測定Table 1 The inhibition rate of B-401 against pathogenic fungi

2.1.2 B-401穩(wěn)定性測定 將拮抗菌B-401的10代菌與馬鈴薯壞疽菌對峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，B-401原菌株與其繼代（10代）培養(yǎng)菌之間抑菌效果差異不顯著（P＞0.05），說明該菌株的抑菌效果穩(wěn)定（表2）。

2.1.3 B-401對多種病原菌菌絲生長的影響 馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯褐腐病菌菌絲被B-401抑制后，有明顯的畸形變化，菌絲斷裂、細胞壁崩解、原生質(zhì)外泄，菌絲產(chǎn)生泡囊、扭曲、變形，導(dǎo)致其原生質(zhì)凝聚和末端膨大（圖2），說明B-401可以通過使菌絲發(fā)生畸形變化來影響病菌菌絲生長。

2.1.4 貯藏期防治試驗 清水對照的發(fā)病率為38.60%，噴霧B-401之后的發(fā)病率為18.26%，其防效為52.67%，比5000倍液10%氟硅唑的防效低34.66%，但和3000倍液嘧菌酯的差異不大（表3），說明B-401具有較好防治效果。

2.2 B-401生物學(xué)功能測定

2.2.1 IAA的定性測定 結(jié)果表明，不含色氨酸的培養(yǎng)液顏色變化較為明顯，含100 mg／L色氨酸的培養(yǎng)液在比色反應(yīng)中呈紅色，與對照差異明顯（圖3），說明在King培養(yǎng)基中加入100 mg／L的色氨酸能夠增加B-401合成IAA的量。

圖1 B-401與9種病原菌的對峙照片F(xiàn)ig.1 B-401 confront nine kinds of pathogenic fungi photosA：小麥根腐病菌B.sorokiniana；B：黃瓜枯萎病菌F.solani；C：孜然根腐病菌F.solani；D：馬鈴薯炭疽病菌C.coccodes；E：馬鈴薯枯萎病菌F.avenaceum；F：馬鈴薯干腐病菌F.oxysporum；G：番茄早疫病菌A.solani；H：馬鈴薯褐腐病菌S.stemonitis；I：馬鈴薯壞疽病菌P.foveata.

2.2.2 IAA的定量測定 B-401經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)12 d后，用PC和S2兩種比色液測定OD530值，結(jié)果表明，不含色氨酸的King培養(yǎng)液OD530值為PC＝0.089和S2＝0.073，通過標準曲線分泌IAA的濃度為2.6 mg／L；含100 mg／L色氨酸的King培養(yǎng)液OD530值為PC＝0.132和S2＝0.077，其分泌IAA的濃度為3.42 mg／L，IAA的合成量與前者相差較大，說明色氨酸的存在能較明顯增加B-401合成IAA的量。可認為外源色氨酸是B-401合成IAA必須前體物質(zhì)。

2.2.3 溶磷能力的定性測定 結(jié)果表明，B-401在PKO無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜培養(yǎng)基上（有機磷培養(yǎng)基）分別培養(yǎng)5 d之后，沒有溶磷圈出現(xiàn)，說明B-401沒有溶解有機磷和無機磷的能力。

表2 繼代培養(yǎng)菌株對壞疽病菌的抑制結(jié)果Table 2 The inhibition rate of subculture bacteria against P.foveata

圖2 B-401對病原菌菌絲的影響Fig.2 Influence of B-401 against hyphoae of pathogenic fungiA：炭疽處理Inhibit hyphoae of C.coccodes；B：炭疽對照Normal hyphoae of C.coccodes；C束梗孢處理Inhibit hyphoae of S.stemonitis；D：束梗孢對照Normal hyphoae of S.stemonitis；E：壞疽病處理Inhibit hyphoae of P.foveata；F：壞疽病對照Normal hyphoae of P.foveata.

表3 B-401的防治效果Table 3 The control efficacy of B-401 against potato gangrene

2.2.4 固氮能力的定性測定 結(jié)果表明，B-401點接于阿須貝培養(yǎng)基后，在第3天時形成菌落，第5天時形成明顯的菌落；接種于液體培養(yǎng)基后，5 d后培養(yǎng)液變渾濁。連續(xù)培養(yǎng)3代后，B-401在第5天時同樣能形成菌落并能使培養(yǎng)液變渾濁，說明B-401具有固氮能力。

2.3 B-401的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 經(jīng)革蘭氏染色，B-401為G＋（圖4A），其芽孢中生（圖4B），菌體大小為2.8～6.0μm×0.8～1.4μm。其在平板培養(yǎng)基上菌落大小約為0.4 cm，中間凸起如凸鏡狀，邊緣平整，黏度較大，硬度小且不透明，呈乳黃色。斜面培養(yǎng)基上，菌苔豐富，光滑，顏色呈乳黃色，邊緣呈刺毛狀。液體培養(yǎng)基中，不形成菌膜，沉淀少，無氣泡，菌液顏色為培養(yǎng)液顏色。

2.3.2 生理生化測定 B-401具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力，好氧生長，能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸，V-P測定為陽性；能夠水解酪朊、淀粉、明膠、酪氨酸；能夠利用丙酸鹽和檸檬酸鹽；不能產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶和卵磷脂酶，但能產(chǎn)生接觸酶；能夠形成吲哚，表明該菌對植物具有促生作用；可以在p H 6.8和5.7的營養(yǎng)肉湯中生長，生長時可以不需要NaCl和KCl；能夠在10%的氯化鈉溶液中生長；生長溫度在5～50℃。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化測定結(jié)果，初步認為B-401屬于芽孢桿菌屬，種待定。2.3.3 16S r DNA基因鑒定 提取B-401的基因組DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，條帶清楚，且無非特異性條帶，滿足16S r DNA的要求，可以進行PCR擴增。

16S rDNA的擴增和測序：用16S r DNA引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1500 bp處有一明亮的PCR特異性條帶（圖5）。將PCR產(chǎn)物送往上海生工測序，所得B-401的16S rDNA基因序列堿基長度為1475 bp。

B-401的16S r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析：用BLAST軟件經(jīng)同源性比較，結(jié)果表明，B-401與已報道的Bacillus atrophaeus（JQ917920.1），Bacillus tequilensis （JF411288.1），Bacillus subtilis （AB542912.1），Bacillus pumilus（EU379272.1）和Bacillus atrophaeus（HF545325.1）等多株芽孢桿菌屬的種相似性在99%以上。將相似序列用Clustal 1.8軟件進行多重序列比較后，再用Mega 4.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，B-401與B.atrophaeus同源性最近（圖6），再結(jié)合菌體形態(tài)，生理生化特征將B-401確定為芽孢桿菌屬的萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。

圖3 B-401比色反應(yīng)Fig.3 B-401 colorimetric reaction

圖4 B-401的革蘭氏染色和芽孢染色Fig.4 Gram staining（A），spore staining（B）of B-401

圖5 B-401的16S r DNA電泳圖Fig.5 16S r DNA PCR electrophoresis map of B-401

3 結(jié)論與討論

圖6 B-401的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 16S rDNA phylogenetic tree of B-401

李振東等［29］分離得到的以色氨酸為合成IAA途徑的內(nèi)生菌Z5在外源色氨酸誘導(dǎo)時分泌IAA的濃度為68.62 mg／L，是不加色氨酸產(chǎn)IAA濃度的13.4倍，B-401無外源色氨酸誘導(dǎo)時分泌IAA的濃度為2.60 mg／L，外源色氨酸誘導(dǎo)分泌IAA的濃度為3.42 mg／L，二者對比較為明顯；說明B-401能夠產(chǎn)IAA，且以色氨酸為前體物合成IAA的途徑是B-401合成IAA多種途徑［36］的其中一條。Forchet

ti等［21］和Zhang等［37］認為生物菌肥應(yīng)針對于具有固氮和分泌IAA能力的植物內(nèi)生菌進行開發(fā)，而本研究結(jié)果表明，B-401能夠在阿須貝培養(yǎng)基上生長，且能使無氮培養(yǎng)液變渾濁，連續(xù)培養(yǎng)之后，此結(jié)果差異不顯著，說明B-401不僅具有分泌IAA的能力還具有固氮的能力，證明B-401對植物具有促生作用，但對其固氮酶活性和對盆栽或大田作物的促生作用還需進一步研究。

近年來，學(xué)者對于拮抗菌的抑菌機制進行了深入的研究，明確了拮抗菌可以通過分泌幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶和胞外蛋白酶等酶類物質(zhì)及以抗菌肽為主的多肽物質(zhì)來抑制病原菌的生長［30］。甘肅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是農(nóng)民較為重要的經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)支柱，但據(jù)報道，甘肅近年來的馬鈴薯發(fā)病嚴重，爛薯率較高，其中尤以檢疫病害馬鈴薯壞疽病最為嚴重［32］。本試驗研究表明，B-401對馬鈴薯壞疽病菌、炭疽病和褐腐病具有較好的抑制作用，抑制率分別達74.45%，70.05%和71.97%，且能使以上病原菌的菌絲斷裂、扭曲和變形，并使病原菌的細胞壁崩解，但不清楚是其分泌物中的哪一種抑菌物質(zhì)在起作用，還需要進一步研究其抑菌機理。經(jīng)測定，B-401的室內(nèi)拮抗能力較好且其10代穩(wěn)定性良好。由于馬鈴薯塊莖貯藏期長，于貯藏庫中不易進行化學(xué)防治，而B-401在貯藏期對馬鈴薯塊莖進行噴霧處理后，其可以定殖在馬鈴薯塊莖表面，且在貯藏期的防效能夠達到52.67%，具有不污染環(huán)境和不造成農(nóng)藥殘留，還能較好地防治馬鈴薯貯藏期的主要病害，克服了化學(xué)防治的缺點。但對B-401的發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及在大田中使用的穩(wěn)定性和防治效果等還需要進一步研究。

高寒草地禾草內(nèi)生細菌B-401為G＋，其芽孢中生，菌體大小為2.8～6.0μm×0.8～1.4μm。結(jié)合生理生化特征及16S r DNA序列分析將其鑒定為B.atrophaeus。B-401能夠產(chǎn)生IAA，具有固氮能力，無溶磷能力，且抑菌譜較廣，說明該菌株具有防病促生的作用，與何紅等［38］認為植物內(nèi)生菌具有植物保護和促生的生物學(xué)作用觀點一致，因此B-401不僅能用于生物農(nóng)藥的開發(fā)，還能用于微生物肥料的研發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。