塔克拉瑪干沙漠生物結(jié)皮中幾種藻類的系統(tǒng)發(fā)育分析

王丹，龔春霞，茍亞峰，周路，朱軍保，高劍峰

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年中國(guó)北方沙漠化土地達(dá)37.59萬(wàn)km2，其中輕度沙漠化土地占33.80%，中度沙漠化土地占22.84%，重度沙漠化土地占22.16%，嚴(yán)重沙漠化土地面積占21.21%，沙漠化已成為人類所面臨的嚴(yán)重的環(huán)境問題之一［1］。在沙漠化修復(fù)的研究中，現(xiàn)階段固沙的主要生物技術(shù)方法為防風(fēng)林及草帶的建立［2］，與此同時(shí)微生物在沙漠化治理的研究中也得到了初步探討。潘惠霞等［3］在新疆古爾班通古特沙漠的結(jié)皮中分離到了一株寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，該菌株可產(chǎn)生大量胞外粘多糖，將該菌株的培養(yǎng)液噴灑到流沙表面后，可形成6 mm厚的粘合性的沙層。鄒碧瑩和張?jiān)恚?］在地中海沙漠化生態(tài)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，植物種子萌發(fā)期加入?yún)仓婢c固氮根瘤菌不僅能協(xié)助植被在沙漠化區(qū)域的建立，同時(shí)還可以增加土壤肥力與質(zhì)量。盡管沙漠化區(qū)域微生物的研究展示了一定的應(yīng)用潛力，而相對(duì)于沙漠化區(qū)域的大面積分布，對(duì)沙漠化生態(tài)系統(tǒng)中微生物的研究還處于起步階段［5-8］。

生物結(jié)皮通常是由各種光合及非光合生物組成的，包括藍(lán)藻、地衣、綠藻、苔蘚、真菌及一些微小原生動(dòng)物。這些棲居在土壤表層的生物往往生活在極端惡劣的氣候環(huán)境條件下。例如位于新疆準(zhǔn)噶爾盆地腹地的古爾班通古特沙漠年平均降水量不超過150 mm，在沙漠腹地僅有70～100 mm，年均溫為6～10℃，極端溫度為40℃以上，均有結(jié)皮生物［9-10］。Evans和Ratledge［11］一致認(rèn)為結(jié)皮生物群落在沙漠中對(duì)固定土壤和養(yǎng)分循環(huán)發(fā)揮著重要的作用。

目前，李芳芳等［12］用18S r RNA基因?qū)艩柊嗤ü盘厣衬蛛x的綠藻進(jìn)行了系統(tǒng)學(xué)研究，趙建成等［9］對(duì)該沙漠生物結(jié)皮進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該沙漠中有很多常見的單細(xì)胞綠藻，例如小球藻、膠球藻、鏈帶藻和衣藻等。Lewis和Lewis［13］的研究結(jié)果表明在結(jié)皮生物中的綠藻主要包含三大類群，綠藻綱、共球藻綱和輪藻綱。

塔克拉瑪干沙漠是世界第二大流動(dòng)沙漠，研究其生物結(jié)皮及微生物組成顯得尤為重要，因?yàn)樯衬瘒?yán)重威脅塔克拉瑪干沙漠南緣和北緣的綠洲農(nóng)業(yè)發(fā)展。圍繞塔克拉瑪干沙漠生態(tài)環(huán)境已經(jīng)有很多學(xué)者進(jìn)行了有關(guān)研究報(bào)道，但主要集中在沙危害分異規(guī)律、沙漠腹地人工綠地、沙漠自然植被光合特性、耗水量、根生態(tài)以及土壤種子庫(kù)的研究等方面［2-7］，而關(guān)于微生物的研究?jī)H見關(guān)于其數(shù)量在結(jié)皮中的分布研究［13］，特別是結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)特征的研究更為少見。張丙昌等［14］對(duì)古爾班通古特沙漠中綠藻的區(qū)系組成、生態(tài)分布特點(diǎn)和結(jié)皮不同發(fā)育階段綠藻種類組成的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，李芳芳等［12］運(yùn)用分子生物學(xué)18S r RNA基因?qū)艩柊嗤ü盘厣衬蛛x的綠藻進(jìn)行了系統(tǒng)學(xué)研究。本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)塔克拉瑪干沙漠生物結(jié)皮中幾種藻類進(jìn)行研究，擬建立一個(gè)適合分離純化和鑒定沙漠微藻的方法，為后續(xù)塔克拉瑪干沙漠微藻的研究工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 自然概況

中國(guó)新疆塔里木盆地中央的塔克拉瑪干沙漠，氣候?qū)儆诘湫偷拇箨懶耘瘻貛Ц珊祷哪畾夂颍昶骄鶜鉁?～11.2℃，最熱月份8月的極端最高氣溫為43.2℃，最冷月份1月的極端最低氣溫為－19.3℃，年降水量60～80 mm，年內(nèi)分配不均衡，多集中在春、夏兩季，且年際變率大。沿著古爾班通古特沙漠公路附近采集沙樣（N 37°36.732′～N 40°47.377′，E 80°23.442′～E 84°17.638′），多流動(dòng)沙丘上基本無(wú)植物生長(zhǎng)，偶見沙米（Agriophyllum squarrosum）及花棒（Hedysarum scoparium），蓋度小于1%。

1.2 采樣

采樣時(shí)，用無(wú)藻鏟采集沙樣表層及其以下至10 cm深，收集于無(wú)菌密封袋。每次采樣后用70%酒精擦拭采樣工具，以防交叉污染。

本實(shí)驗(yàn)藻種均分離自塔克拉瑪干沙漠采集沙樣的混合培養(yǎng)藻液。表1列出了2011年11月19日從塔克拉瑪干沙漠分離的6株微藻的沙樣采集地點(diǎn)。

1.3 沙漠微藻的混合培養(yǎng)、分離與純化

1.3.1 混合培養(yǎng) 稱取5 g采集的沙樣于滅菌的裝有30 m L培養(yǎng)液的50 m L三角瓶中，充分混勻，置于光照培養(yǎng)箱，光照強(qiáng)度為2500 lx，光暗周期為12 h／12 h，溫度為23℃的條件下培養(yǎng)1～2周，隨時(shí)觀察雜菌污染情況，如雜菌過多，則終止培養(yǎng)。

1.3.2 分離與純化 采用平板法和96孔板有限稀釋法分離純化上述混合培養(yǎng)的藻液。分離過程中定期鏡檢培養(yǎng)藻液，直到1000倍鏡下觀察的微藻形態(tài)一致即純化成功，然后將已純化成功的微藻進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。

表1 塔克拉瑪干沙漠采樣地的分布概況Table 1 Sampling locations of algae strains used in present study in the Taklimakan desert

1.4 分離純化微藻的分子鑒定

1.4.1 DNA提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD680的藻液400～600 m L，3000 r／min離心8 min，收集沉淀，用液氮研磨至粉末置于1.5 m L離心管中；用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取微藻基因組DNA。

1.4.2 序列擴(kuò)增及測(cè)序 用于擴(kuò)增綠藻的5.8S-ITS的引物序列為：上游5′-TTCTTAGTTGGTGGGTTGCCT-3′，下游5′-TTTCATCTTTCCCTCACGGTA-3′［15］。

用于擴(kuò)增真核綠藻的18S r DNA的引物序列為：上游5′-ACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3′，下游5′-ACCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCC-3′［16］。

用于擴(kuò)增16S r DNA的原核生物通用引物序列為：上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′［17］。

PCR反應(yīng)體系為20μL，dd H2O：12.4μL，Buffer：2.0μL，MgCl2：1.2μL，d NTP：1.2μL，引物1：1.0μL，引物2：1.0μL，DNA模板：1.0μL，Taq酶：0.2μL。PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，擴(kuò)增結(jié)果用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將PCR產(chǎn)物用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后再用p MD18-T載體連接試劑盒（Ta KaRa）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)得序列提交至GeneBank，利用Blast搜索引擎中的nucleotide blast獲得所測(cè)序列的同源序列，用Gene-Doc軟件進(jìn)行多序列對(duì)位分析，MEGA 4.1軟件進(jìn)行序列分析，并采用鄰接法 （NJ）建樹，Kimu-ra 2-parameter計(jì)算遺傳距離值，重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株藻種的形態(tài)學(xué)特征

從塔克拉瑪干沙漠6個(gè)采樣地分離得到6株微藻。在光學(xué)顯微鏡100倍油鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。其特征為TLD2A1單細(xì)胞球形，色素體杯狀，占細(xì)胞的一半或稍多，細(xì)胞直徑3～6μm。TLD2B細(xì)胞呈橢圓或卵形，兩端略為變尖，眼點(diǎn)位于細(xì)胞中部，細(xì)胞寬3～5μm，長(zhǎng)7～9μm。TLD5A1植物體呈中空而薄的裂片狀，生長(zhǎng)后期漂浮，呈褐色或深褐色，藻絲呈強(qiáng)烈卷曲或有時(shí)平行排列，細(xì)胞呈球形或近球形。TLD6B單細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞聚在一起，呈球形，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞直徑5～10μm。TLD7A-2游動(dòng)的單細(xì)胞，細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞寬8～12μm，長(zhǎng)10～13μm。TLD7B-5單細(xì)胞，形態(tài)多呈月牙狀，細(xì)胞長(zhǎng)3～9μm，寬2～4μm，兩頂端直線距離3～7μm。

根據(jù)其形態(tài)特征參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行檢索分類，經(jīng)鑒定表明TLD2A1、TLD6B的初步分類地位為綠藻門、綠藻綱、綠球藻目；TLD2B、TLD7A-2初步分類為綠藻門，綠藻綱，團(tuán)藻目；TLD7B-5初步分類為綠藻門、綠藻綱；TLD5A-1初步分類為藍(lán)藻門（經(jīng)石河子大學(xué)高劍峰教授加以鑒定）。

2.2 序列分析

2.2.1 5株綠藻的序列分析 依據(jù)形態(tài)觀察TLD2A1、TLD2B、TLD6B、TLD7A-2和TLD7B-5均為綠藻門，用18S r DNA保守區(qū)引物分別擴(kuò)增了5株微藻的18S r DNA序列，其長(zhǎng)度分別為1767，1759，1766，1764和2657 bp；TLD2A1、TLD7A-2、TLD7B-5三株藻5.8S r DNA-ITS的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為1539，1437，2428 bp，與NCBI已知的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，根據(jù)比對(duì)同源性相近藻的18S r DNA全序列及普通小球藻（Chlorella vulgaris）（AB237642）r DNA序列，確定5.8S r DNA-ITS（包括ITS1、ITS2和5.8S r DNA區(qū)域）序列長(zhǎng)度分別為650，564和672 bp。數(shù)據(jù)提交至GenBank。其中TLD7B-5的18S核糖體r DNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度比另外2株綠藻長(zhǎng)很多，將其在Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有2個(gè)內(nèi)含子，去除內(nèi)含子后與各序列于NCBI Blastn比對(duì)并進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)庫(kù)同源性分析（表2）。TLD2A1、TLD2B、TLD6B、TLD7A-2、TLD7B-5的18S r DNA序列G＋C含量分別為49.7%，49.5%，49.8%，48.0%和48.2%。

表2 6株沙漠微藻核酸序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)分析Table 2 Blast of the nucleotide sequence of 6 desert algae strains

2.2.2 16S r DNA序列分析 依據(jù)形態(tài)觀察TLD5A1為藍(lán)藻門，用16S r DNA引物序列擴(kuò)增了TLD5A1的16S r DNA序列，長(zhǎng)度為1481 bp。數(shù)據(jù)提交至GenBank，將測(cè)得序列與GenBank中7個(gè)序列及外類群集胞藻的16S r RNA基因序列進(jìn)行排列對(duì)齊，排序后共有1443 bp位點(diǎn)，比較了TLD5A1的16S rDNA和GenBank中7個(gè)序列的堿基組成發(fā)現(xiàn)，TLD5A1的GC含量為54.7%，其他7個(gè)序列的G＋C含量均在53.9%～55.0%之間。其序列于NCBI Blastn比對(duì)并進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)庫(kù)同源性分析（表2）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 綠藻系統(tǒng)發(fā)育分析 將分離藻株中5株綠藻的18S r DNA和其中3株的5.8S r DNA-ITS序列于Blast同源比對(duì)分析，下載與其同源性相對(duì)較高的序列5～9個(gè)，全部輸入GeneDoc軟件，比對(duì)后將序列開始和結(jié)尾長(zhǎng)短不一的片段刪減整齊，比對(duì)結(jié)果輸入到MEGA 4.1軟件中，選取的核苷酸置換模型為Kimura雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter），自展支持分析重復(fù)1000次。得到的18S r DNA和5.8S r DNA的NJ樹（圖1和圖2）。

圖1 基于18S r DNA基因序列的鄰接樹Fig.1 NJ tree based on sequences of 18S rDNA gene節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表1000次重復(fù)自展分析所得到支持率（%）The numbers at the nodes represent bootstrap support of 1000 replicates（%）.下同The same below.

5株綠藻的18S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，實(shí)驗(yàn)所分離的5株綠藻可以分別在3個(gè)大分支內(nèi)，其中1個(gè)類群可歸于小球藻科，以TLD2A1、TLD6B為代表，它們的18S r DNA序列與普通小球藻藻株的相似性最高，為99.89%。TLD2B和TLD7A-2分別與衣藻科的9個(gè)物種聚為一大分支，其中TLD2B與咸胞藻（Brachiomonas sp.）聚為一支相似性為98.16%，自展支持率為91%，TLD7A-2與Chlamydomonas sp聚為一支相似性為97.65%，自展支持率為72%，TLD7B-5的18S r DNA 與綠藻門，綠藻綱環(huán)藻目的Selenastraceae、柵藻科（Scenedesmaceae）、環(huán)藻目Sphaeropleales三科物種聚為一支，其中與綠球藻（Tetranephris brasiliensis）同源性最高為98.86%。

TLD2A1、TLD7A-2、TLD7B-5三株綠藻的5.8S r DNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合他們的18S r DNA數(shù)據(jù)表明，TLD2A1與Chlorella sp.為同一屬，TLD7A-2的5.8S r DNA-ITS與萊茵衣藻（Lobochlamys segnis）、衣藻（Chlamydomonas inflexa）、南極衣藻（Chlamy domonas sp.）聚為一支，與南極衣藻相似性最高為72.94%。TLD7B-5的5.8S r DNA-ITS與環(huán)藻目科（Selenastraceae）的月牙藻（Pseudokirchneriella sp.）聚為一支，相似性最高，為87.31%，自展支持率低于50%，這與其18S r DNA數(shù)據(jù)有些差異。

圖2 基于5.8S r DNA-ITS基因序列的鄰接樹Fig.2 NJ tree based on sequences of 5.8S rDNA-ITSgene

2.3.2 1株藍(lán)藻系統(tǒng)發(fā)育分析 將TLD5A1的16S r DNA序列于Blast同源比對(duì)分析，下載與其同源性相對(duì)較高的序列7個(gè)，全部輸入GeneDoc軟件，比對(duì)后將序列開始和結(jié)尾長(zhǎng)短不一的片段刪減整齊，比對(duì)結(jié)果輸入到MEGA 4.1軟件中，選取的核苷酸置換模型為Kimura雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter），自展支持分析重復(fù)1000次，得到的16S r DNA的NJ樹見圖3。

圖3 基于16S r DNA-ITS基因序列的鄰接樹Fig.3 NJ tree based on sequences of 16S r DNA-ITSgene

它的16S r DNA序列與念珠藻科的物種聚為一支，其中與念珠藻屬的藍(lán)藻（Nostoc ellipsosporum）相似性最高，為97%，有37個(gè)堿基不同，NJ樹也與其聚為一支，自展支持率為60%。

3 討論

3.1 鑒定

塔克拉瑪干沙漠的藻類研究相關(guān)報(bào)道較少見，目前國(guó)內(nèi)對(duì)藻類結(jié)皮的研究，主要為形態(tài)學(xué)鑒定，這種方法費(fèi)時(shí)并且需要鑒定者有豐富的分類經(jīng)驗(yàn)，很多形態(tài)學(xué)特征會(huì)隨著生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)階段的改變而變化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，5.8S r DNA、18S r DNA、16S r DNA等序列分析方法在物種鑒定中已經(jīng)普遍使用［15-17］。本研究先采用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定，再結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對(duì)分離藻株進(jìn)行分析，這樣較大程度地保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究從塔克拉瑪干沙漠通過形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定分離得到了5株綠藻，其中3株隸屬于綠藻綱，2株為共球藻綱。在沙漠中的綠藻主要包含三大類群，綠藻綱、共球藻綱和輪藻綱［19-20］，因此推斷這些沙漠綠藻均起源于淡水藻，當(dāng)然這有待更多實(shí)驗(yàn)研究的驗(yàn)證。

3.2 結(jié)論

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，97%～99%全序列相似的可判定為一個(gè)屬。形態(tài)學(xué)和18S r DNA數(shù)據(jù)結(jié)合分析表明，實(shí)驗(yàn)分離的5株綠藻均鑒定到科，分別為衣藻科（TLD2B，TLD7A-2）、小球藻科（TLD2A1、TLD6B）、環(huán)藻科（TLD7B-5），5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)化速度快，變異豐富，適合種內(nèi)鑒定，TLD2A1的5.8S r DNA與18S r DNA數(shù)據(jù)結(jié)果一致，與小球藻親緣關(guān)系最近，TLD7B-5的5.8S r DNA-ITS與18S結(jié)果有一定差異，可能是因?yàn)镚enBank中物種序列不全所造成的。

5株綠藻的18S r DNA序列GC含量為48.0%～49.8%，包含在與它們同源的30個(gè)類群GC含量之間（48.0%～50.0%），差異為1.8%。同時(shí)對(duì)3株綠藻的5.8S r DNA-ITS序列的堿基構(gòu)成進(jìn)行分析，TLD2A1同其小球藻屬的物種比對(duì)發(fā)現(xiàn)GC含量均在57.1%～58.4%之間，差異不足1.4%。TLD7A-2的GC含量為44.2%，遠(yuǎn)小于其他4個(gè)相近物種的GC含量（50.2%～52.0%），可能和TLD7B-5類似，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中物種序列不完全所導(dǎo)致的。發(fā)現(xiàn)18S r DNA序列GC含量沒有明顯差異，而5.8S r DNA-ITS序列不同科屬之間的GC含量差異明顯，并且同一科屬其GC含量也可能有所不同（如TLD7A-2）。TLD5A1的GC含量為54.7%，Blast比對(duì)后與其同源性較高的其他7個(gè)序列的GC含量均在53.9%～55.0%之間，這與Li和Watanabe［21］檢測(cè)了50株純培養(yǎng)的魚腥藻的GC含量，并比較了依據(jù)GC含量分類與應(yīng)用形態(tài)學(xué)、生理和生化分類的結(jié)果，得出相同物種的GC含量是相近的，但是具有相同GC含量的物種卻不一定有較近的親緣關(guān)系結(jié)果一致。