產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及初步鑒定

王建興 趙瓊洲 馮會(huì)家

(湖北水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心黃石分中心，湖北 黃石 435000)

甲殼素，又稱幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)、聚乙酰氨基葡萄糖等，通過β-D-(1,4)-糖苷鍵連接而成的線性聚合物，廣泛存在于甲殼綱動(dòng)物、軟體動(dòng)物、昆蟲、真菌以及高等植物中，自然界每年生成的甲殼素將近100億噸，是地球上含量?jī)H次于纖維素的天然高分子化合物、數(shù)量最大的含氮有機(jī)化合物。

甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物是殼聚糖。一般而言，N-乙酰基脫去55%以上，或者說(shuō)能在1%乙酸或1%鹽酸中溶解1%的脫乙酰甲殼素，稱之為殼聚糖。作為工業(yè)品的殼聚糖，N-脫乙酰度在70%以上。殼聚糖一方面來(lái)自甲殼素，另一方面在自然界中也大量存在，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的天然堿性多糖。殼聚糖呈白色或灰白色，平均分子量在1.2×105左右，不溶于水、堿性溶液或普通有機(jī)溶劑，但可溶于鹽酸、硝酸、甲酸、乙酸等稀酸。

不同分子量的殼聚糖的性質(zhì)各異，分子量低于10kDa的水溶性殼聚糖，具有降血糖、降血脂、抗真菌、抗細(xì)菌以及抑制腫瘤生長(zhǎng)等功效，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的發(fā)展前景。目前制備低分子量殼聚糖的方法，主要有化學(xué)法和酶解法。其中，酶解法以條件溫和、產(chǎn)率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)。殼聚糖酶(Chitosanase)是一種專一性降解殼聚糖的水解酶，能特異性作用于殼聚糖的β-D-(1,4)-糖苷鍵，得到聚合度低至2～7的水溶性殼寡糖。

甲殼素廣泛分布于湖泊中，也是湖水中化學(xué)耗氧量的重要來(lái)源。篩選、馴化產(chǎn)殼聚糖酶菌株，經(jīng)過培養(yǎng)后，附著在生物骨料中投入水體中，可以提高水體凈化能力。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員從自然界中分離到Beauveria bassiana，Pseudomonas sp.，Mitsuaria chitosanitabida，Bacillus sp.等產(chǎn)殼聚糖酶菌株，并對(duì)其分類學(xué)、發(fā)酵工藝以及酶學(xué)性質(zhì)，展開了一系列研究。本文篩選得到7株產(chǎn)殼聚糖酶菌株，并對(duì)其中的5株菌，進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及培養(yǎng)基

殼聚糖膠體溶液：1g殼聚糖， 加入30mL 0.2mol/L的 HCl，75℃水浴15h～20h至完全溶解，用 1mol/L的NaOH緩慢調(diào)pH5.0，加蒸餾水定容，配成一定濃度的溶液。

富集培養(yǎng)液：2%的膠體殼聚糖溶液，加入0.2%的K2HPO4，121℃、滅菌30min。

殼聚糖固體培養(yǎng)基：

甲液:1%殼聚糖膠體溶液；

乙液:K2HPO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO40.14%，NaCl 0.1%，CaCl20.02%，酵母粉 0.1%，瓊脂 4%，pH7.0；

殼聚糖固體培養(yǎng)基：甲、乙液分別于121℃條件下滅菌30分鐘后，等體積混合倒平板。

1.2 取樣

分別從山上、菜地、池塘污泥、垃圾堆附近等地采集了7份土壤樣品和1份來(lái)自青山湖的水樣，樣品取回后置4℃冰箱冷藏。

本報(bào)訊 日前，財(cái)政部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、中國(guó)銀保監(jiān)會(huì)共同印發(fā)《關(guān)于開展三大糧食作物完全成本保險(xiǎn)和收入保險(xiǎn)試點(diǎn)工作的通知》，推動(dòng)保障水平在目前種子、化肥等物化成本和地租成本的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加勞動(dòng)力成本至覆蓋全部農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本或直接開展收入保險(xiǎn)，切實(shí)促進(jìn)農(nóng)業(yè)保險(xiǎn)轉(zhuǎn)型升級(jí)，保障農(nóng)戶種糧積極性。試點(diǎn)保險(xiǎn)標(biāo)的為關(guān)系國(guó)計(jì)民生和糧食安全的水稻、小麥、玉米三大主糧作物。

1.3 富集培養(yǎng)

取適量土壤樣品，用無(wú)菌水稀釋成懸濁液，取0.5mL(水樣直接取)加至10mL富集培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)3d～5d。

1.4 初篩

采用梯度稀釋法，在殼聚糖平板上均勻涂布10-3、10-4、10-5稀釋的培養(yǎng)液，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)，不時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，3d后，取生長(zhǎng)良好且能產(chǎn)生透明圈的單菌落，接至殼聚糖斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，保藏。

同時(shí)，將挑選出的各菌株用無(wú)菌牙簽點(diǎn)接種至殼聚糖固體平板上，每個(gè)平板接3株或4株菌，三組平行，培養(yǎng)3d后，取出平板，置4℃冰箱中冷藏1d。測(cè)量各菌株的菌落直徑(d)和透明圈直徑(D)，計(jì)算D/d，并求其平均值，以d值和D/d值為指標(biāo)，挑選降解殼聚糖能力強(qiáng)的菌株。

1.5 菌株的形態(tài)和生理生化特征研究

1.5.1 形態(tài)特征鑒定

將產(chǎn)殼聚糖酶菌株接種于殼聚糖平板上，置于30℃恒溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)定大?。慌囵B(yǎng)72h后，觀察菌落形態(tài)。

1.5.2 氧化發(fā)酵試驗(yàn)(O-F test)

休和利夫森二氏培養(yǎng)基：蛋白胨 2g、NaCl5g、K2HPO40.2g、葡萄糖10.0g、瓊脂 3.0g、1%溴里百酚藍(lán)(溴麝香草酚藍(lán))溶液 3mL(先用少量95%酒精溶解后，再加水配成1%的水溶液)、蒸餾水 1000mL，pH7.0，分裝于試管中，培養(yǎng)基高度約4mm～5mm，121℃滅菌、20min；博德和霍爾二氏培養(yǎng)基：NH4H2PO40.5g、K2HPO40.5g、酵母膏 0.5g、葡萄糖10.0g、瓊脂 3.0g、1%溴百里酚藍(lán)溶液 3mL、 蒸餾水 1000mL，pH7.0， 同上分裝，滅菌。進(jìn)行穿刺接種培養(yǎng)，每株菌做兩組平行。每組包括4支：E1：不接種、不加石蠟密封；E2：不接種、石蠟密封；E3：接種、不加石蠟密封；E4：接種，石蠟密封(石蠟事先滅菌，添加高度為1mm左右)。30℃恒溫培養(yǎng)，1、3、5、7 d 后，與 E1、E2對(duì)照，觀察試管培養(yǎng)基顏色變化。 對(duì)用于本試驗(yàn)的菌株，如果E3、E4管顏色均變黃，說(shuō)明該菌株為氧化型(O)，如果僅 E4顏色變黃，說(shuō)明為發(fā)酵型(F)。

1.5.3 脲酶試驗(yàn)

培養(yǎng)基：蛋白胨 1g，葡萄糖 1g，NaCl 5g，KH2PO42g，0.2%酚磺酞指示液6mL，20%尿素溶液100mL，瓊脂20g，水900mL。除尿素外，將上述成分混合，調(diào) pH 值為 6.8～6.9，加熱溶化后分裝于試管中，115℃滅菌、30min，冷卻至50℃～55℃，加入經(jīng)過濾除菌的尿素溶液，擺斜面。劃線培養(yǎng)，于30℃恒溫培養(yǎng)，2、4d天后，觀察結(jié)果，菌體周圍培養(yǎng)基顏色呈桃紅色者為陽(yáng)性，不變者為陰性(以不加尿素的培養(yǎng)基作對(duì)照)。

1.5.4 吐溫 80 水解試驗(yàn)

蛋白胨 10g，NaCl 5g，CaCl2·7H2O 0.1g，瓊脂 9g，蒸餾水 1000mL，pH7.4，121℃滅菌20min。 吐溫60于121℃滅菌20min后，培養(yǎng)基冷卻至45℃左右時(shí)，加入至終濃度為1%，倒平板。劃線接種，培養(yǎng)7d，每天觀察結(jié)果。

1.5.5 耐 pH 值試驗(yàn)

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 0.5%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 值，分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，30℃，搖床培養(yǎng) 3天，觀察生長(zhǎng)情況，確定耐生長(zhǎng)pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集培養(yǎng)

培養(yǎng)5d后，除水樣外，其它培養(yǎng)液變混濁，有菌體產(chǎn)生，個(gè)別有絮狀沉淀。

2.2 平板分離

通過以殼聚糖為唯一碳源的平板篩選分離，挑出7株產(chǎn)透明圈的菌株，并對(duì)其編號(hào)，點(diǎn)接種比較d值D/d值，結(jié)果如表1示。

表1 菌株篩選結(jié)果

由表1初步認(rèn)為，X1菌株降解能力最強(qiáng)，其次為X5，其它菌株降解能力相對(duì)較弱。

2.3 菌株形態(tài)與生理生化特征

從中挑選出X1、X2、X3、X5、X6共5株菌，對(duì)進(jìn)行形態(tài)與生理生化特征鑒定。結(jié)果均為G-、桿狀、不產(chǎn)芽孢；在殼聚糖平板上，菌落呈白色、圓形、隆起，表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣平整，周圍有透明圈，其它形態(tài)特征和生理生化特征見表2。

表2 生理生化鑒定結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果將其歸為氧化型革蘭氏陰性菌，具體的分類地位有等進(jìn)一步鑒定。

3 討論

自然環(huán)境中的微生物是一個(gè)非?；祀s的群體，從中分離到具有某種特性的微生物具有很大的隨機(jī)性，是否能取得成功在很大程度上依賴于快速、高通量的篩選方法和簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)手段。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一套有效的篩選方案和技術(shù)路線。

取樣方面，因?yàn)闅ぞ厶菑V泛存在于水生甲殼類動(dòng)物、軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的外殼中，所以我們主要集中在池塘及其周邊自然環(huán)境中取樣。樣品通過以殼聚糖為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，限制其它微生物的生長(zhǎng)，使菌群中的特定微生物生長(zhǎng)繁殖，這樣目標(biāo)菌株在富集培養(yǎng)液占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。富集培養(yǎng)后，梯度稀釋涂平板，篩選能利用殼聚糖的微生物。其依據(jù)的原理是：殼聚糖平板呈白色不透明狀，能利用殼聚糖的微生物必然會(huì)分解殼聚糖成小分子，菌落周圍形成透明圈，其產(chǎn)酶活性越高，降解殼聚糖的能力越強(qiáng)，透明圈相對(duì)大小就越大，該方法易于觀察，效果明顯。通過初步篩選，最終得到了7株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株。

產(chǎn)殼聚糖酶的微生物種類繁多，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)上報(bào)道的有曲霉、假單胞菌、青霉菌、球孢白僵菌以及Mitsuaria chitosanitabida等。為此，我們對(duì)其中的5株菌進(jìn)行了初步鑒定，要得到更可靠的結(jié)果，還將進(jìn)一步通過生理生化特征和其它手段進(jìn)行鑒定。

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