人參皂苷生物轉(zhuǎn)化研究進展

郭從亮+崔秀明+楊曉艷+武雙

[摘要]人參皂苷是人參屬植物藥理活性的重要物質(zhì)，尤以稀有人參皂苷及苷元的抗腫瘤，保護神經(jīng)系統(tǒng)，保肝護肝等藥理活性最為顯著，因此，研究稀有人參皂苷獲取的方法也日益增多。該文對人參屬植物中人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化進行了簡要的概述和展望。

[關(guān)鍵詞]人參屬；皂苷類；生物轉(zhuǎn)化；稀有人參皂苷；β-葡萄糖苷酶

五加科人參屬植物人參、西洋參、三七均是我國傳統(tǒng)名貴藥材，現(xiàn)代研究表明，其主要活性成分大多為人參皂苷。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明^[1-3]，皂苷類是人參屬植物抗疲勞，抗腫瘤，抗血栓，提高免疫力，調(diào)節(jié)生理機能等藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。但隨著人們對人參屬總皂苷分離后的進一步藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，稀有人參皂苷及苷元（如人參皂苷Rg₃，Rh₁，C～K，Rb₃，Rh₂等）具有很強的抗腫瘤^[4]，保護神經(jīng)系統(tǒng)^[5]，保肝護肝^[6]等藥理活性。人參屬植物中皂苷的成分主要是人參皂苷，其骨架結(jié)構(gòu)屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜和齊墩果烷型三萜，以三七為例，三七中所含有人參皂苷依據(jù)苷元的不同又可分為原人參二醇型和原人參三醇型，如人參皂苷Rb₁，Rb₂，Rc，Rd等和人參皂苷Re，Rg₁，Rg₂，Rf等。人參屬植物三七總皂苷（PNS）的主要成分是人參皂苷Rb₁和Rg₁^[7]，據(jù)研究表明這些主要人參皂苷成分在人體腸道中的吸收卻微乎其微^[8]，而通過口服后經(jīng)胃酸及腸道菌的一系列生物轉(zhuǎn)化代謝后產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，如C-K，與大量天然富含的人參皂苷相比具有更好的抗腫瘤，抗過敏，抗炎癥作用[9，10]，同時也顯著地增加了其在人腸道中的吸收率，也正是由于其變化后明顯提高的抗腫瘤等藥理活性，近年來引起了研究者的廣泛的關(guān)注。目前，根據(jù)大量人參皂苷與稀有人參皂苷的結(jié)構(gòu)鑒定，得出二者的結(jié)構(gòu)差異主要是達(dá)瑪烷骨架結(jié)構(gòu)的C-3、C-6和C-20位上支鏈所連接的糖基的種類和數(shù)量有所不同，進而設(shè)法通過多種技術(shù)手段去除骨架結(jié)構(gòu)達(dá)瑪烷四環(huán)三萜這些支鏈上所連接的糖基來獲得稀有人參皂苷成為人們研究的熱點。但由于稀有人參皂苷天然植物含量低，且從簡單的初始產(chǎn)物對其進行化學(xué)合成也相當(dāng)困難。目前人們對于人參皂苷結(jié)構(gòu)修飾的方法主要有：酸解法、堿解法、加熱法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化法等^[11]。但化學(xué)方法，反應(yīng)條件劇烈，水解產(chǎn)物復(fù)雜多樣且條件控制苛刻，不易控制水解程度，且環(huán)境污染嚴(yán)重。而生物轉(zhuǎn)化方法多采用生物自身體系中的酶系統(tǒng)將人參屬植物中的大量藥理活性低的人參皂苷、苷元轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有次生代謝產(chǎn)物，因其具有反應(yīng)特異性高，轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，后處理簡單，環(huán)境親和性好等特點^[12]，與化學(xué)合成相比有著顯著的優(yōu)勢且更易獲得新穎結(jié)構(gòu)，因此也被廣泛的應(yīng)用于對人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾中。而目前常采用的生物轉(zhuǎn)化方式是微生物發(fā)酵法和酶法，其中酶法主要還是通過從陽性轉(zhuǎn)化微生物中分離純化獲得所需的酶。下面就根據(jù)近年來應(yīng)用于人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的微生物的來源進行闡述。

1 人參屬皂苷類生物轉(zhuǎn)化研究進展

1.1 利用土壤中分離篩選獲得的微生物來轉(zhuǎn)化人參屬皂苷 Gao J等^[13]通過從土壤中分離獲得1株病原性真菌Penicillium oxalicum sp. 68，并從其發(fā)酵液中分離純化得到β-糖苷酶，并成功將人參皂苷Rb₁，Rb₂，Rc和Rd分別轉(zhuǎn)化為藥理活性更高的稀有人參皂苷C-K，同時也分別闡明了這些人參皂苷轉(zhuǎn)化的途徑：Rb₁→Rd→F₂→Compound K，Rb₂→CO→CY→Compound K，Rc→Mb→Mc→Compound K和Rd→F₂→Compound K，用純化后的糖苷酶處理24 h后C-K的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)92%，見圖1。閆琴等^[14]從三七生長的土壤中分離出306株真菌，經(jīng)篩選鑒定獲得1株P(guān)aecilomyces Bainier sp. 229，其能有效地轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁為稀有人參皂苷化合物K，轉(zhuǎn)化率高達(dá)83%，并從此菌株中有效分離獲得人參皂苷β-葡萄糖轉(zhuǎn)化酶，分別闡明了生物轉(zhuǎn)化主要途徑與旁路途徑：人參皂苷Rb₁→人參皂苷Rd→人參皂苷F₂→化合物K；人參皂苷Rb₁→人參皂苷ⅩⅤⅡ→人參皂苷F₂→化合物K和人參皂苷Rb₁→人參皂苷Rg₃→人參皂苷Rh₂，見圖1。陳有為等^[15]從土壤真菌中分離篩選出一株能直接轉(zhuǎn)化人參屬皂苷的真菌，經(jīng)鑒定為土生霉菌Aspergillus terreus，此菌可通過固態(tài)轉(zhuǎn)化方式直接應(yīng)用于三七總皂苷（PNS），經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化后總皂苷中的原人參皂苷Rb₁，Rc，Re和三七皂苷R₁，R₃，R₆均被分解，而發(fā)酵液中富含三七皂苷nR₂，RX₁，人參皂苷Rg₁，Rd和稀有人參皂苷Rh₁、Rh₄。結(jié)果表明土生曲霉可以轉(zhuǎn)化原三七總皂苷成分，并生成生物活性的稀有人參皂苷。王青等^[16]通過從生長人參的土壤中篩選出23株菌，經(jīng)三七發(fā)酵轉(zhuǎn)化試驗發(fā)現(xiàn)9株可轉(zhuǎn)化三七總皂苷（PNS）獲得高活性稀有人參皂苷的菌株，其中轉(zhuǎn)化能力最強的一株經(jīng)鑒定為棒曲霉屬Aspergillus sp.菌，其能將三七總皂苷（PNS）轉(zhuǎn)化生成稀有次級人參皂苷Rg₃，C-K，Rh₁和Rh₂等，經(jīng)酶活性測定發(fā)現(xiàn)其具有較高的糖化酶活性，而且能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化pNPG。付玉等^[18]通過對草本植物下層土壤進行分離純化獲得22株微生物，經(jīng)三七總皂苷微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化試驗后篩選出一株能有效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁為稀有次級皂苷（Rg₃）的菌株CG2，其具有很高的β-葡萄糖苷酶活性，并闡明了其生物轉(zhuǎn)化途徑：人參皂苷Rb₁→絞股藍(lán)G-ⅩⅤⅡ和Rd→人參稀有皂苷Rg₃，見圖1，后經(jīng)鑒定該菌為巨型芽孢桿菌屬。Wu LP等^[19]通過從土壤中分離純化篩選出22株能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的微生物，并通過進一步的篩選得出一株Cladosporium cladosporioides，其能將主要人參皂苷Rb₁與Rg₁分別轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷C-K和F₁，其轉(zhuǎn)化率分別為74.2%，89.3%，在共同生物轉(zhuǎn)化時的結(jié)果表明，人參皂苷Rg₁能夠通過抑制中間體七葉膽苷-ⅩⅤⅡ的形成來改變?nèi)藚⒃碥誖b₁生物轉(zhuǎn)化過程。Ye L等^[20]為了進一步提高從土壤中獲得的轉(zhuǎn)化人參皂苷菌株P(guān). bainier 229的底物濃度和底物耐受性，通過將其真菌孢子經(jīng)紫外照射獲得突變體P. bainier 229-7，其能有效地將人參皂苷Rb₁生物轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.9%，通過擴大發(fā)酵試驗，其有效生物轉(zhuǎn)化率高達(dá)89%，這也為制藥工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)創(chuàng)造了可能。崔宇等^[21]利用從土壤中篩分的野生鐮刀霉屬霉菌m₁₄對二醇型皂苷含量較高的人參果總皂苷（SFPG）進行生物轉(zhuǎn)化，可獲得含量較高的稀有人參皂苷化合物K，在最佳轉(zhuǎn)化條件下C-K的含量可提高40.65倍，這為C-K的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條新的途徑。endprint

成樂琴等^[21]從人參土壤中分離獲得微生物Microbacterium esteraromaticum GS514，其能有效轉(zhuǎn)化原人參二醇人參皂苷Rb₁和Rd為20（S）-Rg₃，見圖1，后又將從M. esteraromaticum GS514的培養(yǎng)液中分離獲得的粗酶應(yīng)用于原人參三醇組人參皂苷Re和Rg₁，實驗發(fā)現(xiàn)金屬離子如Na+，K+，Mg²+等能有效地激活C20 β-D-吡喃葡萄糖苷酶，并成功分別將其水解為20（S）-Rg₂和20（S）-Rh₁，見圖2，這對于定向水解獲取稀有人參皂苷具有重要意義。張薇等^[23]從人參生長土壤中分離獲得105株真菌，經(jīng)活性篩選后獲得25株具有轉(zhuǎn)化人參總皂苷活性菌株，其中獲得兩株具有專一性轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁為Rd的菌株：莫勒接霉Zygorhynchus moelleri，灰綠犁頭霉Absidia glauca。Wang L等^[24]從人參生長土壤中篩選出100株表現(xiàn)β-葡萄糖苷酶活性的菌株，并從中獲得一株高活性菌株Sphingomonas sp.ZY-3，初步鑒定是鞘氨醇單胞菌屬的突變株，通過TLC和HPLC檢測發(fā)現(xiàn)其能高效的將人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化為化合物K，并初步闡明了其轉(zhuǎn)化途徑：Rb₁→Rd→F₂→C-K，見圖1。Fu Y等^[25]對人參生長土壤中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物進行了分離，獲得53株菌株，并分別檢測了其人參皂苷水解活性，最終獲得菌株GS09，經(jīng)鑒定為菌株S.asaccharolytica，其能有效地轉(zhuǎn)化主要人參皂苷Rb₁，Rb₂，Rc為化合物K。侯耀達(dá)等^[26]從七年生人參根部土壤中分離獲得39株菌株，其中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌23株，并從中獲得一株GS1-33，其能有效的轉(zhuǎn)化人參根總皂苷為稀有人參皂苷，且在最佳轉(zhuǎn)化條件：LL培養(yǎng)基，pH調(diào)至3.0時，生成稀有人參皂苷C-K和Rh₁的最大產(chǎn)率分別為14%，25%。Lin H Q等^[27]通過從人參生長土壤中獲得菌株M. esteraromaticum的基因的分子克隆獲得重組β-葡萄糖苷酶，用于人參皂苷Rb₁的生物轉(zhuǎn)化，獲得稀有人參皂苷C-K，其轉(zhuǎn)化途徑為：Rb₁→Rd→C-K，見圖1，最優(yōu)摩爾轉(zhuǎn)化率為77%。

1.2 利用三七內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化人參屬皂苷 趙方允等^[28]從三七根莖、花、種子等部位分離獲得27株真菌，2株細(xì)菌，經(jīng)發(fā)酵初步篩選出兩株對人參皂苷具有明顯轉(zhuǎn)化的菌株，經(jīng)鑒定分別為根霉屬Rhizopu真菌和毛霉屬Mucor真菌。試驗結(jié)果初步表明這兩株菌均能略微增加發(fā)酵液中總皂苷的含量，其中毛霉屬Mucor菌株能使三七單體皂苷發(fā)酵液中的Rb₁的TLC點消失，且在稀有人參皂苷Rg₃處有點顯現(xiàn)，經(jīng)結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)其僅有C-20位糖基有所差異，故初步推測Rb₁轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg₃，具體結(jié)構(gòu)鑒定仍在進行中。Shao LL等^[29]從三七中篩選出136株內(nèi)生菌，并從中獲得能將主要人參皂苷Rg₁，Rh₁，Rb₁，Re等轉(zhuǎn)化為9種已知化合物的3株真菌和2株細(xì)菌，如，稀有人參皂苷化合物K、人參皂苷F₂、人參皂苷Rg₁等和1種新化合物6-O-[β-L-rhamnopyranosyl-（1，2）-β-D-glucopyranosyl]-20-O-β-D-glucopyranosyldammarane-3，6，12，20，24，25-hexaol，經(jīng)鑒定這5種菌分別為Fusarium oxysporum，Nodulisporium sp.，F(xiàn)usarium sp.，Brevundimonas sp.，Bacillus sp.。

1.3 人參皂苷在腸道菌中的轉(zhuǎn)化 Qian T X等^[30]利用大鼠腸道菌群來研究人參皂苷Rb₁，Rg₃和Rh₂在大鼠胃腸道中的生物轉(zhuǎn)化過程，結(jié)果研究表明，人參皂苷Rb₁，Rg₃，Rh₂分別經(jīng)大鼠胃腸道菌群生物轉(zhuǎn)化后，可以分別在大鼠排泄物樣品中檢測到6，6，3種代謝產(chǎn)物，其中人參皂苷Rg₃和人參皂苷Rh₂均可由人參皂苷Rb₁在大鼠胃腸道經(jīng)生物轉(zhuǎn)化獲得，Rh₂可以由Rg₃生物轉(zhuǎn)化獲得。研究表明主要人參皂苷Rb₁可以通過胃腸道菌群的共同生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生活性更高的稀有人參皂苷Rg₃和Rh₂。陳新梅^[30]對人參皂苷Rg₁在大鼠腸道酶和菌群的代謝轉(zhuǎn)化進行了研究，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg₁在人工胃液中2 h可完全降解，在大鼠腸內(nèi)菌群的代謝下可轉(zhuǎn)化為一對同分異構(gòu)體人參皂苷Rh₁和人參皂苷F₁，見圖2。

1.4 三七總皂苷在三七自身皂苷糖苷酶作用下的轉(zhuǎn)化 劉廷強等^[32]通過改變提取三七總皂苷的溫度，利用三七自身所含有的皂苷糖苷酶，將三七所含有的主要人參皂苷如Rb₁，Re，Rd，Rg₁等轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷如Rg₃等。其研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可耐受80～121 ℃而不分解，但在三七提取過程中，將溫度設(shè)置在80～100 ℃時可以將15%的三七總皂苷（Rb，Rd，Rg₁，Re等）轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷（Rg₂，Rg₃，Rh₂，C-K等），而通過提高溫度至110～121 ℃時可完全轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷。endprint

1.5 食品級微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷 金艷等^[33]利用橙汁中分離的菌株CZ2，成功地將人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化為稀有皂苷F₂和gypenoside-ⅩⅤⅡ，并進一步獲得其生物轉(zhuǎn)化機制為：Rb₁→Gpy→gypenoside-ⅩⅤⅡ→F₂，見圖1。最終獲得最佳轉(zhuǎn)化條件：LL培養(yǎng)基，pH 4.0。Quan L H等^[34]從韓國泡菜中分離獲得菌株Leuconostoc mesenteroides DC102，并從菌株中分離粗酶液用于人參皂苷Rb₁的轉(zhuǎn)化，結(jié)果成功地將人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷化合物K，且在最優(yōu)酶活條件下轉(zhuǎn)化72 h后轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%，其轉(zhuǎn)化途徑為：Rb₁→七葉膽苷ⅩⅤⅡ或Rd→F₂→C-K，見圖1。Su J P等^[35]檢測食品級乳酸菌對主要人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株L. mesenteroides KFRI 690能有效地將人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷化合物K，通過在培養(yǎng)基中增加2%的蔗糖可使轉(zhuǎn)化率提高到97.8%。Lin HQ等^[36]又再次從韓國泡菜中成功分離獲得菌株Lactobacillus paralimentarius LH4，從中提取獲得的酶在最優(yōu)條件：30 ℃，pH 6.0，轉(zhuǎn)化72 h后可將人參皂苷Rb₁轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷化合物K且摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)88%。Kim S H等^[37]從韓國泡菜中獲得L. pentosus Strain 6105，并從中分離獲得粗酶用于人參皂苷Rb₁的生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)過TCL和HPLC分析后得出轉(zhuǎn)化途徑為：Rb₁→七葉膽甙XVII，Rb→F₂→C-K，見圖1。

2 人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的其他方法

目前人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化主要方式是通過從人參屬植物生長的土壤中篩分具有轉(zhuǎn)化活性的菌株用于人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，此外菌株來源還包括胃腸道、人參屬植物內(nèi)生菌，食用級真菌中以及已知菌種庫等。但是這些方式相對隨機性大，工作量多，相對篩分比較困難。人們通過對人參皂苷生物轉(zhuǎn)化水解部位的研究，用馬栗樹皮甙-R2A瓊脂培養(yǎng)基特定性地篩選具有β-葡萄糖苷酶的微生物，然后應(yīng)用于大量人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，以期獲得具有更高藥理活性稀有次級人參皂苷。但是通過篩選獲得的微生物將人參屬植物大量人參皂苷生物轉(zhuǎn)化為稀有次級人參皂苷的產(chǎn)率并不是很高，為此許多研究者開始從所篩選的用于人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的微生物中分離粗酶來提高生物轉(zhuǎn)化率。為了獲得更多的粗酶，許多研究者開始選擇生物技術(shù)將有效的人參皂苷轉(zhuǎn)化酶基因特異性地轉(zhuǎn)入工程菌以期獲得更加豐富大量表達(dá)的粗酶。Quan L H等^[38]將菌株M. esteraromaticum中的β-葡萄糖苷酶基因重組后導(dǎo)入大腸桿菌中進行表達(dá)，并成功地用于人參皂苷Rb₁的轉(zhuǎn)化，獲得藥理活性更高的稀有人參皂苷Rd和C～K，在最優(yōu)酶活條件下獲得C～K的摩爾轉(zhuǎn)化率為77%。Chang C R等^[39]從三七土壤中分離的Aspergillus niger菌株中獲得β-葡萄糖苷酶基因bgl1，并導(dǎo)入啤酒酵母中進行表達(dá)，獲得的表達(dá)產(chǎn)物能有效地將人參皂苷Rf轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh₁。Kim J K等^[40]從菌株Sanguibacter keddieii中克隆獲得人參皂苷水解糖苷酶基因bglSk，導(dǎo)入大腸桿菌BL21中進行過表達(dá)，獲得的過表達(dá)重組酶可以將主要人參皂苷Rb₁，Rb₂，Rc，Rd，Re和Rg₁轉(zhuǎn)化為高藥理活性的稀有人參皂苷C-Y，C-Mc，C-K，Rg₂-（S）和F₁，見圖1，2。尤其可將人參皂苷Rg₁完全轉(zhuǎn)化為F₁。Hao H等^[41]從菌株Flavobacterium johnsoniae中獲得β-葡萄糖苷酶基因bglF3，并在大腸桿菌BL21中過表達(dá)獲得重組酶用于人參皂苷Rb₁和七葉膽甙XVII的轉(zhuǎn)化，結(jié)果BglF3僅能水解人參皂苷C-20位的末端葡萄糖分子分別獲得人參皂苷Rd和F₂。Lin HQ等^[42]又通過從M. esteraromaticum中分離β-葡萄糖苷酶基因bgp1導(dǎo)入到大腸桿菌BL21中，獲得重組β-葡萄糖苷酶用于人參皂苷Rb₁的轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明Bgp1可有效地依次水解皂苷C-20位的糖基，獲得人參皂苷Rd和20（S）-Rg₃。賈翠英等^[43]通過酶工程技術(shù)將酵母細(xì)胞包埋在海藻酸鈉中對人參皂苷Rb₁的轉(zhuǎn)化進行了研究，獲得最佳轉(zhuǎn)化條件為：包埋45 min，接種7%，海藻酸鈉濃度5%，CaCl₂濃度10%。包埋酵母菌對人參皂苷Rb₁的最高生物轉(zhuǎn)化率為31.51%，提高了3%～5%的生物轉(zhuǎn)化率，解決了種子不能重復(fù)使用等問題。

3 人參皂苷微生物合成

近年來，利用基因工程技術(shù)將特定天然產(chǎn)物生產(chǎn)過程中特有的中間酶系基因進行重組并導(dǎo)入工程菌中，通過結(jié)構(gòu)簡單的單糖作為初始底物進行簡單的發(fā)酵，用于生物合成特定天然產(chǎn)物也成為人們研究的熱點。Yan X等^[44]通過從人參愈傷組織中分離獲得人參皂苷生物合成途徑中的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并成功地導(dǎo)入酵母工程菌中進行異源性表達(dá)獲得UGTPg1，結(jié)果表明UGTPg1在體外可輕易地在原人參二醇（PPD）的C-20（S）-OH位上進行一分子糖基化獲得C-K，同時研究表明UGTPg1在體內(nèi)外均可以特異性地將Dammarenediol Ⅱ（DM），Rh₂，Rg₃催化為20（S）-O-β-（D-glucosyl）-dammarenediol Ⅱ（DMG）、人參皂苷F₂和Rd，且在C-3-OH位和C-20（R）-OH位并不出現(xiàn)糖基化催化反應(yīng)，同時已單糖基化的C-20（S）-OH位并無糖鏈延伸；進一步的研究表明，人參組織中的蛋白CYP716A47在體外可將DM和DMG分別氧化為原人參二醇（PPD）和人參皂苷C-K。通過工程菌AKE和BKE的發(fā)酵，發(fā)酵液中稀有人參皂苷的含量分別達(dá)到1.4，0.8 mg·L^-1。這不僅為C～K的臨床藥用開發(fā)提供了廉價生產(chǎn)途徑，而且更加清楚地闡明了人參皂苷在人參屬植物中生物合成的途徑。Dai Z B等^[45]通過基因工程技術(shù)在釀酒酵母導(dǎo)入人參的達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ合成酶基因、原人參二醇合成酶基因和擬南芥中NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶基因用于原人參二醇的生物合成，為了增加原人參二醇的產(chǎn)量，其又通過密碼子優(yōu)化技術(shù)將生物合成人參皂苷的多種中間體合成酶基因進行過表達(dá)，然后經(jīng)由YPD培養(yǎng)基兩相萃取發(fā)酵，最終獲得原人參二醇和達(dá)瑪烯二醇-II的產(chǎn)量分別為1 189，1 548 mg·L^-1。Dai Z B等^[46]又再次通過基因工程技術(shù)成功地在釀酒酵母中實現(xiàn)了人參皂苷元的生物合成。其通過將外源性不同植物來源酶基因（如β-香樹脂醇合成酶、齊墩果酸合成酶、達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ合成酶和原人參二醇合成酶等）導(dǎo)入到釀酒酵母工程菌中獲得轉(zhuǎn)基因菌株GY-1，在含2%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)5 d后檢測發(fā)酵液中原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸的含量分別為17.2，15.9，21.4 mg·L^-1，這為稀有人參的獲取方法提供了一種有別于從傳統(tǒng)人參屬植物中提取獲得人參皂苷的生物合成方法。endprint

4 展望

通過生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將人參屬植物中所富含的大量人參皂苷進行結(jié)構(gòu)改造，獲得一般方法難以獲得且經(jīng)濟價值更高的稀有人參皂苷是人們一直研究的熱點。為了克服化學(xué)方法水解帶來的麻煩，人們轉(zhuǎn)向從微生物界篩選具有特異性高且轉(zhuǎn)化能力強的菌株，通過從菌株中分離純化粗酶可進一步提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)率；對于人參皂苷的轉(zhuǎn)化，化學(xué)方法因為水解特異性差，糖苷鍵斷裂徹底，水解產(chǎn)物后處理復(fù)雜且更易帶來環(huán)境污染問題，而生物轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化條件溫和，根據(jù)不同菌株的選擇可特異性地轉(zhuǎn)化出所需要的稀有皂苷產(chǎn)物。另一方面，利用基因工程技術(shù)將天然產(chǎn)物的特定基因進行外源性表達(dá)，以期從結(jié)構(gòu)簡單的初始產(chǎn)物開始獲取所需要的復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成方法也是人們研究的熱點。為了克服傳統(tǒng)提取人參皂苷的天然植物資源的限制，人們開始利用基因工程技術(shù)將人參皂苷生物合成途徑中所需的多種酶系基因?qū)牍こ叹校ㄟ^對結(jié)構(gòu)簡單的初始產(chǎn)物進行簡單的發(fā)酵獲取大量的稀有人參皂苷。但由于酶的蛋白屬性導(dǎo)致轉(zhuǎn)化和合成過程酶活性降低或失活且重復(fù)利用率低，因此未來人參屬植物皂苷的生物轉(zhuǎn)化及生物合成將會通過基因工程技術(shù)，蛋白質(zhì)工程技術(shù)和酶工程等方法解決生物轉(zhuǎn)化與生物合成過程中酶出現(xiàn)的一系列活性改變問題，以期獲得稀有人參皂苷產(chǎn)率更高且更加經(jīng)濟簡便的獲取方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 甘雨，徐惠波，孫曉波. 三七總皂苷的藥理作用研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2007，18（5）： 1251.

[2] 石楸鳴. 人參皂苷的藥理作用研究進展[J]. 中國藥房，2010，21（31）： 2967.

[3] 李長田，王海波，賈傳文. 人參、西洋參和三七提取物抗凝血活性的研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27（2）： 169.

[4] Wang C Z，Xie J T，F(xiàn)ishbein A，et al. Antiproliferative Effects of Different Plant Parts of Panax notoginseng on SW480 human colorectal cancer Cells [J]. Phytother Res，2009，23： 6.

[5] Tian J W，F(xiàn)u F H，Geng M Y，et al. Neuroprotective effect of 20（S）-ginsenoside Rg₃on cerebral ischemia in rats [J]. Neurosci Lett，2005，374（2）： 92.

[6] Lee H U，Bae E A，Han M J，et al. Hepatoprotective effect of ginsenoside Rb₁and compound K on tert-butyl hydroperoxide-induced liver injury [J]. Liver Int，2005，25（5）： 1069.

[7] 鄭麗華，周志昆，盧昌均，等. HPLC測定三七總皂苷中5種皂苷的含量及穩(wěn)定性考察[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（1）： 73.

[8] 張蓓，林東海，劉珂. 人參皂苷的體內(nèi)分布與代謝研究概況[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（2）： 92.

[9] 李相鵬，王鵬，李英霞. 原人參二醇型皂苷活性代謝物Compound K藥理活性的研究進展[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25（1）：97.

[10] 朱偉，易瓊，王魯，等. 人參皂苷Rh₂的藥理學(xué)研究進展[C]. 長春：2010年學(xué)術(shù)年會——反芻動物疾病專題，2010.

[11] 史公良，童然珣，趙余慶. 人參稀有抗腫瘤皂苷制備方法的研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2006，8（6）： 31.

[12] 牛紅軍，王芃，楊官娥. 微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：346.

[13] Gao J，Xu W J，F(xiàn)ang Q，et al. Efficient biotransformation for preparation of pharmaceutically active ginsenoside Compound K by Penicillium oxalicum sp. 68 [J]. Ann Microbiol，2013，63（1）： 139.

[14] Yan Q，Zhou W，Shi X L，et al. Biotransformation pathways of ginsenoside Rb₁to compound K by β-glucosidases in fungus Paecilomyces Bainier sp. 229 [J]. Process Biochem，2010，45（9）： 1550.

[15] 陳有為，苗翠蘋，吳少華. 土生曲霉轉(zhuǎn)化三七中藥材的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（8）： 1014.

[16] 王青，袁萍，茅仁剛，等. 轉(zhuǎn)化三七提取物為人參皂苷Rg₃的真菌分離鑒定[J]. 華東師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，（6）： 115.

[17] Park C S，Yoo M H，Noh K H，et al. Biotransformation of ginsenosides by hydrolyzing the sugar moieties of ginsenosides using microbial glycosidases [J]. Appl Microbiol Biotechnol，2010，87： 9.endprint

[18] 付玉，王超，尹成日. 菌株CG2對三七總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)化機理[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2011，33（2）： 117.

[19] Wu L P，Jin Y，Yin C R，et al. Co-transformation of Panax major ginsenosides Rb₁and Rg₁to minor ginsenosides C-K and F₁by Cladosporium cladosporioides[J]. J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39（4）： 521.

[20] Ye L，Zhou C Q，Zhou W，et al. Biotransformation of ginsenoside Rb₁to ginsenoside Rd by highly substrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7[J]. Bioresour Technol，2010，101（20）： 7872.

[21] 崔宇，姜彬慧，韓穎，等. 微生物對人參果總皂苷中人參皂苷化合物K的轉(zhuǎn)化作用[J]. 中草藥，2007，38（2）： 189.

[22] 成樂琴，金瑜真，梁德春. 微生物酶催化制備人參皂苷20（S）-Rg₂，20（S）-Rhl和20（S）-PPT [J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2011，32（1）：67.

[23] 張薇，孫曉東，張萍，等. 專一轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷Rb₁為Rd的真菌菌株的篩選[J]. 菌物學(xué)報，2011，30（2）： 305.

[24] Wang L，Baek S H，Lee S T. Microbial conversion of major ginsenosides to minor pharmacological ginsenoside compound-K by Sphingomonas sp. ZY-3[C]. IPCBEE，2011，5： 71.

[25] Fu Y，Yin Z，Wu L，et al. Diversity of cultivable β-glycosidase-producing micro-organisms isolated from the soil of a ginseng field and their ginsenosides-hydrolysing activity[J]. Lett Appl Microbiol，2014，58（2）： 138.

[26] 侯耀達(dá)，費立坤，尹成日. 微生物轉(zhuǎn)化人參根總皂苷為稀有皂苷C-K 和Rh₁[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2011，33（2）： 108.

[27] Quan L H，Min J W，Jin Y，et al. Enzymatic biotransformation of ginsenoside Rb₁to compound K by recombinant β-glucosidase from Microbacterium esteraromaticum[J]. J Agric Food Chem，2012，60（14）： 3776.

[28] 趙方允，虞泓，陳自宏，等. 三七中分離微生物對其轉(zhuǎn)化的初步研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（8）： 47.

[29] Luo S L，Dang L Z，Li J F，et al. Biotransformation of saponins by endophytes isolated from Panax Notoginseng [J]. Chem Biodivers，2013，10（11）： 2021.

[30] Qian T X，Cai Z W. Biotransformation of ginsenosides Rb₁，Rg₃and Rh₂in rat gastrointestinal tracts [J]. Chinese Medicine，2010，5： 19.

[31] 陳新梅. 大鼠腸道酶和菌群對人參皂苷Rg₁的代謝轉(zhuǎn)化研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（11）： 210.

[32] 劉廷強，何璐璐，魚紅閃，等. 三七提取中人參皂苷的轉(zhuǎn)化[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，28（2）： 111.

[33] 金艷，金香梅，尹成日. 微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁為稀有皂苷F₂[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2011，33（2）：112.

[34] Quan L H，Piao J Y，Min J W，et al. Biotransformation of ginsenoside Rb₁to Prosapogenins，gypenoside XVII，ginsenoside Rd，ginsenoside F₂，and compound K by Leuconostoc mesenteroides DC102[J]. J Ginseng Res，2011，35（3）： 344.

[35] Su J P，So Y Y，Geun E J，et al. Whole cell biotransformation of major ginsenosides using Leuconostocs and Lactobacilli[J]. Food Sci Biotechnol，2012，21（3）： 839.endprint

[36] Quan L H，Kim Y J，Li G H，et al. Microbial transformation of ginsenoside Rb₁to compound K by Lactobacillus paralimentarius[J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（6）： 1001.

[37] Kim S H，Min J W，Quan L H，et al. Enzymatic Transformation of ginsenoside Rb₁by Lactobacillus pentosus Strain 6105 from Kimchi[J]. J Ginseng Res，2012，36（3）： 291.

[38] Quan L H，Min J W，Jin Y，et al. Enzymatic biotransformation of ginsenoside Rb₁to compound K by recombinant β-Glucosidase from Microbacterium esteraromaticum[J]. J Agric Food Chem，2012，60（14）： 3776.

[39] Ruan C C，Zhang H，Zhang L X，et al. Biotransformation of ginsenoside Rf to Rh₁by recombinant β-glucosidase[J].Molecules，2009，14（6）： 2043.

[40] Kim J K，Cui C H，Yoon M H，et al. Bioconversion of major ginsenosides Rg₁to minor ginsenoside F₁using novel recombinant ginsenoside hydrolyzing glycosidase cloned from Sanguibacter keddieii and enzyme characterization[J].J Biotechnol，2012，161（3）： 294.

[41] Hong H，Cui C H，Kim J K，et al. Enzymatic biotransformation of ginsenoside Rb₁and gypenoside ⅩⅤⅡ into ginsenosides Rd and F₂by recombinant β-glucosidase from Flavobacterium johnsoniae [J]. J Ginseng Res，2012，36（4）： 418.

[42] Quan L H，Min J W，Yang D U，et al. Enzymatic biotransformation of ginsenoside Rb₁to 20（S）-Rg₃by recombinant β-glucosidase from Microbacterium esteraromaticum [J]. Appl Microbiol Biotechnol，2012，94（2）： 377.

[43] 賈翠英，張玉輝，魏均玲. 海藻酸鈉包埋的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁的研究 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41（9）： 60.

[44] Yan X，F(xiàn)an Y，Wei W，et al. Production of bioactive ginsenoside compound K in metabolically engineered yeast [J]. Cell Res，2014，24（6）： 770.

[45] Dai Z B，Liu Y，Zhang X N，et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides [J]. Metab Eng，2013，20： 146.

[46] Dai Z B，Wang B B，Liu Y，et al. Producing aglycons of ginsenosides in bakers′ yeast [J]. Sci Rep，2014，doi：10.1038/srep03698.

Advances in studies on biotransformation of ginsensides

GUO Cong-liang¹，2，CUI Xiu-ming¹，2，YANG Xiao-yan¹，2*，WU Shuang¹，2

（1. Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Yunnan Kunming 650500，China；

2. Yunnan and Macau Joint Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality and Resources Development，Kunming 650500，China）

[Abstract] Ginseng saponins are a type of important active substances in the ginseng genus plants. They have notable pharmacological activities of antineoplastic，neuroprotective，and hepatoprotective activities，which have been drawn more attention to obtain minor ginsenosides by all kinds of methods. In this review，we discussed the latest progress for enrichment of minor ginsenosides by biological transformation of major ginsenosides. At the same time，we have a brief outlook of the research at bioconversion of ginseng saponins.

[Key words] Panax； saponins； biotransformation； minor ginseng saponins； β-glycosidase enzymes

doi：10.4268/cjcmm20142003

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint