添加不同類型脂肪酸對(duì)羅非魚肝臟原代細(xì)胞內(nèi)脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓春艷，鄭清梅，陳桂丹，劉麗霞

(嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸作為一種基因表達(dá)的調(diào)控物可以直接和獨(dú)立地調(diào)節(jié)基因表達(dá).尤其是n－3和n－6系列多不飽和脂肪酸(PUFA)與基因調(diào)節(jié)之間的關(guān)系最為密切［1］.對(duì)于魚類來(lái)講，脂肪作為能量的主要來(lái)源，其代謝的主要場(chǎng)所是肝臟，因此研究魚類肝臟中的脂類代謝就顯得尤為重要.

已有大量的研究表明，飼料中不同來(lái)源脂肪直接影響魚類(包括:草魚［2］、鯉魚［3］和羅非魚［4］等)體內(nèi)的脂肪代謝.但目前研究主要以活體動(dòng)物為主，未見細(xì)胞水平的相關(guān)研究.隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，體外培養(yǎng)的原代魚肝細(xì)胞在不同領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［5］.研究表明，來(lái)自活體經(jīng)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞在合適培養(yǎng)條件下可以保持1周到數(shù)周的活力［6］，而且保持了大部分初始活體特征［7］.因此，利用原代培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究不失為一種快速、經(jīng)濟(jì)的研究手段.由于魚類的種類繁多，與哺乳動(dòng)物比較魚類肝臟較小且血管系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，因此采用灌注法對(duì)儀器要求高、操作難度大，一般實(shí)驗(yàn)室內(nèi)很難完成.與之比較目前常用酶消化法進(jìn)行肝臟細(xì)胞分離和制備，操作較為容易，但因肝臟內(nèi)血細(xì)胞豐富如分離純度不高會(huì)影響進(jìn)一步的研究.本研究擬以?shī)W尼羅非魚為研究對(duì)象初步探索肝臟細(xì)胞分離方法，并進(jìn)一步研究培養(yǎng)基中添加不同類型的脂肪酸對(duì)其中與脂類代謝有關(guān)的酶(包括:脂蛋白脂酶(LPL)和蘋果酸脫氫酶(MDH))及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(PPARα(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 －α))基因表達(dá)的影響，旨在為不同類型脂肪酸對(duì)魚類脂類代謝影響機(jī)制及進(jìn)一步的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

150g左右的奧尼羅非魚由華南師范大學(xué)生物園提供.基礎(chǔ)培養(yǎng)基是 DMEM(Gibco)，添加10%FBS.主要試劑:Ⅱ型膠原酶(CollagenaseⅡ)、DEPC(Sigma公司)、胎牛血清(NCS)、PrimeScript RT Kit(Perfect Real Time)200次量反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq(Takara)、RNA提取試劑盒 TRIZOL(Invitro-gen)、DL2000(天根生化公司)，其余化學(xué)試劑均為分析純.

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液(Sigma):使用無(wú)水乙醇配制成1M的儲(chǔ)備液于－80℃凍存，使用時(shí)用培養(yǎng)基配制成最終濃度.

1.2 儀器設(shè)備

無(wú)菌手術(shù)器械，IX70－S8F2倒置顯微鏡(日本Olympus，IX70)，22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendrof)，超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱.

1.3 羅非魚肝臟細(xì)胞的分離及純化

無(wú)菌條件下，取羅非魚肝臟、剪成小塊，PBS液反復(fù)洗滌至液體澄清.靜置后吸除洗液.加入Ⅱ型膠原酶溶液置于冰上消化30 min.120目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，以除去結(jié)締組織和細(xì)胞團(tuán)塊.將細(xì)胞濾液于4℃離心機(jī)中離心.分別采用90 g，60 g和30 g反復(fù)進(jìn)行離心，每次用PBS液洗滌.最后除去上清液，加入含胰島素、1%青霉素和鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)液制成肝細(xì)胞懸液.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，根據(jù)鏡下細(xì)胞形態(tài)判斷肝細(xì)胞和雜質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)的百分率，即純度.臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)活力.

1.4 肝臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)

用細(xì)胞培養(yǎng)液將肝細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取3 ml稀釋液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中(Coring，6孔)，隨機(jī)分為6組，每組3孔，于27℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).24h后小心移除培養(yǎng)基以添加16:0脂肪酸的培養(yǎng)基為對(duì)照組，以培養(yǎng)基中分別添加不同飽和度的脂肪酸(18:1 n－9，18:2n－6，20:4 n－6，20:5 n－3和22:6 n－3)為實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞RNA，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次.

1.5 定量方法

細(xì)胞RNA的提取參照Invitrogen試劑說(shuō)明書;采用分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA濃度及OD260/280，樣品 RNA濃度均保持在 150～200 ng/μL，OD260/280測(cè)定值在1.8～2.0.反轉(zhuǎn)錄時(shí)采用800 ng RNA/20μL體系，參照Takara試劑盒說(shuō)明書.

采用相對(duì)定量方法，以β－actin為參照基因，對(duì)目的基因mRNA表達(dá)豐度進(jìn)行測(cè)定，引物見表1.

表1 本研究所使用的引物序列及相關(guān)參數(shù)

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc.，USA)對(duì)所得相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One－Way ANOVA)，并進(jìn)行 Duncan＇s多重比較，P ＜0.05 具有顯著性差異.所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD.)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 肝細(xì)胞的產(chǎn)量、純度及活力

本實(shí)驗(yàn)以膠原酶冷消化法消化分離羅非魚肝細(xì)胞，膠原酶的濃度為0.25%，用量為所消化肝組織的3～5倍，消化時(shí)間為0.5h.新分離的肝細(xì)胞透亮，近似圓形，有立體感，呈單個(gè)分散狀態(tài)，細(xì)胞核清晰，偶有小細(xì)胞團(tuán)，其中含有少量血細(xì)胞.依表2可見，反復(fù)低速離心可有效去除雜細(xì)胞，經(jīng)24h的培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁狀況良好，細(xì)胞間出現(xiàn)索狀排列、島狀連接，為進(jìn)一步研究提供保證.

表2 不同離心條件下羅非魚肝細(xì)胞的產(chǎn)量和純度

2.2 不同類型的脂肪酸對(duì)肝臟細(xì)胞內(nèi)與脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表3可見，隨著脂肪酸不飽和程度的增加LPL和PPARα的基因表達(dá)明顯上升.其中培養(yǎng)基中添加了20:5 n－3(EPA)和22:6 n－3(DHA)兩種脂肪酸的肝臟細(xì)胞內(nèi)LPL和PPARα的表達(dá)量顯著高于添加飽和性脂肪酸組.其余各組間差異不顯著.而MDH表達(dá)則呈現(xiàn)相反趨勢(shì).

表3 不同類型的脂肪酸對(duì)肝臟細(xì)胞內(nèi)與脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

目前，魚類肝細(xì)胞分離的方法主要有兩種，直接消化法和兩步灌注法［5］.兩步灌流法因其得到的細(xì)胞純度高、活力好，得到廣泛應(yīng)用.但這一方法只適用于肝組織具有比較發(fā)達(dá)門靜脈系統(tǒng)的魚類，如蛙魚類等.對(duì)于沒有門靜脈的魚類(如羅非魚)，灌流時(shí)通常需從腹部的動(dòng)脈或是心臟插入針管，這種操作難度大，常常達(dá)不到理想效果，且灌注法多適用于個(gè)體比較大的成魚，個(gè)體較小的魚極難成功.因此，對(duì)于個(gè)體較小的魚一般均采用直接消化法.但由于肝臟中血管豐富，直接消化法會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞與血細(xì)胞混雜在一起，需進(jìn)一步的分離.另外如消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還會(huì)影響肝臟細(xì)胞的活力.

因此，在本研究嘗試采用低溫消化，多次分級(jí)離心的方法得到了較好的細(xì)胞純度及產(chǎn)量.

LPL是脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其參與各種脂蛋白的代謝并對(duì)其進(jìn)行調(diào)控.使血漿中富含脂質(zhì)的脂蛋白降解，以供機(jī)體組織儲(chǔ)存和利用，因此與機(jī)體的脂質(zhì)代謝及肥胖密切相關(guān)［2～3］.對(duì)人等哺乳動(dòng)物的研究表明，肝臟LPL基因僅在胚胎期表達(dá)，出生后不久即被關(guān)閉［8～9］，而魚類肝臟已證實(shí)存在具有LPL活性.本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明其活性及基因表達(dá)受飼料中脂肪水平和脂肪來(lái)源的調(diào)控［4］，其他研究者也有類似的發(fā)現(xiàn)［10，11］.相關(guān)研究顯示，不同脂肪酸對(duì)魚類脂類代謝的影響很大程度上與不飽和脂肪酸，尤其與高度不飽和脂肪酸的差異有關(guān)［2，10－12］.本研究表明，隨脂肪酸的不飽和程度增加，LPLmRNA的表達(dá)顯著提高，特別是添加了DHA和EPA后其表達(dá)量增加至最大，這與以上的研究結(jié)果類似.

PPARα是一個(gè)樞紐型的轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟、骨骼肌及腎臟中高度表達(dá)，主要是通過(guò)配體結(jié)合后的活化而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng).作為依賴配體的核轉(zhuǎn)錄因子，PPARα與9－順式視黃酸類受體(RXR)形成異二聚體后，PPARα－RXR復(fù)合物與靶基因啟動(dòng)子上的特異DNA反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用.目前已知天然配體有亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸代謝產(chǎn)物白三烯等.Ruby等［14］發(fā)現(xiàn)，極低密度脂蛋白(VLDL)水解所釋放的脂肪酸作為配體可以激活PPARα.PPARα調(diào)控與甘油三酯(TG)、VLDL代謝相關(guān)的載脂蛋白(Apo)CIII和LPL關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn) TG和 VLDL代謝［15］.Rudkowska等［16］報(bào)道，在人肝細(xì)胞HepG2培養(yǎng)液中添加n－3脂肪酸可以通過(guò)PPARα促進(jìn)LPL的轉(zhuǎn)錄活性.Rakhshandehroo等［17］利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，活化或阻斷肝組織PPARα能夠調(diào)控一系列與脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，包括激素敏感脂肪激酶(HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)等.梁旭芳等已發(fā)現(xiàn)真鯛LPL基因5'側(cè)翼區(qū)序列中存在順式元件－－過(guò)氧化酶體增殖物反應(yīng)元件，同時(shí)發(fā)現(xiàn)飼料中脂肪酸的不飽和度影響LPL的表達(dá)，因此推斷脂肪酸通過(guò)氧化代謝來(lái)促進(jìn)PPAR表達(dá)對(duì)真鯛肝臟LPL基因表達(dá)水平的作用應(yīng)大于脂肪酸直接作為配基激活LPL基因表達(dá)的影響［10］.本研究發(fā)現(xiàn)，LPL和PPARα受脂肪酸不飽和程度的影響具有一致性，但究竟二者之間以何種關(guān)系相互關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步探討.

NADPH是動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成及其碳鏈延長(zhǎng)的重要輔酶，是脂肪酸還原合成中氫的供給者，體內(nèi)NADPH供應(yīng)情況直接影響脂肪及類脂的合成.脂肪代謝酶主要包括能生成 NADPH的酶，如乙酰CoA羧化酶 (ACX)、MDH、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、葡萄糖 －6－磷酸脫氫酶(G－6－PDH)等［18］.周繼術(shù)［3］對(duì)鯉肝胰臟該兩類酶的研究發(fā)現(xiàn)，魚油組鯉肝胰臟MDH、G－6－PDH活力均低于富含亞油酸的對(duì)照組，且MDH的活性顯著降低，顯示出富含EPA、DHA的魚油抑制了鯉肝胰臟脂質(zhì)合成，這與EPA、DHA比亞油酸更能有效抑制大鼠肝臟中脂肪酸合成酶活性一致［19］.本研究發(fā)現(xiàn)，DHA可明顯降低MDH mRNA的表達(dá)，MDH與PPARα之間并無(wú)顯著關(guān)聯(lián).

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