新型Rho激酶抑制劑WAR5治療EAE的初步研究*

丁智斌， 張 輝， 楊興旺， 張海飛， 尉杰忠， 李艷花，劉春云， 楊婉芳， 李俊蓮， 馮前進(jìn)， 趙永飛， 肖保國，， 馬存根，△

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，其病理特征是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫攻擊導(dǎo)致髓鞘脫失和軸突損害。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)與MS臨床癥狀和病理過程較為相似，是目前國際公認(rèn)的研究 MS的動物模型［1］。Rho/Rho激酶(Rho kinase，ROCK)信號通路是機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種信號通路，主要參與血管收縮、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生命活動。近年的研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥變性疾病如MS、阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)及肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等病理過程中，ROCK的異常激活發(fā)揮著重要的作用［2］。

鹽酸法舒地爾(fasudil)是臨床和科研上常用的ROCK抑制劑，目前已有眾多研究報道 fasudil在EAE方面的療效及作用機(jī)制［3］。但是，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，fasudil盡管有效，但也存在著治療的安全窗比較小(小鼠40 mg/kg給藥后出現(xiàn)明顯的血管擴(kuò)張，部分動物死亡)、給藥途徑單一、藥物使用的持續(xù)時間不能太長等缺點(diǎn)，特別不易長期使用，限制其長期用于治療MS的臨床應(yīng)用。因此，本研究的重點(diǎn)在于探索發(fā)現(xiàn)新型、可以有效治療EAE的ROCK抑制劑，為后期比較不同異構(gòu)體的量效學(xué)、藥代動力學(xué)及藥理學(xué)、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本研究組篩選到一個fasudil異構(gòu)體WAR5化合物，發(fā)現(xiàn)其可以有效地抑制EAE的起病，減輕其臨床癥狀，減少CNS炎癥細(xì)胞的浸潤及抑制髓鞘的脫失，其可能的機(jī)制是誘導(dǎo)M1型致炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M2型抗炎巨噬細(xì)胞。

材料和方法

1 動物和材料

雌性C57BL/6小鼠16只，8～10周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華公司。小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35－55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35 －55 peptide，MOG35－55)由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成;百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自Alexis;完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購自 Sigma;結(jié)核分枝桿菌(Tuberculosis bacili，TB)購自Becton Dickinson(BD);流式細(xì)胞儀為BD FACS Calibur產(chǎn)品。Flour-488-F4/80、PE-CD16/32和PE-CD206抗體等購自BD。凝膠成像分析儀購自Bio-Rad;BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore;WAR5化合物由天津紅日藥業(yè)股份有限公司饋贈。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥處理 C57BL/6雌性小鼠實(shí)驗(yàn)前在無特殊病原菌實(shí)驗(yàn)室經(jīng)正常喂養(yǎng)1周后，按平均體重隨機(jī)均分為EAE組(n=8)和WAR5組(n=8)。將 MOG35－55肽段4 mg溶于0.8 mL生理鹽水中，4.8 mg TB溶于0.8 mL完全弗氏佐劑;采用針管混合器將等體積2種溶液體充分混合為油包水樣乳白色混懸液，乳劑靜置后無分層即為合格。乙醚麻醉小鼠后，按每只0.1 mL給予各組小鼠脊柱背側(cè)中線兩側(cè)，分4點(diǎn)皮下注射。在免疫當(dāng)天和48 h后，各組小鼠分別腹腔注射百日咳毒素每只每次750 ng。

WAR5組于免疫后第3天起隔天腹腔注射WAR5化合物(40 mg/kg)。EAE組以等量的生理鹽水腹腔注射作為對照。各組腹腔注射持續(xù)至免疫后第27天。臨床評分采用國際通用的5分評分制進(jìn)行:無任何臨床癥狀計(jì)為0分;尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙計(jì)為1分;一側(cè)后下肢無力，被動翻身后可以恢復(fù)計(jì)為2分;雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動計(jì)為3分;雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓計(jì)為4分;瀕死狀態(tài)或死亡計(jì)為5分。癥狀介于兩個標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計(jì)。累積臨床評分［4］為每組每只小鼠自發(fā)病當(dāng)天起(疾病評分≥1)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束評分的總和。

2.2 標(biāo)本采集 免疫后28 d，采用0.3%戊巴比妥鈉每只0.2 mL腹腔麻醉后取脾臟，制備成單個核細(xì)胞懸液。同時，動物用生理鹽水心臟灌注，各組50%動物(4只)快速冰上解剖腦和脊髓組織，勻漿后提取蛋白，定量后采用Western blotting技術(shù)檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS);各組其余50%動物(4只)用4%多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定，然后分離脊髓，OCT(optimum cutting temperature)包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做厚度為10 μm的冰凍切片，進(jìn)行髓鞘和HE染色。2.3 HE染色 將脊髓冰凍切片水中浸泡2 min，蘇木精染色4 min，快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s，0.5%伊紅30 s，快速水洗，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤情況。

2.4 髓鞘染色 取冰凍切片于70%乙醇中浸泡15 min，浸于固藍(lán)液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質(zhì)與白質(zhì)能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察髓鞘脫失情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 小鼠脾細(xì)胞懸于50 μL 0.1%皂苷(saponin)/1%BSA-PBS破膜劑或1%BSA-PBS 緩沖液中，分別加 1 μL Flour-488-F4/80、PE-CD16/32和 PE-CD206抗體，室溫避光20 min。PBS洗2次各加500 μL PBS，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.6 Western blotting 稱量腦和脊髓組織后置玻璃勻漿管，用組織裂解液在4℃條件下抽提組織蛋白。按需配制適量BCA工作液(試劑A與試劑B按體積50∶1，充分混勻)。用BAS標(biāo)準(zhǔn)蛋白作曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式，計(jì)算待測樣品的蛋白濃度。然后置－80℃保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。取定量蛋白樣品(約30 μg)與等體積的 Laemnli上樣緩沖液混勻，100℃水浴5 min，用10%SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，用轉(zhuǎn)移緩沖液平衡凝膠和硝酸纖維膜15～30 min，40 V室溫濕式電轉(zhuǎn)移2 h。膜置于5%脫脂牛奶封閉液，搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h。用5%脫脂牛奶分別稀釋抗 iNOS(1∶500)和抗 GAPDH(1∶50 000)，分別加至膜上，4℃孵育過夜。次日1∶1 000稀釋相應(yīng)熒光偶聯(lián)的抗兔Ⅱ抗，室溫孵育45 min。洗膜后使用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測染色條帶強(qiáng)度，以檢測蛋白條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH的吸光度比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示，采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 WAR5化合物推遲EAE起病時間和嚴(yán)重程度

EAE小鼠從免疫后第8天開始相繼發(fā)病。首先出現(xiàn)精神萎靡、皮毛不滑、食欲及體重下降、尾部及四肢肌力下降甚至消失，臨床評分最高可達(dá)4.5分。EAE對照組8只小鼠全部發(fā)病(100%)，沒有死亡，平均起病時間為(12.17±2.40)d，平均最高評分為2.83±1.25，累計(jì)臨床評分為31.50±15.32;WAR5組小鼠平均起病時間為(16.33±2.08)d(P＜0.05)，平均最高臨床評分為 0.13±0.25(P＜0.01)，WAR5組累計(jì)臨床評分為0.25±0.5，見圖1。WAR5組在推遲起病時間和減輕臨床癥狀的同時減少體重的減輕，與EAE組比較P＜0.01，見圖1。

Figure 1.WAR5 delayed the onset of EAE and attenuated the severity of EAE.Mean±SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs WAR5.圖1 臨床評分和體重變化的比較

2 WAR5化合物減少CNS炎癥細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失

HE染色顯示臨床癥狀較重的EAE對照小鼠脊髓呈現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，尤以腰膨大處炎癥細(xì)胞浸潤更為明顯，HE染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示EAE對照組脊髓白質(zhì)區(qū)炎癥浸潤細(xì)胞計(jì)數(shù)為480.00±96.39，WAR5組為64.00±45.22，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2A。髓鞘染色顯示EAE對照組脊髓白質(zhì)出現(xiàn)大量髓鞘脫失，而WAR5組則有效抑制髓鞘的脫失。EAE對照組髓鞘脫失與白質(zhì)面積比值為(20.43±4.55)%，WAR5組為(2.10±1.32)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2B。

Figure 2.WAR5 inhibited inflammation and demyelination in the spinal cord of EAE mice.A:HE staining，a number of inflammatory cells in whole spinal cord were calculated by Image-Pro Plus software;B:Luxol fast blue staining，pixel area(%)of demyelination in total white matter was calculated by Image-Pro Plus software.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs EAE group.圖2 EAE組和WAR5組小鼠的脊髓HE染色和髓鞘染色

3W AR5化合物促使M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化

流式細(xì)胞術(shù)檢測M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD16/32和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EAE組相比，WAR5化合物可抑制M1型細(xì)胞CD16/32的表達(dá)(P＜0.01)。我們還發(fā)現(xiàn)WAR5治療可使M2型細(xì)胞的CD206表達(dá)呈增高趨勢。WAR5組表達(dá)比值明顯低于EAE對照組，差異顯著(P＜0.01)，見圖3。結(jié)果提示W(wǎng)AR5化合物腹腔給藥可以誘導(dǎo)炎癥M1型巨噬細(xì)胞向抗炎M2型轉(zhuǎn)化。

Figure 3.The effects of WAR5 compound on the splenic macrophages.The cells were stained with macrophage marker F4/80 and M1/M2 markers，and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry.Representative dot plots from 1 of 3 experiments with the similar results are showed.The results are expressed as the percentage of double positive cells in four-quadrant diagram.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs EAE group.圖3 WAR5對脾巨噬細(xì)胞的影響

4W AR5化合物抑制EAE脊髓iNOS的表達(dá)

Western blotting顯示，EAE組小鼠脊髓中iNOS表達(dá)明顯高于腦。WAR5化合物治療顯著抑制脊髓內(nèi)iNOS的表達(dá)(P＜0.05)。腦內(nèi)iNOS的表達(dá)相對較低，WAR5化合物治療明顯抑制腦內(nèi)iNOS的表達(dá)(P＜0.05)，見圖4。結(jié)果提示W(wǎng)AR5抑制EAE小鼠腦和脊髓的iNOS水平，從而減輕脊髓炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的脫髓鞘病變和臨床癥狀。

Figure 4.WAR5 compound inhibited the expression of iNOS in the tissues of brains and spinal cords.Mean±SD.n=8.*P ＜0.05 vs EAE group.圖4 WAR5抑制腦和脊髓iNOS的表達(dá)

討 論

MS病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，仍缺乏特異性和有效性的治療手段。目前臨床應(yīng)用的治療藥物包括疾病修飾藥物(disease-modifying agents，DMA)、干擾素IFN-β和醋酸格拉默(glatiramer acetate，GA)等。這些藥物通過減少發(fā)作次數(shù)和發(fā)作的嚴(yán)重程度進(jìn)而改善疾病病程。IFN-β長期使用會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，導(dǎo)致藥物的有效性降低。另外，由于這類藥物價格貴等經(jīng)濟(jì)原因，因此極大地限制了在中國MS患者中的推廣使用?？鼓[瘤藥物米托蒽醌(mitoxantrone)等免疫調(diào)節(jié)藥物也可用于治療MS，作用機(jī)制與干擾DNA合成及免疫調(diào)節(jié)作用、抑制體液免疫、減少T細(xì)胞激活等有關(guān)。但其骨髓抑制和劑量相關(guān)心臟毒性等嚴(yán)重副作用限制了它的臨床應(yīng)用。利妥昔單抗(美羅華)也可用于MS的治療，但其發(fā)生進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(progressive multifocal leukoencephalopathy，PML)的風(fēng)險較高，只限于復(fù)發(fā)－緩解型、治療失敗、疾病活動持續(xù)不斷、其它藥物不能耐受及病初急劇惡化的患者［5］。其它藥物如氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素A和環(huán)磷酰胺可對進(jìn)展型MS治療有效，但仍存在骨髓抑制等嚴(yán)重的毒副作用。干細(xì)胞移植為基因介導(dǎo)修復(fù)損害的CNS組織提供了一種新的治療方法，但仍存在一些理論和技術(shù)方面的問題，有待進(jìn)一步完善和規(guī)范。因此，從中國MS患者的實(shí)際出發(fā)，尋找和研發(fā)新的有效而且副作用小的MS治療藥物就顯得越來越迫切。

越來越多的證據(jù)表明，炎癥機(jī)制在EAE發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用［6］。Feske 等［7］指出，fasudil作為一種ROCK抑制劑可以促進(jìn)神經(jīng)軸突生長、減少炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的聚集和釋放、保護(hù)受損神經(jīng)元、減輕Rho激酶源性微血管通透性增加。同時，Takeda等［8］發(fā)現(xiàn)，ROCK抑制劑還可減少炎癥細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙、聚集，進(jìn)而對血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)起到保護(hù)作用。此外，還可抑制免疫細(xì)胞的活化，減少炎癥細(xì)胞向CNS遷移和聚集。Phares等［9］發(fā)現(xiàn)在中樞免疫過程中，CD4+T細(xì)胞參與了BBB通透性的破壞，而CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞并未參與。Sun等［10］應(yīng)用fasudil治療EAE，發(fā)現(xiàn)IL-17和IFN-γ等促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)明顯下調(diào)，炎癥反應(yīng)顯著減輕。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，fasudil可明顯改善EAE小鼠臨床癥狀，抑制occludin的表達(dá)［11］，還可下調(diào)NF-κB［12］，減少CNS炎癥浸潤和髓鞘脫失。

目前發(fā)現(xiàn)fasudil競爭性與ROCK催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，對ROCK I和ROCK II具有相同的阻斷作用。還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域氨基酸序列有高度的同源性，因此它對ROCK選擇性有限和拮抗PKA、PKG、PKC等蛋白激酶，有可能會造成其它不良反應(yīng)。通過對fasudil的結(jié)構(gòu)優(yōu)化尋找新的化合物，以便得到一些作用更強(qiáng)、選擇性更高的藥物成為目前亟待解決的問題。因此，我們在fasudil的基礎(chǔ)上，選擇性地合成新衍生物——WAR5化合物。采用成熟的MOG35－55誘導(dǎo)EAE模型，通過觀察臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)WAR5化合物治療可延遲EAE小鼠起病時間，降低發(fā)病率，緩解EAE的癥狀，減少體重丟失;病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病灶處浸潤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，抑制髓鞘脫失;降低腦和脊髓iNOS的表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷、組織壞死及炎癥反應(yīng)。通過與前人的研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)WAR5與fasudil一樣，也對EAE有良好的治療作用。更重要的是，我們在近期的藥物量效實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)WAR5化合物具有安全窗大、擴(kuò)血管作用弱、給藥后動物的存活率高等優(yōu)點(diǎn)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

已有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型，在EAE的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用［13］。Fasudil體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，其可直接促進(jìn)M1炎癥型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化［14］，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了fasudil可使表達(dá)高氧化應(yīng)激產(chǎn)物和促炎癥因子的M1型巨噬細(xì)胞向抑制免疫炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)作用的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化［15］。我們對WAR5的研究也發(fā)現(xiàn)，WAR5化合物治療可明顯降低M1型表面標(biāo)志CD16/32的表達(dá)，增加M2型表面標(biāo)志CD206的表達(dá)，表現(xiàn)為M1型與M2型巨噬細(xì)胞比值降低，其平衡明顯偏向M2表型。說明WAR5化合物與fasudil的作用機(jī)制也具有相似性，即可誘導(dǎo)M1炎癥型巨噬細(xì)胞向M2抗炎型巨噬細(xì)胞分化。

綜上所述，WAR5化合物與fasudil均可有效改善EAE的臨床癥狀，抑制CNS炎癥病灶并改善髓鞘脫失，其作用機(jī)制也均與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極性、抑制系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。這一結(jié)果為我們今后比較fasudil與WAR5化合物的量效學(xué)、藥代動力學(xué)以及藥理學(xué)、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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