金絲桃素提取物穩(wěn)定性考察＊

王金林 ，李前瓊 ，，王曉利 ，何利思 ，張俊松 ，張德志

(1．深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055;2．廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

貫葉金絲桃 Hypericum performatum L．為藤黃科金絲桃屬的多年生草本，味苦、辛，性平，作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、收斂止血、利濕等功效，國外常用于多種疾病的治療，如抑郁癥、刀傷、腫瘤等。貫葉金絲桃含有多種具生物活性的化學(xué)成分，其中主要活性成分為萘駢二蒽酮類化合物金絲桃素(HY)和偽金絲桃素(PHY)，具有抗病毒、抗抑郁、抗腫瘤等藥理活性[1-3]。因此，萘駢二蒽酮類成分和金絲桃素含量常作為評價貫葉金絲桃藥材、提取物及其制劑質(zhì)量的指標(biāo)[4-5]。根據(jù)貫葉金絲桃提取物行業(yè)標(biāo)準，其總金絲桃素含量需大于0．3%。但HY及PHY穩(wěn)定性較差，尤其在光照、高溫條件下易被氧化。Karioti等[6]的研究表明，在自然條件下HY純品4 d內(nèi)損失20%。本研究中利用納米微球材料分離純化得到了總金絲桃素含量較高的提取物，并采用高效液相色譜法，考察光照、溫度和抗壞血酸對HY提取物中HY及PHY含量的影響，考察HY，PHY在提取物中的穩(wěn)定性，旨在為HY的分離提取、純化及應(yīng)用等條件的設(shè)定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20A型高效液相色譜儀，包括含SPD-M20A二極管陣列檢測器，LC-20AT輸液單元，CBM-20Alite系統(tǒng)控制器，島津LC-20A配套處理軟件LC-solution;KQ2200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);pH計(Thermo公司);SY100型恒溫式水浴鍋(常州精密儀器有限公司)。HY純品(瑞士Alexis公司，批號為L15535/a，純度大于99%);PHY標(biāo)準品(瑞士Alexis公司，批號為L21505/a，純度大于99%);HY提取物(實驗室自制，HY 含量為 0．282 g/L，PHY 含量為 0．470 g/L);L-抗壞血酸(上?；瘜W(xué)試劑廠);甲醇為色譜純(天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 HY和PHY含量測定

采用高效液相色譜法檢測HY提取物中HY和PHY的含量。色譜條件:色譜柱為 Kromasil-C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為甲醇 -0．006 mol/L Na2HPO4(7 ∶1 v/v，H3PO4調(diào) pH 為6．5)，流速為 1．0 mL/min，柱溫為 30 ℃，檢測波長為 590 nm。按上述色譜條件測定，HY提取物中HY的含量為0．282 g/L，PHY含量為 0．470 g/L。

2．2 HY提取物短期穩(wěn)定性影響因素考察

光照:取HY提取物供試品，分別在常溫光照、常溫避光條件下測定 1，2，3，6，12 h及 1，2，3 d時 HY 及 PHY 的含量。結(jié)果見表1?？梢?，提取物中的HY及PHY含量在光照后均有升高，其中HY在光照1 h后含量最高，3 h后開始逐漸降低;而PHY在光照2 h后含量最高，3 h后也開始逐漸降低。避光條件下，HY提取物穩(wěn)定性較好，HY及PHY含量無明顯變化。

溫度:取HY提取物供試品，分別置50，60，70，80℃恒溫水浴中，避光。每隔1h測定供試品中HY及PHY的含量。結(jié)果見表2?？梢?，4 h內(nèi)HY提取物在50℃和60℃下保持穩(wěn)定，HY及PHY含量未發(fā)生明顯變化(P＞0．05);而在70℃和80℃下穩(wěn)定性降低，HY及PHY含量明顯下降(P＜0．05)。

抗壞血酸:抗壞血酸能提高金絲桃素純品的穩(wěn)定性[3]。精密稱取0．025 g抗壞血酸置25 mL容量瓶中，用HY提取物溶液超聲溶解，定容，配制成抗壞血酸含量為0．1%的樣品。分別在常溫光照、常溫避光條件下測定 1，2，3，6，12 h 及 1，2，3 d 時 HY，PHY的含量。加入抗壞血酸后，HY提取物的穩(wěn)定性與光照后類似。結(jié)果見表3。

表1 光照對HY提取物穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

表1 光照對HY提取物穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

時間1 h 2 h 3 h 6 h 12 h 1 d 2 d 3 d光照 避光HY 0．303 ± 0．000 0．302 ± 0．001 0．301 ± 0．000 0．297 ± 0．000 0．292 ± 0．002 0．290 ± 0．002 0．285 ± 0．000 0．282 ± 0．000 PHY 0．642 ± 0．022 0．725 ± 0．001 0．721 ± 0．001 0．713 ± 0．002 0．705 ± 0．002 0．699 ± 0．001 0．688 ± 0．001 0．682 ± 0．001 HY 0．282 ± 0．000 0．282 ± 0．000 0．282 ± 0．001 0．283 ± 0．000 0．285 ± 0．000 0．284 ± 0．001 0．285 ± 0．000 0．285 ± 0．001 PHY 0．480 ± 0．010 0．479 ± 0．001 0．479 ± 0．001 0．481 ± 0．003 0．482 ± 0．009 0．483 ± 0．001 0．483 ± 0．001 0．477 ± 0．001

2．3 HY提取物長期穩(wěn)定性影響因素考察

光照及溫度:取HY提取物，分別在常溫光照、常溫避光和低溫(-24 ℃ )避光條件下存放，于 1，2，4，6，8 周時測定 HY 和PHY的含量。結(jié)果見表4?？梢?，常溫光照8周后，HY含量下降49．3%，PHY含量下降20．0%;常溫避光8周后，HY含量下降8．5%，PHY含量下降6．0%。而低溫避光保存的HY提取物，HY和PHY含量均未發(fā)生變化。

表2 短期內(nèi)溫度對HY穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

表2 短期內(nèi)溫度對HY穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

注:與加熱前比較:＊P ＜0．05。

時間 50℃ 60℃ 70℃ 80℃1 h 2 h 3 h 4 h HY 0．282 ± 0．002 0．283 ± 0．099 0．284 ± 0．093 0．284 ± 0．090 PHY 0．470 ± 0．012 0．476 ± 0．010 0．482 ± 0．003 0．484 ± 0．002 HY 0．284 ± 0．002 0．283 ± 0．099 0．284 ± 0．093 0．283 ± 0．090 PHY 0．467 ± 0．004 0．467 ± 0．001 0．468 ± 0．002 0．466 ± 0．004 HY 0．282 ± 0．003 0．281 ± 0．098 0．280 ± 0．092 0．276 ± 0．089＊PHY 0．464 ± 0．006 0．464 ± 0．002 0．463 ± 0．001 0．456 ± 0．001＊HY 0．278 ± 0．002 0．276 ± 0．097 0．274 ± 0．091 0．270 ± 0．088＊PHY 0．462 ± 0．001 0．458 ± 0．002 0．457 ± 0．008 0．448 ± 0．003＊

表3 抗壞血酸對HY穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

表3 抗壞血酸對HY穩(wěn)定性的影響(，g/L，n=3)

時間 光照 避光1 h 2 h 3 h 6 h 12 h 1 d 2 d 3 d HY 0．311 ± 0．002 0．309 ± 0．001 0．307 ± 0．001 0．304 ± 0．002 0．299 ± 0．000 0．289 ± 0．001 0．285 ± 0．002 0．279 ± 0．002 PHY 0．723 ±0．004 0．721 ±0．006 0．719 ±0．002 0．706 ±0．004 0．700 ±0．001 0．684 ±0．004 0．674 ±0．004 0．665 ±0．005 HY 0．281 ±0．000 0．281 ±0．001 0．282 ±0．001 0．281 ±0．000 0．281 ±0．000 0．282 ±0．001 0．281 ±0．001 0．281 ±0．000 PHY 0．471 ± 0．001 0．471 ± 0．002 0．471 ± 0．000 0．470 ± 0．000 0．470 ± 0．001 0．472 ± 0．001 0．471 ± 0．001 0．471 ± 0．001

表4 HY提取物的中長期穩(wěn)定性試驗(，g/L，n=3)

表4 HY提取物的中長期穩(wěn)定性試驗(，g/L，n=3)

時間(周)常溫光照 常溫避光 低溫避光HY PHY HY PHY HY PHY 0．256 ±0．001 0．231 ±0．001 0．183 ±0．000 0．157 ±0．030 0．143 ±0．001 1 2 4 6 8 0．623 ±0．010 0．564 ±0．002 0．460 ±0．002 0．411 ±0．001 0．375 ±0．000 0．282 ± 0．001 0．278 ± 0．001 0．274 ± 0．002 0．269 ± 0．000 0．258 ± 0．000 0．472 ±0．003 0．470 ±0．000 0．457 ±0．000 0．453 ±0．002 0．441 ±0．001-0．283 ± 0．001 0．283 ± 0．002 0．281 ± 0．000 0．282 ± 0．001-0．471 ±0．001 0．471 ±0．001 0．472 ±0．002 0．470 ±0．002

抗壞血酸:取2．2項下抗壞血酸-HY提取物樣品，分別在常溫、光照和常溫、避光條件下測定 1，2，4，6，8周時 HY及 PHY的含量。結(jié)果見表5。在抗壞血酸存在的條件下，HY提取物中HY及PHY含量反而下降劇烈。其中，HY含量在光照和避光條件下分別下降71．3%和34．0%，PHY含量下降45．6%和27．3%。

表5 抗壞血酸對HY提取物中長期穩(wěn)定性影響(

3 討論

在考察光照條件對HY提取物穩(wěn)定性的影響時，光照1 h后HY及PHY含量并未降低反而略有升高。其原因可能是HY提取物中所含有的一些HY及PHY的前體物質(zhì)，如原金絲桃素(protohypericin)、原偽金絲桃素(protopseudohypericin)，在光照條件下，原金絲桃素可轉(zhuǎn)化為HY，原偽金絲桃素可轉(zhuǎn)化為PHY[7]。

王曉菊等[8]認為，加入抗壞血酸有助于提高HY的穩(wěn)定性。本研究在考察抗壞血酸對HY提取物短期穩(wěn)定性影響時，加入抗壞血酸與未加抗壞血酸的樣品穩(wěn)定性相類似。但考察其對HY提取物長期穩(wěn)定性影響時，加入抗壞血酸使HY提取物中HY及PHY含量下降較明顯，甚至比未加抗壞血酸的樣品穩(wěn)定性更差。其原因可能為抗壞血酸具有酸性調(diào)節(jié)作用，而HY和PHY在酸性條件下不穩(wěn)定，具體原因尚待進一步研究。

HY提取物短期內(nèi)，在常溫避光及加抗壞血酸條件下較為穩(wěn)定;光照能使提取物中HY及PHY含量短時間內(nèi)升高，然后下降;在高溫下，提取物穩(wěn)定性差。HY提取物長期存放在常溫光照、常溫避光及加抗壞血酸條件下，HY及PHY含量均有不同程度地下降，在低溫避光條件下比較穩(wěn)定。因而在HY提取物的分離提取和純化工藝及HY提取物的臨床應(yīng)用過程中，應(yīng)盡量避免光照和高溫，長期貯存HY提取物應(yīng)置低溫避光條件下。在HY提取物的長期保存過程中不應(yīng)加入抗壞血酸。

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