內(nèi)生細(xì)菌YBS106對棉花的誘導(dǎo)抗性研究

林天興++管芩瀾++龔明福

摘 要：本實驗以從一把傘南星（Arisaema erubescens（Wall.）Schott）組織分離到的內(nèi)生細(xì)菌YBS106對三葉一心棉苗進(jìn)行灌根誘導(dǎo)，同時挑戰(zhàn)接種棉花枯萎病菌或棉花黃萎病菌，測定YBS106誘導(dǎo)對棉葉中抗性相關(guān)酶POD和PPO活性及與抗性相關(guān)的MDA和VC含量的影響，同時測定YBS106對棉花枯、黃萎病的相對防效。結(jié)果表明，YBS106誘導(dǎo)對POD和PPO活性及MDA和Vc含量均有顯著影響。YBS106能有效誘棉葉中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和MDA含量的減少，MDA和Vc含量在誘導(dǎo)后第5天達(dá)到最高，POD和PPO活性在誘導(dǎo)后第10天達(dá)到最高。病原菌挑戰(zhàn)接種100 d時，YBS106對棉花枯萎病菌和黃萎病菌的相對防效分別為64.24%和71.37%，這與棉花系統(tǒng)抗性相關(guān)的防御酶活及相關(guān)物質(zhì)（MDA和Vc）含量的變化趨勢吻合。該結(jié)果表明YBS106誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生了對棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌的系統(tǒng)抗性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細(xì)菌 棉花 棉花枯萎病菌 棉花黃萎病菌 誘導(dǎo)抗性

中圖分類號：G64 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2014）03（a）-0149-03

Disease-Resistance Induction in Cotton by Inoculation with Endophytic Bacteria Strains YBS106

Lin Tianxing Guan Qinlan Gong Mingfu

（Key Laboratory of Special Biological Resources in Mountain Emei.，School of Life Sciences，Leshan

Normal Uuniversity，Leshan Sichuan 614000，China）

Abstract：The induced resistance of Serratia marcescens strain YBS106 isolated from Arisaema erubescens（Wall.）Schott tissue to cotton fusarium and verticillium wilt was studied by measuring the change of the activities of defense enzymes（POD，PPO） and the contents of pathogenesis-related biochemicals（MDA，Vc）in cotton leaf inoculation with YBS106，F(xiàn)usarium oxysporum，Verticillium dahliae and the control effects of strain YBS106 against to F. oxysporum and V.dahliae in pot tests.The results indicated that YBS106 effectively increased POD and PPO activities，also promoted concentration of MDA and Vc.When the F.oxysporum or V.dahliae used with YBS106，respectively，the induced activities of POD，PPO and concentration of Vc were higher than that of only used F. oxysporum or V. dahliae，but concentration of MDA were lower.The concentration of MDA and Vc peaked 5 day after the treatment while the activities of POD and PPO reaehed their maximum 10 day after the treatrnent.The relative anti-bacterial effects of strain YBS106 against to F.oxysporum and V.dahliae in pot tests when 100 day inoculated pathogen were 64.24% and 71.37%，which is related to changes consistent trend of the defense enzymes activity and related substances（MDA and Vc）content.Systemic resistance in cotton against to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae could be induced by the antagonistic baeteria Serratia marcescens strain YBS106.

Key Words：Endophytic Bacteria；Cotton；Fusarium oxysporum；Verticillium dahliae；Induced resistanc

與抗病性相關(guān)的植物防御酶（如：過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD）的變化或誘導(dǎo)產(chǎn)生是植物遭到病原生物及逆境因子作用后維護(hù)其正常生長發(fā)育最重要的一種生理生化防御機(jī)制[1～2]。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化分解的終產(chǎn)物之一，植物組織中MDA的含量可以反映植物遭受病原生物及逆境因子傷害的程度[3]。抗壞血酸（Vc）是植物體內(nèi)的一種抗氧化劑，可直接清除O2-和·HO，并通過抗壞血酸氧化酶使H2O2轉(zhuǎn)化為水，當(dāng)植物遭受病原生物及逆境因子傷害時，可降低活性氧物質(zhì)對植物的毒害，使植物細(xì)胞保持正常生理功能[4]。endprint

本課題組從一把傘南星（Arisaema erubescens（Wall.）Schott）組織中分離到一株對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）具有高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌YBS106，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens），該菌可以產(chǎn)生活性產(chǎn)物抑制MRSA的生長。本試驗通過測定YBS106對棉花苗體內(nèi)過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO活性及MDA、Vc含量的變化情況，研究其對棉花系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)作用，為生防菌的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉花新陸早35號和軍海一號從市場購買，其中新陸早35號用于枯萎病實驗，軍海一號用于黃萎病實驗。S.marcescens YBS106由本課題組從A.erubescen中分離獲得，棉花枯萎病致病菌（Fusarium oxysporum）和棉花黃萎病致病菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Klebahn）從感病棉花植株中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PD配方參考《植病研究法》[5]。

1.3 接種前的準(zhǔn)備

挑取一環(huán)在NA平板上生長良好的YBS106接種于NB培養(yǎng)液中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，加入無菌水稀釋成濃度為108 CFU/ml的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液。棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌接于PD培養(yǎng)液中，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，稀釋制成106 CFU/ml濃度的孢子懸浮液。

1.4 接種處理

待棉苗長至三葉一心時用108CFU/ml的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液灌根接種，2 d后用106 CFU/ml濃度的病原真菌孢子懸浮液灌根進(jìn)行挑戰(zhàn)接種，分別于挑戰(zhàn)接種病原真菌后第0、5、10、15、20天取樣測定棉葉中的過氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO的活性，同時測定棉葉中丙二醛MDA和抗壞血酸（Vc）的含量。以無菌NB培養(yǎng)液灌根為對照，每處理重復(fù)三次，每重復(fù)100株。各處理分別為：只接種無菌NB培養(yǎng)液（CK）、只接種（YBS106）、只接種棉花枯萎病菌（MK）、只接種棉花黃萎病菌（MH）、接種YBS106后挑戰(zhàn)接種棉花枯萎病菌（YBS106-MK）、接種YBS106后挑戰(zhàn)接種棉花黃萎病菌（YBS106-MH）。

1.5 測定指標(biāo)

POD和PPO酶活以及MDA和Vc含量測定參照《植物生理學(xué)實驗技術(shù)》[6]進(jìn)行，以每克鮮葉重每分鐘OD470增加0.01為一個POD酶活性單位，以每克鮮葉重每分鐘OD525增加0.01為一個PPO酶活性單位。

出現(xiàn)病株后，觀察記錄發(fā)病株數(shù)，植株可見明顯枯萎或黃萎癥狀，即記為發(fā)病株，共觀察至接種病原菌100 d。

病情嚴(yán)重度分級如下。

0級：無癥狀，植株健康；1級：1～2片子葉局部發(fā)??；2級：子葉及一片真葉局部發(fā)病；3級：二片真葉發(fā)病或脫落僅剩心葉；4級：植株生長點或全株枯死。

發(fā)病率、病情指數(shù)及防效計算公式如下：

發(fā)病率（%）=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=（每個病級的植株數(shù)×級別數(shù)）×100/總植株數(shù)×最高級別數(shù)

相對防效（%）=（對照病情指數(shù)？處理病情指數(shù)）×100/對照病情指數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 YBS106誘導(dǎo)下棉葉中POD活性變化

在挑戰(zhàn)接種第0天各處理POD活性非常接近，第10天前逐漸增強(qiáng)，接種了拮抗菌或病原菌的處理其POD活性均比對照要高，增幅快。只接種拮抗菌的處理第10天以后POD活性逐漸下降，第15天以后和對照處于相同水平。挑戰(zhàn)接種了病原菌的4個處理其POD活性在第10天達(dá)到最高，隨后下降，其中接種了拮抗菌的2個處理比只接病原菌的2個處理POD活性升高和下降的速度都要快（見圖1）。

2.2 YBS106誘導(dǎo)下棉葉中PPO活性變化

在挑戰(zhàn)接種第0天各處理PPO活性非常接近，第5天普遍增強(qiáng)，接種了拮抗菌或病原菌的處理其PPO活性均比對照要高。只接種拮抗菌的處理第5天以后PPO活性逐漸下降，第10天以后趨于平穩(wěn)，略高于對照。挑戰(zhàn)接種了病原菌的4個處理其PPO活性在第10天達(dá)到最高，隨后下降，其中接種了拮抗菌的2個處理比只接病原菌的2個處理PPO活性升高和下降的速度都要快（見圖2）。

2.3 YBS106誘導(dǎo)下棉葉中MDA含量變化

在挑戰(zhàn)接種第0天各處理MDA含量近乎相同，第五天普遍增加，接種了拮抗菌或病原菌的處理其MDA含量均比對照要高。對照和只接種拮抗菌其MDA含量波動范圍不大。只挑戰(zhàn)接種了病原菌的2個處理第10天前MDA含量逐漸增加，10天以后逐漸下降，15天以后趨于平穩(wěn)。接種了拮抗菌并挑戰(zhàn)接種病原菌的2個處理第5天MDA含量達(dá)到最高，隨后逐漸下降，20天以后其MDA含量降至對照水平（見圖3）。

2.4 YBS106誘導(dǎo)下棉葉中Vc含量變化

在挑戰(zhàn)接種第0天各處理Vc含量近乎相同，第5天普遍增加，接種了拮抗菌或病原菌的處理其Vc含量均比對照要高。對照和只接種拮抗菌其Vc含量比較穩(wěn)定，變化不大。挑戰(zhàn)接種了病原菌的4個處理第5天前Vc含量逐漸增加，然后逐漸下降，其中接種了拮抗菌并挑戰(zhàn)接種病原菌的2個處理Vc含量的上升和下降速度均比只接種病原菌的2個處理要快（見圖4）。

2.5 YBS106接種對棉花枯黃萎病防治效果的影響

從盆栽實驗結(jié)果來看（表1），YBS106接種對棉花枯黃萎病均有較好的防治效果，至接種棉花枯黃萎病菌100 d時對棉花枯萎病菌和黃萎病菌的相對防效分別為64.24%和71.37%，但對不同病菌的防治效果存在差異。endprint

3 結(jié)論與討論

YBS106是本課題組從一把傘南星中分離到的一株對MRSA具有高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens）， 該菌主要通過產(chǎn)生活性產(chǎn)物抑制MRSA的生長。本研究結(jié)果表明，YBS106除了對病原性細(xì)菌有抑制作用外，還能誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。利用內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗性，有望成為棉花枯、黃萎病生物防治的重要措施。

YBS106雖然是從一把傘南星組織中分離獲得的，但與棉花也能形成較和諧的關(guān)系，只接種拮抗菌對棉花各項指標(biāo)影響不是很大，應(yīng)該是這種和諧關(guān)系的體現(xiàn)，但YBS106是否是通過定殖到棉花組織中起作用，還需要通過實驗加以證實。

同時接種拮抗菌YBS106和病原菌的處理的棉葉中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和減少的速度比只接種病原菌的要快，在最高點時均高于只接種病原菌的處理棉葉，而MDA含量趨勢剛好相反，這一結(jié)果與劉永鋒等[2]用YD4-6和NV11-4菌株誘導(dǎo)水稻防御性相關(guān)酶活性變化趨勢一致。該結(jié)果表明YBS106誘導(dǎo)后POD、PPO等防御酶及Vc等物質(zhì)對誘導(dǎo)抗性起重要作用，大大提高了棉花對病原菌的抗性，這種抗性的提高能夠通過MDA含量的變化反應(yīng)出來。YBS106接種對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均有較好的防治效果，這與棉花系統(tǒng)抗性相關(guān)的防御酶活及相關(guān)物質(zhì)（MDA和Vc）含量的變化趨勢吻合，這也說明YBS106接種誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。

參考文獻(xiàn)

[1] John A L.Plant immuneisation；from myth to SAR[J].Pestic Sci，1999，55：193-196.

[2] 劉永鋒，李美榮，陳志誼，等.YD4-6和NV11-4菌株抑菌活性及誘導(dǎo)水稻防御性相關(guān)酶活性變化[J].微生物學(xué)通報，2010，37（12）：1753-1759.

[3] 肖永森，王正直，郭百川.百葉枯病菌對雜交稻幼苗葉片中活性氧清除劑的影響[J].作物學(xué)報，1998，24（1）：118-122.

[4] 來玉賓.茶樹內(nèi)生細(xì)菌TL2分離鑒定及抗病機(jī)理的研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006，4.

[5] 方中達(dá).植病研究法[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[6] 蕭浪濤，王三根.植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，8.endprint

3 結(jié)論與討論

YBS106是本課題組從一把傘南星中分離到的一株對MRSA具有高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens）， 該菌主要通過產(chǎn)生活性產(chǎn)物抑制MRSA的生長。本研究結(jié)果表明，YBS106除了對病原性細(xì)菌有抑制作用外，還能誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。利用內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗性，有望成為棉花枯、黃萎病生物防治的重要措施。

YBS106雖然是從一把傘南星組織中分離獲得的，但與棉花也能形成較和諧的關(guān)系，只接種拮抗菌對棉花各項指標(biāo)影響不是很大，應(yīng)該是這種和諧關(guān)系的體現(xiàn)，但YBS106是否是通過定殖到棉花組織中起作用，還需要通過實驗加以證實。

同時接種拮抗菌YBS106和病原菌的處理的棉葉中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和減少的速度比只接種病原菌的要快，在最高點時均高于只接種病原菌的處理棉葉，而MDA含量趨勢剛好相反，這一結(jié)果與劉永鋒等[2]用YD4-6和NV11-4菌株誘導(dǎo)水稻防御性相關(guān)酶活性變化趨勢一致。該結(jié)果表明YBS106誘導(dǎo)后POD、PPO等防御酶及Vc等物質(zhì)對誘導(dǎo)抗性起重要作用，大大提高了棉花對病原菌的抗性，這種抗性的提高能夠通過MDA含量的變化反應(yīng)出來。YBS106接種對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均有較好的防治效果，這與棉花系統(tǒng)抗性相關(guān)的防御酶活及相關(guān)物質(zhì)（MDA和Vc）含量的變化趨勢吻合，這也說明YBS106接種誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。

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3 結(jié)論與討論

YBS106是本課題組從一把傘南星中分離到的一株對MRSA具有高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens）， 該菌主要通過產(chǎn)生活性產(chǎn)物抑制MRSA的生長。本研究結(jié)果表明，YBS106除了對病原性細(xì)菌有抑制作用外，還能誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。利用內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗性，有望成為棉花枯、黃萎病生物防治的重要措施。

YBS106雖然是從一把傘南星組織中分離獲得的，但與棉花也能形成較和諧的關(guān)系，只接種拮抗菌對棉花各項指標(biāo)影響不是很大，應(yīng)該是這種和諧關(guān)系的體現(xiàn)，但YBS106是否是通過定殖到棉花組織中起作用，還需要通過實驗加以證實。

同時接種拮抗菌YBS106和病原菌的處理的棉葉中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和減少的速度比只接種病原菌的要快，在最高點時均高于只接種病原菌的處理棉葉，而MDA含量趨勢剛好相反，這一結(jié)果與劉永鋒等[2]用YD4-6和NV11-4菌株誘導(dǎo)水稻防御性相關(guān)酶活性變化趨勢一致。該結(jié)果表明YBS106誘導(dǎo)后POD、PPO等防御酶及Vc等物質(zhì)對誘導(dǎo)抗性起重要作用，大大提高了棉花對病原菌的抗性，這種抗性的提高能夠通過MDA含量的變化反應(yīng)出來。YBS106接種對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均有較好的防治效果，這與棉花系統(tǒng)抗性相關(guān)的防御酶活及相關(guān)物質(zhì)（MDA和Vc）含量的變化趨勢吻合，這也說明YBS106接種誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。

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[4] 來玉賓.茶樹內(nèi)生細(xì)菌TL2分離鑒定及抗病機(jī)理的研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006，4.

[5] 方中達(dá).植病研究法[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[6] 蕭浪濤，王三根.植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，8.endprint