外源植物激素對NaCl脅迫下苦馬豆苗期脯氨酸代謝的影響

王若夢,董寬虎,李鈺瑩,李晨,楊靜芳

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 山西 太谷 030801)

植物激素對植物的抗逆性有著重要的作用。植物處于逆境條件下，自身生理調(diào)節(jié)物質(zhì)以及次生代謝產(chǎn)物會發(fā)生顯著變化，外源施加植物激素可有效提高植物對外界不利環(huán)境的抵抗能力[1-3]。有研究表明，外源ABA可有效提高植物對鹽分的適應(yīng)性，并且可以促進某些抗逆性蛋白和酶的生成，提高自身的抗逆性[4-5]；細胞分裂素類物質(zhì)促進鹽脅迫下種子的萌發(fā)，提高了植物自身的激素含量[6]。可見，不同的植物激素，對植物生理生化都有重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]，而且對逆境環(huán)境有顯著抵抗作用[9-13]。但是就目前的研究狀況來看，對于植物激素的研究和應(yīng)用主要集中在園藝、園林等具有觀賞性的植物[6,14]，而對牧草抗逆性提高和適應(yīng)逆境環(huán)境的研究并不多，因此還有待進一步的探討。

苦馬豆(Swainsoniasalsula)系豆科苦馬豆屬(Sphaerophysa)多年生草本植物。為耐鹽堿的中旱生植物，主要分布于我國中西部地區(qū)的鹽堿草地、河岸低濕地，是防止草地退化和保持水土的重要植物[15]。目前苦馬豆的研究主要集中在藥理方面[16-17]。在苦馬豆耐鹽生長方面，已有研究表明，鹽脅迫抑制苦馬豆細胞膜修復(fù)，造成苦馬豆種子萌發(fā)推遲和發(fā)芽勢下降[18]。本試驗通過對苦馬豆進行不同濃度的NaCl脅迫，同時施以外源植物激素(6-BA和ABA)，對其生長速率、根冠比、脯氨酸 (Pro) 含量及脯氨酸代謝酶活性進行測定，通過其變化探討鹽脅迫下，外源植物激素對苦馬豆抗鹽性和脯氨酸代謝的影響，為進一步研究外源植物激素對苦馬豆耐鹽性的影響和培育耐鹽苦馬豆品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用苦馬豆種子于2010年秋采自山西省原平市大營村滹沱河畔的鹽堿化草地，東經(jīng)112°47′32.8″，北緯38°56′21.3″，海拔820 m。

1.2 試驗方法

試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系日光能溫室進行，溫室內(nèi)溫度16～32℃，濕度60%～85%，栽培基質(zhì)采用蛭石和珍珠巖1∶1(v/v)比例混合，裝入育苗盆內(nèi)，插入PVC管，便于Hoagland完全營養(yǎng)液澆灌。試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，播種量為100粒/盆，播種72盆，出苗1周后，3 d使用1次營養(yǎng)液，于下午6：00-7：00進行。采用稱重法以蒸餾水補充每日失水。出苗30 d后，選取長勢相對均勻的植株進行定株，每盆定苗20株。定苗2周后進行鹽脅迫，試驗以NaCl進行脅迫，濃度為0，80，160，240，320，400，480，560 mmol/L 8個鹽分濃度梯度，3次重復(fù)，每次脅迫以含相應(yīng)濃度的營養(yǎng)液為處理液，按照各個處理的不同鹽分濃度，平均7次加入，最終達到各自相應(yīng)的NaCl處理濃度。對照只進行營養(yǎng)液的澆灌。鹽脅迫期間，每日下午6：00-7：00分別對不同處理的苦馬豆地上部分均勻噴施脫落酸(ABA, Sigma公司)和6-芐氨基嘌呤(6-BA, Sigma公司)，濃度均為50 mg/L。脅迫2周后，分別對葉片和根系進行采樣，放于-80℃冰箱中，進行各項指標(biāo)分析。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1生長速率和根冠比測定 在苦馬豆生長期間，測定不同時間段的生長高度，以計算其平均生長速率。取樣后，將苦馬豆地上部分和地下部分分開，分別稱取鮮重。根冠比=地上部分/地下部分。

1.3.2Pro含量的測定 按照鄒琦[19]的方法進行。采用磺基水楊酸-酸性茚三酮法進行提取和測定。

1.3.3P5CS活性的測定 P5CS抽提按照Kishor等[20]的方法進行。蛋白含量測定按照Bradford[21]的方法進行，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。P5CS活性測定按照Garcia-Rios等[22]的方法進行。

1.3.4δ-OAT活性的測定 δ-OAT粗酶提取按照Roosens等[23]的方法進行。蛋白含量測定按照Bradford[21]的方法進行，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。δ-OAT活性的測定按照Kim等[24]的方法進行。反應(yīng)液體系為：50 mmol/L的磷酸緩沖液、35 mmol/L L-鳥氨酸、5 mmol/L α-酮戊二酸和0.05 mmol/L磷酸吡哆醛混合液，總體積為0.9 mL，加入酶液0.1 mL，在25℃條件下反應(yīng)20 min后加入0.3 mL 3 mol/L 的高氯酸終止反應(yīng)，然后再加入0.2 mL 2%茚三酮，沸水浴中加熱20 min進行染色，冷卻后10000 r/min離心去上清液。用無水乙醇溶解紅色沉淀物，離心后取上清液于510 nm測定吸光值。產(chǎn)物P5C與茚三酮生成紅色物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)為16.5 mmol/(L·cm)。以每分鐘生成0.001 μmol P5C的量為1個δ-OAT活性單位(U)。

1.3.5ProDH活性的測定 參照Lutts等[25]方法提取，略做改動。樣品加入四倍體積提取緩沖液 (w/v)于冰浴中研磨，提取緩沖液為0.1 mol/L Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.8)，內(nèi)含1 mmol/L EDTA，10 mmol/L β-巰基乙醇。勻漿液經(jīng)3層紗布過濾后4000 r/min離心15 min。上清液加TritonX-100至其終濃度為0.15%，漩渦混勻后冰浴30 min，然后20000 r/min離心20 min，上清液測定酶活。

活性測定反應(yīng)混合液體積為2.5 mL，內(nèi)含0.15 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 10.3)緩沖液1.6 mL，0.2 mL 0.1 mol/L L-Pro，0.2 mL 0.9 mmol/L 2,6-二氯酚靛酚。30℃水浴保溫15 min，加入0.5 mL (0.8 mg蛋白/mL)酶提取液，混合均勻后加入0.2 mL 0.9 mg/mL PMS試劑(臨時現(xiàn)配)，搖勻后立即于600 nm下檢測光密度變化。以每分鐘A600減少0.001為1個ProDH酶活性單位(U)。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗測定各項數(shù)據(jù)通過Excel 2007進行分析整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物激素和NaCl對苦馬豆生長狀態(tài)的影響

隨著NaCl濃度的增大，苦馬豆生長速率逐漸下降(圖1 A)。0 mmol/L鹽處理下，生長速率從小到大分別是CK<6-BA

未經(jīng)植物激素處理的苦馬豆幼苗，根冠比隨鹽濃度升高呈先升高后降低的趨勢(圖1 B)，在560 mmol/L NaCl出現(xiàn)最小值0.48 。經(jīng)6-BA和ABA處理后，在鹽脅迫期間根冠比顯著低于未噴施經(jīng)植物激素的處理，且在各鹽濃度下，ABA處理后的根冠比均高于6-BA，分別是其2.1，1.4，1.8，1.1，1.5，1.4，1.0和1.3倍。

2.2 脯氨酸的影響

隨著鹽濃度升高，苦馬豆葉片和根系中的脯氨酸含量顯著升高(圖2A)，且根系中脯氨酸含量高于葉片，在NaCl濃度為560 mmol/L時達到最大值682.69 μg/g FW，此濃度下葉片中脯氨酸含量顯著降低，只有259.13 μg/g FW。經(jīng)6-BA處理過的苦馬豆幼苗，脯氨酸含量呈先降后升的現(xiàn)象(圖2B)，在160 mmol/L NaCl濃度下，葉片和根系中含量達到最低值，分別是51.21和23.70 μg/g FW，僅是同濃度下未經(jīng)激素處理的60%和23%。經(jīng)ABA處理后的苦馬豆幼苗，脯氨酸含量隨鹽濃度升高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖2C)，在NaCl濃度為400 mmol/L時，葉片和根系中脯氨酸含量達到最高，分別為175.78 和283.36 μg/g FW。在3種處理中，雖然總量上存在很大差異，但是根系中的脯氨酸含量都高于葉片，且NaCl濃度為560 mmol/L時，葉片中脯氨酸含量顯著降低。

圖1 苦馬豆苗期生長速率(A)和根冠比(B)Fig.1 The growing ratio (A) and root top ratio (B) of S. salsula seedlings

2.3 P5CS活性的影響

未經(jīng)植物激素處理的苦馬豆幼苗，P5CS含量呈先升高后降低趨勢(圖3A)，在NaCl濃度為400 mmol/L時，根系中P5CS含量出現(xiàn)最大值為2.44 U/mg 蛋白，CK (0 mmol/L NaCl)中葉片P5CS含量最高，分別是其他濃度下的3.5，2.6，5.5，4.3，1.1，3.3，3.8倍。經(jīng)6-BA處理后的苦馬豆幼苗中P5CS在葉片和根系中含量顯著高于未用激素處理的(圖3B)，除0 mmol/L NaCl+6-BA外，P5CS含量呈先升后降的狀態(tài)，NaCl濃度為400 mmol/L 時，葉片和根系中出現(xiàn)最大值分別為2.74和2.98 U/mg蛋白。而經(jīng)ABA處理后的幼苗中P5CS含量趨于穩(wěn)定(圖3C)，處于1.00～1.80 U/mg蛋白之間，且葉片含量普遍高于根系。

2.4 δ-OAT活性的影響

在3種實驗處理中，苦馬豆幼苗根系中δ-OAT活性顯著高于葉片，以CK最為顯著(圖4A)，達63.35 U/mg蛋白，是葉片的9.7倍。除CK和 0 mmol/L NaCl+6-BA外，隨著NaCl濃度的增大，苦馬豆幼苗中葉片和根系中δ-OAT活性均是先升高再降低，出現(xiàn)最大值的NaCl濃度依次是320，160和240 mmol/L。圖4可明顯看出經(jīng)ABA處理后的苦馬豆幼苗δ-OAT活性顯著低于6-BA處理后的，而0 mmol/L NaCl+ABA根系中δ-OAT活性只占到前兩種處理的25%和24% 。

2.5 ProDH活性的影響

如圖5所示，苦馬豆幼苗經(jīng)3種處理后ProDH活性均出現(xiàn)先升后降狀態(tài)，且葉片高于根系，葉片中最大值分別為78.67，62.01和56.80 U/g FW，出現(xiàn)的NaCl濃度分別是400，240和240 mmol/L；根系中最大值分別為67.47，45.53和44.20 U/g FW，出現(xiàn)的NaCl濃度分別是320，320和160 mmol/L。但是經(jīng)過激素處理后的苦馬豆幼苗中ProDH活性低于未經(jīng)激素處理的。

3 討論

3.1 外源植物激素對苦馬豆幼苗生長的影響

植物激素是植物生長必需的物質(zhì)，在植物整個生活史中占有重要地位。植物激素量的調(diào)控對植物生長有著重要的影響[26-27]。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過6-BA和ABA處理過的苦馬豆幼苗具有較高的生長速率，隨著鹽濃度的增加，下降也相對緩慢，在高鹽情況下仍能保持基本正常的生長。細胞分裂素類物質(zhì)和脫落酸是植物生長過程中的重要激素[28]，在植物處于逆境條件時，外源添加，可以有效促進抗氧化酶活性，提高植物的抗逆性[29-30]。

圖2 不同NaCl濃度下脯氨酸含量Fig.2 Pro under different treatments of NaClA：NaCl; B: NaCl+6-BA; C: NaCl+ABA。下同 The same below.

根冠比是衡量植物生長狀況以及對環(huán)境的適應(yīng)程度的又一重要指標(biāo)。是指某時期內(nèi)植物地下和地上部分干重或鮮重的比值[31]。研究表明，在低濃度鹽脅迫時，根冠比有上升趨勢，隨著鹽濃度不斷增大，出現(xiàn)下降。因為葉片相對于根系對鹽脅迫更為敏感[32-33]，因而在低鹽濃度時，已經(jīng)受到影響，高鹽時，葉片和根系均受到損傷，所以出現(xiàn)了先升高后降低的現(xiàn)象[34-35]。與生長速率相反，經(jīng)外源植物激素處理過的苦馬豆幼苗的根冠比均小于未經(jīng)激素處理的，原因可能是由于植物激素是在葉片噴施的，6-BA和ABA都可不同程度地促進植物細胞的分裂和增殖[31]，因此地上部分累積干物質(zhì)和水分含量大于未經(jīng)激素處理的。

3.2 外源植物激素對苦馬豆幼苗脯氨酸代謝的影響

植物處于環(huán)境脅迫時，如旱、澇、冷、凍、鹽漬等，體內(nèi)會產(chǎn)生大量游離脯氨酸，通過調(diào)節(jié)滲透壓，提高自身抗性[31,36-37]。而植物體中脯氨酸含量的多少，直接影響植物的抗逆性，并且與抗旱、抗鹽性具有正相關(guān)關(guān)系[38]。實驗結(jié)果表明，無論是否經(jīng)植物激素處理，苦馬豆幼苗中脯氨酸含量都隨NaCl濃度的增大而升高，但是從脯氨酸累積量上來說，噴施2種植物激素的處理中，脯氨酸含量遠遠低于直接處于鹽脅迫狀態(tài)下的苦馬豆幼苗，二者相差3倍之多。6-BA和ABA雖然可以提高植物的抗逆性，但是本實驗結(jié)果說明，外源植物激素的加入對于脯氨酸累積有抑制作用，但較低的脯氨酸含量并不影響苦馬豆的正常生長。有實驗證明，6-BA可有效增加植物體內(nèi)抗氧化酶活性，防止植物受到外界環(huán)境的干擾[29]。

圖4 不同NaCl濃度下δ-OAT酶活性Fig.4 Ornithineoxo-acid transaminase (δ-OAT) under different treatments of NaCl

圖5 不同NaCl濃度下ProDH酶活性Fig.5 Proline dehydragenase (ProDH) under different treatments of NaCl

植物體內(nèi)游離脯氨酸的積累主要受合成和分解兩個過程的影響。目前研究表明，脯氨酸合成有兩條途徑，分別是谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，二者主要區(qū)別是合成脯氨酸的初始底物和關(guān)鍵酶不同。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鳥氨酸δ-氨基轉(zhuǎn)移酶(δ-OAT)分別是這兩種合成途徑的關(guān)鍵酶。脯氨酸脫氫酶(ProDH)是脯氨酸降解過程中關(guān)鍵的限速酶，其活性的強弱對于脯氨酸的積累有著至關(guān)重要的作用，在植物處于逆境脅迫時，ProDH活性受到抑制，減少對脯氨酸的分解，促進脯氨酸的大量積累[38]。實驗結(jié)果表明，苦馬豆處于鹽脅迫時，體內(nèi)的兩種脯氨酸合成酶P5CS和δ-OAT活性升高，對脯氨酸的積累有重要作用。6-BA處理后的苦馬豆幼苗，P5CS和δ-OAT活性均高于ABA處理的和未經(jīng)激素處理的苦馬豆幼苗，而且根部的酶活性大于葉片的酶活性，說明，植物根系的酶活性對植物激素更為敏感。而直接接觸植物激素的葉片的兩種酶的活性卻相對受到抑制，尤其是δ-OAT的活性。原因可能是過多的植物激素，造成了植物葉片生理調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂，造成酶系統(tǒng)的失調(diào)[2,31]，而根部是由植物通過疏導(dǎo)組織將激素自上而下運送而來，從量上來說已經(jīng)達到相對平穩(wěn)的水平，因而在根系中能夠起到促進的作用。ProDH活性在不同鹽分濃度中呈現(xiàn)先升高后降低的狀態(tài)，體內(nèi)過多的脯氨酸通過反饋機制調(diào)節(jié)ProDH活性，使其活性增強，隨著鹽濃度增大，脯氨酸不斷累積，增大細胞滲透能力，抑制ProDH活性。外源植物激素的介入，與未經(jīng)激素處理相比，整體降低了ProDH活性，更有利于脯氨酸的累積，但從脯氨酸量來看，結(jié)果恰恰相反，噴施兩種植物激素處理的脯氨酸含量遠遠低于直接處于鹽脅迫狀態(tài)下的苦馬豆幼苗。原因可能是植物激素大大促進了兩種脯氨酸合成酶的活性，使其遠遠高出正常水平，由于酶活性過高而形成的負反饋調(diào)節(jié)，反而抑制脯氨酸的合成，造成脯氨酸量上的差異[39]。植物激素的作用是多方面的，由于本實驗只進行了脯氨酸及其代謝酶的相關(guān)測定，對于其他抗逆性指標(biāo)并不了解其變化，所以需進行更加深入的研究才能對植物激素對植物抗鹽性的機制進行準(zhǔn)確的判定。

4 結(jié)論

外源植物激素可以提高鹽脅迫下苦馬豆的抗逆性，在較高鹽濃度下仍能較為正常地生長，根系中酶活性對植物激素的敏感程度大于葉片。且6-BA比ABA的作用更為顯著。通過植物激素的調(diào)節(jié)，使苦馬豆幼苗中脯氨酸不再是主要的抗逆性來源。