中型狼尾草幼苗對PEG、低溫和鹽脅迫的生理應(yīng)答

張懷山，趙桂琴，栗孟飛，夏曾潤，王春梅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部蘭州黃土高原生態(tài)環(huán)境重點野外科學觀測試驗站,甘肅 蘭州 730050；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院 干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；4.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

植物在萌發(fā)、營養(yǎng)生長、生殖生長的整個生命過程中往往遭受不同環(huán)境因子的脅迫，如干旱、低溫、高溫、鹽堿及氧化脅迫等。其中，干旱、低溫、鹽堿是我國西北內(nèi)陸地區(qū)植物生存環(huán)境中遇到的主要逆境因子[1-3]。當植物處于上述不利環(huán)境時，通常會通過代謝反應(yīng)來阻止、降低或修復逆境造成的損傷，一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量以及丙二醛含量、抗氧化酶(SOD，POD，CAT)活性等會發(fā)生適應(yīng)性變化[4-6]。一般認為，植物苗期是對逆境脅迫最為敏感的時期，在植物生長早期進行抗逆性篩選鑒定較為容易[7-8]?？扇苄蕴呛渴侵参锟购敌缘囊粋€重要生理指標[9]，脯氨酸是植物逆境脅迫的產(chǎn)物[10]，提高葉片抗氧化酶(如SOD)的活性可增強植株的抗旱性[11]。

中型狼尾草(Pennisetumlongissimumvar.intermedium)野生栽培種是中國農(nóng)科院蘭州畜牧與獸藥研究所經(jīng)過多年引種馴化選育出的多年生牧草新品種(系)，具有產(chǎn)草量高、萌發(fā)力強、易栽培、抗病性強等優(yōu)良特性，平均株高1.8～1.9 m，粗蛋白含量18%以上。2009年開始在蘭州干旱半干旱地區(qū)、天水半濕潤地區(qū)和永登秦王川灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)進行推廣種植，年均干草產(chǎn)量分別達到1.60×104，1.48×104和1.42×104kg/hm2，是一種兼具飼草、生態(tài)型的禾本科優(yōu)良草種。狼尾草屬牧草的廣泛適應(yīng)性、高額產(chǎn)草量、高蛋白含量以及無融合生殖特性，受到牧草育種專家的高度關(guān)注，并對狼尾草種質(zhì)資源的生長特性、栽培技術(shù)等進行了深入研究[12-13]。在狼尾草抗逆性方面，陸炳章和許慰睽[14]、顧洪如等[15]、劉國道等[16]、張懷山[17]分別研究了美國雜交狼尾草、寧牧26-2美洲狼尾草、熱研4號雜交狼尾草以及乾寧、長序野生狼尾草在不同氣候條件、不同酸堿土壤的生長適應(yīng)性。但是，有關(guān)中型狼尾草的抗逆性生理生化研究還未見報道。本試驗以PEG-6000、低溫和鹽分為脅迫條件，系統(tǒng)研究了中型狼尾草在3種不同逆境處理下生理生化指標的動態(tài)變化規(guī)律，并對其苗期抗逆性和生態(tài)適應(yīng)性進行了綜合評價，為中型狼尾草新品種抗性生理調(diào)節(jié)機理的揭示以及在西北寒、旱區(qū)的推廣應(yīng)用提供理論科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試中型狼尾草材料為中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所草業(yè)飼料研究室提供，試驗于甘肅農(nóng)業(yè)大學干旱生境作物學重點實驗室培育基地分子生理生態(tài)實驗室完成。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1幼苗的培養(yǎng) 2012年7月，精選籽粒飽滿、色澤健康且無病蟲傷害的中型狼尾草種子，75%的酒精消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，無菌水浸種(30℃)24 h。將處理好的種子分成3組，即PEG干旱模擬脅迫組、低溫冷凍脅迫組和NaCl鹽脅迫組，分別播種于直徑為9 cm、鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿30粒，置于(28±2)℃恒溫箱黑暗催芽，每天檢查培養(yǎng)皿水分狀況并酌情補充，以避免干旱，確保正常萌發(fā)。待幼苗第一片葉完全張開后補充光照，光照強度為2000 lx，每天光照16 h，生長20 d，進行脅迫處理。

1.2.2PEG-6000溶液處理 在培養(yǎng)皿中，加入5%，10%，15%和20%的PEG-6000溶液各5 mL作為處理組，以加入5 mL蒸餾水作為CK組，連續(xù)處理3 d。

1.2.3低溫冷凍處理 將著生幼苗的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到分別設(shè)定為4，0，-5，-10和-20℃的冰箱中進行低溫脅迫處理，室溫(約28℃)培養(yǎng)幼苗為CK組，低溫處理1，2 和4 h。

1.2.4NaCl溶液處理 在培養(yǎng)皿中，加入濃度分別為0.6，0.8，1.0 和1.2 g/L的NaCl溶液各5 mL作為處理組，以加入5 mL蒸餾水作為CK組，連續(xù)處理3 d。

1.3 測定指標及方法

以上3個脅迫組每處理15株苗，均設(shè)置3次重復，取鮮葉進行相關(guān)生理生化指標測定。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[18]；可溶性糖含量采用蒽酮法[18]；脯氨酸含量采用茚三酮比色法[19]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[19]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法[20]。

以上所有指標測定均重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010繪制圖表并進行回歸分析，運用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中型狼尾草幼苗對PEG脅迫的生理生化響應(yīng)特征

在干旱脅迫條件下，中型狼尾草葉片中可溶性蛋白含量隨著PEG濃度的增加表現(xiàn)為先增后降再增的變化趨勢(圖1A)。在輕度(0～10%)PEG脅迫下中型狼尾草葉片可溶性蛋白含量總體表現(xiàn)為顯著上升，在15%的PEG時有所下降；可溶性糖含量隨PEG濃度的升高呈先增后降的趨勢(圖1B)，輕度(0～10%)PEG脅迫下，可溶性糖含量緩慢上升，在5%時達到最大。PEG處理下中型狼尾草葉片中游離脯氨酸含量顯著升高，與CK差異顯著(圖1C)，輕度(0～10%)PEG脅迫下含量增加較緩，PEG>10%時大幅增加，在PEG 20%時含量是CK的6.0倍；MDA含量隨PEG濃度的升高呈現(xiàn)“急劇增加—相對穩(wěn)定—迅速下降”的變化趨勢(圖1D)，PEG為5%時MDA累積量達到最大，是CK的2.1倍，且與其他各處理差異顯著；SOD活性隨PEG濃度的增大變化較為劇烈，且變化差異顯著，總體上“急劇下降—微增—迅速上升”的趨勢(圖1E)，PEG為5%時SOD活性最低，相比CK下降了66.2%，隨后逐漸上升，在PEG 20%時達到最大。

2.2 中型狼尾草幼苗對低溫脅迫的生理生化響應(yīng)特征

中型狼尾草葉片可溶性蛋白含量隨溫度的降低總體呈先升高后下降的趨勢(圖2A)，在4℃急劇升高，然后緩慢增長，-5℃迅速下降，其中4 h處理的可溶性蛋白含量上升和下降趨勢均很大，整個溫度變化范圍內(nèi)其含量均高于其他2個處理；可溶性糖含量的變化與可溶性蛋白質(zhì)含量的總體變化趨勢相同，呈先升高后下降的趨勢，所不同的是1 h處理的可溶性糖含量整個溫度變化范圍內(nèi)其含量基本高于其他2個處理(圖2B)；脯氨酸含量隨溫度的降低均呈升高的趨勢，且增幅較大(圖2C)，4 h處理在降溫到0℃時脯氨酸含量迅速上升，降溫到-20℃時達到最大，是CK的9.4倍，其他2個處理脯氨酸升高的趨勢均小于4 h處理；MDA含量隨溫度的下降均有所上升，上升幅度隨處理時間的延長而增大(圖2D)，4 h處理下MDA含量一直表現(xiàn)為較大幅度的上升，降溫到-20℃時達到最大，是CK的2.6倍；SOD活性隨溫度的降低總體呈先升高后下降的趨勢，3個不同時間處理均在4℃時達到最大值，且2 h處理SOD活性最大(圖2E)，當降溫到4℃時，各處理SOD活性均迅速下降，1，2和4 h分別低于CK 31.8%，22.7%和15.8%。

圖1 PEG脅迫下中型狼尾草葉片可溶性蛋白(A)、可溶性糖(B)、脯氨酸(C)、丙二醛(D)含量及SOD活性(E)的變化Fig.1 Changes of soluble protein(A), sugar(B), Pro(C), MDA content(D) and SOD activity(E) in P. longissimum var. intermedium leaves under PEG stress

圖中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。下同。Different letters indicated significant difference at level 0.05. The same below.

圖2 低溫脅迫下中型狼尾草葉片可溶性蛋白(A)、可溶性糖(B)、脯氨酸(C)、丙二醛(D)含量及SOD活性(E)的變化Fig.2 Changes of soluble protein(A), sugar(B), Pro(C), MDA content(D) and SOD activity(E) in P. longissimum var. intermedium leaves under low-temperature stress

2.3 中型狼尾草幼苗對鹽脅迫的生理生化響應(yīng)特征

隨著鹽脅迫水平的加強，中型狼尾草葉片可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先增后降的變化趨勢(圖3A)，在NaCl濃度<0.8 g/L時，可溶性蛋白含量緩慢上升，隨后迅速下降；可溶性糖含量隨著NaCl濃度的增大而增加，且變化差異顯著，在1.2 g/L處理下達到最大值，是CK的1.7倍(圖3B)；脯氨酸含量在0.6～1.0 g/L濃度處理時變化幅度相對較小，為47.1%，在1.0～1.2 g/L時急劇上升，增幅達115.6%(圖3C)；MDA含量變化與脯氨酸變化趨勢基本一致，亦隨鹽處理濃度的增大而增加(圖3D)，在1.2 g/L濃度時達到最大，是CK的3.5倍；SOD活性呈現(xiàn)“微增—緩慢降低—急劇下降”的變化趨勢(圖3E)，在0.6 g/L濃度時活性最高，隨著NaCl濃度的進一步增大，SOD活性持續(xù)下降，在1.2 g/L濃度時顯著低于CK 68.5%。

2.4 PEG、低溫和鹽脅迫下各生理指標相關(guān)性分析

通過對PEG、低溫和鹽脅迫下各生理指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示(表1)：在PEG脅迫下，僅脯氨酸含量與可溶性糖含量呈顯著(P<0.05)負相關(guān)外，其他各生理生化指標之間相關(guān)性不顯著；低溫4 h脅迫下，MDA含量與可溶性糖含量顯著(P<0.05)正相關(guān)，與脯氨酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)；NaCl脅迫下，可溶性糖含量與SOD活性顯著負相關(guān)(P<0.05)，與脯氨酸含量和MDA含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)，MDA含量與脯氨酸含量顯著正相關(guān)(P<0.05)，與SOD活性顯著負相關(guān)(P<0.05)，可溶性蛋白與SOD活性顯著正相關(guān)(P<0.05)。

圖3 鹽脅迫下中型狼尾草葉片可溶性蛋白(A)、可溶性糖(B)、脯氨酸(C)、丙二醛(D)含量及SOD活性(E)的變化Fig.3 Changes of soluble protein(A), sugar(B), Pro(C), MDA content(D) and SOD activity(E) in P. longissimum var. intermedium leaves under salt stress

3 討論與結(jié)論

3.1 逆境脅迫對中型狼尾草幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)功能是植物在長期進化過程中所演化出適應(yīng)逆境因子的機制和策略，也是其能夠忍受長期逆境條件并提高抗逆性的重要生理基礎(chǔ)。脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫下這些有機溶質(zhì)主動積累，以提高細胞液濃度，降低其滲透勢，增強吸水和持水能力，保持細胞生長、氣孔開放和光合作用等生理過程，從而提高抗脅迫能力[21-22]。游離脯氨酸大量累積是植物對逆境脅迫下細胞結(jié)構(gòu)和功能遭受傷害而普遍出現(xiàn)的一種適應(yīng)性反應(yīng)，很多研究都發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象，但目前關(guān)于脯氨酸含量與植物抗逆性之間關(guān)系的觀點尚不統(tǒng)一。有研究認為[23]，脯氨酸的累積是自身主動合成的，是植物忍受對抗逆境的結(jié)果。也有人認為[24]，脯氨酸累積是脅迫造成的代謝紊亂的伴隨結(jié)果。同樣，Singh等[25]用不同的大麥(Hordeumvulgare)品種試驗發(fā)現(xiàn)，脯氨酸增加量與抗旱性呈正相關(guān)，而Hanson等[26]卻提出，干旱下白花丹科植物脯氨酸含量的變化與抗旱性無關(guān)，脯氨酸的積累只是植物在嚴重缺水時的一種損傷表現(xiàn)。因此，能否把脯氨酸作為植物抗性鑒定和育種指標一直存在爭議。本試驗與焦樹英等[27]對3種狼尾草所做的研究結(jié)果一致，脯氨酸含量隨著PEG、低溫和鹽脅迫水平的加強都呈快速上升趨勢。

表1 PEG、低溫和鹽脅迫下中型狼尾草葉片生理指標的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of P. longissimum var. intermedium leaves physiological indexes under PEG, low temperature and salt stress

注：*表示指標在0.05水平顯著相關(guān)；**表示指標在0.01水平極顯著相關(guān)。

Note： *Indicate significant correlation at 0.05 level； ** indicate significant correlation at 0.01 level.

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與代謝的酶類，其含量是了解植物體總代謝水平的一個重要指標[28]。植物體通過合成有關(guān)蛋白質(zhì)增加可溶性蛋白含量幫助維持細胞較低的滲透勢，同時增強植物的耐脫水能力、制約離子吸收、保護細胞結(jié)構(gòu)，以抵抗逆境帶來的脅迫[29]。然而，在玉米(Zeamays)[30]和小麥(Triticumaestivum)[31]上的研究也發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量在鹽脅迫下降低，蛋白質(zhì)合成受阻，加速分解為各種氨基酸，降低細胞的滲透勢，增加細胞的吸水能力，以此來減輕鹽對細胞的傷害。本研究表明，中型狼尾草幼苗可溶性蛋白含量隨著溫度的降低和NaCl濃度的增大表現(xiàn)為先上升后下降的變化規(guī)律，與前人的研究結(jié)果不盡相同，可能與植物材料、處理方法及脅迫時間有關(guān)。

可溶性糖作為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠穩(wěn)定細胞膜和原生質(zhì)體，提供能量來源和有機溶質(zhì)合成的碳架，還可在細胞內(nèi)無機離子濃度過高時起保護酶類的作用[32]。試驗中，針對不同的脅迫處理，可溶性糖含量的響應(yīng)有所差別，但均有上升的趨勢，表明中型狼尾草可通過增加體內(nèi)可溶性糖含量來維持滲透平衡，具有一定的抗逆性。研究還發(fā)現(xiàn)，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖在相同脅迫條件下表現(xiàn)出相異的變化趨勢，可能是滲透脅迫物質(zhì)所起的作用和調(diào)節(jié)機制存在一定的差異，其原因還有待于進一步研究。

3.2 逆境脅迫對中型狼尾草幼苗膜脂過氧化作用的影響

正常生長條件下，植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當植物遭受脅迫時，這種平衡被破壞，首先影響的是生物膜[33]，往往發(fā)生質(zhì)膜過氧化作用，累積許多有害的過氧化物[34]。丙二醛(MDA)是植物細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用的終產(chǎn)物，它可以結(jié)合交聯(lián)質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)，使之失活，導致膜孔隙度變大，通透性增加，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，引起細胞代謝紊亂[35]。因此，MDA作為細胞膜損害程度的指示物質(zhì)，其含量可以反映細胞質(zhì)膜過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱。王仕林等[36]、賀莉等[37]分別采用低溫和NaCl脅迫油菜(Brassicacampestris)和大豆(Glycinemax)，研究其抗逆性生理生化特性時，發(fā)現(xiàn)MDA含量隨著脅迫溫度的降低和鹽濃度的增大逐漸增加，本試驗得出了類似的研究結(jié)果，表明中型狼尾草幼苗的膜系統(tǒng)受到了損傷，并且這種損傷與質(zhì)膜的過氧化作用密切相關(guān)，且脅迫的強度越大對膜的傷害越大。逆境脅迫環(huán)境下，植物MDA含量增加應(yīng)該是一個普遍現(xiàn)象，但本研究卻發(fā)現(xiàn)中型狼尾草幼苗在PEG模擬干旱脅迫時MDA含量沒有持續(xù)增加，卻有一個下降的過程，這與王霞等[38]對荒漠食物檉柳(Tamarixchinensis)的研究結(jié)果是一致的，其原因可能是在重度干旱脅迫下中型狼尾草體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)活性高，能有效地減少膜脂過氧化傷害。

3.3 逆境脅迫對中型狼尾草幼苗保護酶系統(tǒng)的影響

植物的保護酶體系在緩解脅迫方面起著重要作用，它可以清除體內(nèi)的活性氧，以避免過量活性氧對植物的傷害。超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的“第一道防線”，在抗氧化系統(tǒng)中處于核心地位，是清除細胞中多余的超氧根陰離子的主要途徑，其活性的高低變化反映了植物對氧化損傷的修復能力，酶活性越高，清除活性氧的能力就越強，植物抗性也越強[28]。謝亞軍等[39]對甘草(Glycyrrhizauralensis)在干旱脅迫下保護酶活性的變化進行了研究，結(jié)果表明，隨著脅迫程度的加劇，植物體內(nèi)SOD活性先上升后下降，與體內(nèi)氧自由基的變化趨勢一致。本研究表明，低溫和鹽脅迫下，中型狼尾草幼苗SOD活性呈先小幅上升再持續(xù)、快速下降的變化效應(yīng)，并且SOD活性與MDA含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系，在Almeselmani等[40]對小麥的研究中也證實了這一結(jié)果。由此可以看出，逐漸加強的環(huán)境脅迫誘導中型狼尾草幼苗體內(nèi)活性氧過多積累，細胞質(zhì)膜嚴重受損，植株體內(nèi)MDA水平越來越高，抗氧化保護酶防御系統(tǒng)隨即被激活，試圖通過SOD活性的升高來清除過多的自由基，但是大量的自由基累積破壞了質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，機體內(nèi)許多相關(guān)蛋白合成受阻，嚴重影響了SOD基因的表達，其活性隨之下降，體現(xiàn)了中型狼尾草幼苗抵抗逆境、減輕傷害的適應(yīng)性反應(yīng)。

綜上所述，逆境條件下中型狼尾草通過自身脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖、MDA含量和SOD活性的動態(tài)變化，在一定程度上維持了細胞滲透勢的平衡，保護了細胞質(zhì)膜的完整性，清除了體內(nèi)過量的活性氧自由基，削弱了逆境對機體的危害，這是中型狼尾草適應(yīng)干旱、凍害及鹽堿等逆因子環(huán)境的重要生理調(diào)節(jié)機制，也是對生態(tài)適應(yīng)的應(yīng)激表達。脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性與可溶性糖含量，可溶性蛋白、MDA含量與SOD活性以及MDA含量與脯氨酸含量之間均有顯著的相關(guān)性，這些都可以作為評定中型狼尾草抗逆性的重要生理指標。然而，隨著PEG、低溫和鹽脅迫水平的加強，中型狼尾草幼苗生理生化特性的變化規(guī)律和變化量卻因指標而異，因脅迫環(huán)境而異。其原因可能與中型狼尾草的耐逆性機理有關(guān)，也體現(xiàn)了其對不同逆境條件的抗性差異，因此不能以單一的量化指標進行中型狼尾草的抗逆性評價，而應(yīng)該綜合多個指標的生理特性變化情況進行科學的評價和分析。本試驗只是從生理指標方面探討了PEG、低溫和鹽溶液對中型狼尾草幼苗的影響，綜合分析逆境因子對中型狼尾草不同生長時期以及地下部分的生理影響，從而揭示其抗逆性適應(yīng)機理是下一步研究工作的重點。