反相高效液相色譜法測定芝麻油中苯并（a）芘

戴啟鳳++徐敏

摘 要：該文采用反相高效液相色譜法測定芝麻油中的苯并（a）芘，分別用Cleanert BAP固相萃取柱和自制固相萃取柱凈化，熒光檢測器進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，使用Cleanert BAP固相萃取柱的重現(xiàn)性優(yōu)于自制的固相萃取柱，回收率在91%～100.5%之間，RSD為3.1%，且操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：苯并（a）芘 Cleanert BAP固相萃取柱 芝麻油 反相高效液相色譜法

中圖分類號：O65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）04（b）-0102-02

Sesame oil benzo （a） pyrene is determinated with reversed phase high performance liquid chromatographic method

DAI Qifeng XU Min

（HeXian technology of quality supervision in AnHui province，AnHui Maanshan，238200）

Abstract：Sesame oil benzo（a）pyrene is determinated with reversed phase high performance liquid chromatographic method， purged by Cleanert BAP Solid phase extraction column and Self-control Solid phase extraction column，detected by the fluorescence detector.The result shows that the reproducibility by Cleanert BAP Solid phase extraction column is better than by Self-control Solid phase extraction column，the tecoverie is range from 91% to 100.5%，the RSD is 3.1%.This is a good method that the operation is convenient and the result is accurate and reliable

Keywords：benzo（a）pyrene Cleanert BAP Solid phase extraction column sesame oil reversed phase high performance liquid chromatographic method

苯并（a）芘是由五個苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳香烴物質(zhì)，它和亞硝胺、黃曲霉毒素是世界公認(rèn)的三大致癌物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的致癌性多環(huán)芳香烴及其致癌性的衍生物已達(dá)200多種[1]，多環(huán)芳香烴是一類含有多個苯環(huán)的芳香族化合物，是煤炭、木材、石油等有機(jī)物不完全燃燒的產(chǎn)物，多環(huán)芳香烴類化合物能阻斷細(xì)胞間的聯(lián)系，會導(dǎo)致癌細(xì)胞的進(jìn)一步增殖擴(kuò)散，這可能是多環(huán)芳香烴物質(zhì)具有致癌性的原因之一。

芝麻油在生產(chǎn)過程中可能因環(huán)境污染或原材料帶入或加工時溫度過高而產(chǎn)生苯并（a）芘[2-5]，GB2716《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定了苯并（a）芘的限值為不大于10 μg/kg，所以苯并（a）芘的測定是食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)最常見的檢測項(xiàng)目之一，現(xiàn)在的國標(biāo)方法GB/T22509-2008前處理較為繁鎖，復(fù)雜的前處理不僅耗時耗力、污染環(huán)境，且容易引入較多的誤差和不確定度，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此建立一種快速準(zhǔn)確和科學(xué)可靠的植物油中苯并（a）芘含量的檢測方法具有積極的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

樣品經(jīng)石油醚溶解，通過中性氧化鋁固相萃取柱吸附，用石油醚試劑洗脫苯并（a）芘，采用反相高效液相色譜法分離，熒光檢測器檢測，根據(jù)色譜峰的保留時間定性，外標(biāo)法定量[6]。

1.2 試劑和材料

Cleanert BAP固相萃取柱：22g/60 mL

水：符合GB/T6682規(guī)定的二級水要求

甲醇：色譜純

石油醚：色譜純（沸程35～60 ℃）

乙腈：色譜純

四氫呋喃：色譜純

中性氧化鋁：100-200目

無水硫酸鈉：分析純

苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液：5.25 ug/mL，2L/支，中國計(jì)量科學(xué)研究院制。

乙腈四氫呋喃混合溶液（9+1）：90 mL乙腈和10 mL四氫呋喃的混和溶液

芝麻油：轄區(qū)內(nèi)監(jiān)督抽查樣品

1.3 儀器和器皿

Waters 2690高效液相色譜儀：配2475熒光檢測器和120位自動進(jìn)樣器（美國沃特氏公司）

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：控溫40～50 ℃范圍內(nèi)

VX200渦旋混合器：0～3000轉(zhuǎn)

BS224S分析天平：感量為0.000 g

樣品瓶：2 mL，配有可密封的蓋子

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將5.25 μg/mL的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋到100 mL，配成105 ng/mL苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)貯備液。再取105 ng/mL苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、5 mL稀到50 mL，配成0 ng/mL、2.1 ng/mL、4.2 ng/mL、8.4 ng/mL、10.5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。endprint

1.4.2 樣品前處理

溶解：用電子天平準(zhǔn)確稱取不超過0.300 g的油樣，用5 mL的石油醚溶解并于渦旋混合器上充分混勻。

活化：用約30 mL石油醚，將固相萃取柱預(yù)先活化，活化過程直到固相萃取柱末端石油醚自然滴下約5 mL左右為止。

上樣：將溶解好的油樣添加到預(yù)先活化好的固相萃取柱中，注意操作過程中篩板不能干涸。

洗脫：分2～3次共添加80 mL石油醚，用150 mL的旋轉(zhuǎn)瓶接收，直到80 mL石油醚在重力作用下完全自然流出為止。

濃縮：將洗脫液在40～50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。如果仍然有油滴無法蒸干，說明凈化不完全，需要向油滴中添加80 mL的石油醚醚制得新樣，取一根新柱重復(fù)上述凈化過程。

定容：取2 mL乙腈四氫呋喃混合溶液（9+1）于旋轉(zhuǎn)瓶中，混勻。

過膜：將上述混勻的待分析樣品注入5 mL一次性注射器中，過0.22 μm的濾膜，裝于2 mL進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：美國Waters公司的Symmetry

C18柱

（250 mm×4.6 mm，5 ?m）

流動相：乙腈-水=88-12；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：30 ℃

進(jìn)樣量：10 ?L；

熒光檢測器：激發(fā)波長384 nm，熒光波長405 nm

在上述條件下，測得苯并（a）芘保留時間在15 min左右，苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和芝麻油樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積y（EU）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，得線性回歸方程y=1.3677x+0.2065，R2=0.9997，表明苯并（a）芘在0.01-10.5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和峰面積有很好的線性關(guān)系。苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值和峰面積值見表1。

2.2 樣品測量值

分別使用自制的固相萃取柱柱和Cleanert BAP固相萃取柱對同一組芝麻油樣品進(jìn)行各10組平行樣檢測，檢測結(jié)果如表2。

由表2中可見，使用自制的固相萃取柱和Cleanert BAP固相萃取柱檢測苯（a）并芘的結(jié)果均在國標(biāo)GB/T22509規(guī)定的誤差范圍內(nèi)，但使用自制的固相萃取柱相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）大于Cleanert BAP固相萃取柱。

2.3 方法回收率

采用Cleanert BAP固相萃取柱做加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為2.1 ?g和4.2 ?g，每個加標(biāo)進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，測得的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。

從表3中可見，回收率在91%～100.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是3.1%，方法的回收率和精密度均滿足試驗(yàn)要求。

3 結(jié)語

該文采用市售的Cleanert BAP固相萃取柱，避免了原國標(biāo)方法中人工處理填料和裝填的繁瑣過程，大大節(jié)約工作時間，提高了工作效率，同時市售的Cleanert BAP固相萃取柱避免了原方法中實(shí)驗(yàn)人員裝填過程的誤差和由此可能導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定性，因此具有更佳的回收率和重復(fù)性。同時本方法中稱取的樣量不適宜過大，最好不要超過0.3 g，否則容易造成凈化不完全而必須進(jìn)行二次凈化。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁列江.動植物油脂中苯并（a）芘的測定 反相高效液相色譜法.

[2] 吳忠玲，何仲強(qiáng)，陳樹東，等.植物油中苯并（a）芘含量的測定研究[J].廣東微量元素科學(xué)，2012，19（6）：29-33.

[3] FALCON M S G，AMIGO S G，YUSTY M A L，et al. Determination of benzo （a） pyrene in some Spanish commercial smoked products by HPLC-FL[J].Food Additives and Contaminants，1999，16（1）：9-14.

[4] 胡傳杰，沈黎煒高效液相色譜法測定肉制品中的苯并（a）芘[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（6）：146-147.

[5] 王浩，劉艷琴，楊紅梅，等.高效液相色譜法測定化妝品中的苯并（a）芘[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2010，28（10）：221-222.

[6] GB/T22509-2008動植物油脂苯并（a）芘的測定-反相高效液相色譜法[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.endprint

1.4.2 樣品前處理

溶解：用電子天平準(zhǔn)確稱取不超過0.300 g的油樣，用5 mL的石油醚溶解并于渦旋混合器上充分混勻。

活化：用約30 mL石油醚，將固相萃取柱預(yù)先活化，活化過程直到固相萃取柱末端石油醚自然滴下約5 mL左右為止。

上樣：將溶解好的油樣添加到預(yù)先活化好的固相萃取柱中，注意操作過程中篩板不能干涸。

洗脫：分2～3次共添加80 mL石油醚，用150 mL的旋轉(zhuǎn)瓶接收，直到80 mL石油醚在重力作用下完全自然流出為止。

濃縮：將洗脫液在40～50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。如果仍然有油滴無法蒸干，說明凈化不完全，需要向油滴中添加80 mL的石油醚醚制得新樣，取一根新柱重復(fù)上述凈化過程。

定容：取2 mL乙腈四氫呋喃混合溶液（9+1）于旋轉(zhuǎn)瓶中，混勻。

過膜：將上述混勻的待分析樣品注入5 mL一次性注射器中，過0.22 μm的濾膜，裝于2 mL進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：美國Waters公司的Symmetry

C18柱

（250 mm×4.6 mm，5 ?m）

流動相：乙腈-水=88-12；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：30 ℃

進(jìn)樣量：10 ?L；

熒光檢測器：激發(fā)波長384 nm，熒光波長405 nm

在上述條件下，測得苯并（a）芘保留時間在15 min左右，苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和芝麻油樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積y（EU）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，得線性回歸方程y=1.3677x+0.2065，R2=0.9997，表明苯并（a）芘在0.01-10.5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和峰面積有很好的線性關(guān)系。苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值和峰面積值見表1。

2.2 樣品測量值

分別使用自制的固相萃取柱柱和Cleanert BAP固相萃取柱對同一組芝麻油樣品進(jìn)行各10組平行樣檢測，檢測結(jié)果如表2。

由表2中可見，使用自制的固相萃取柱和Cleanert BAP固相萃取柱檢測苯（a）并芘的結(jié)果均在國標(biāo)GB/T22509規(guī)定的誤差范圍內(nèi)，但使用自制的固相萃取柱相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）大于Cleanert BAP固相萃取柱。

2.3 方法回收率

采用Cleanert BAP固相萃取柱做加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為2.1 ?g和4.2 ?g，每個加標(biāo)進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，測得的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。

從表3中可見，回收率在91%～100.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是3.1%，方法的回收率和精密度均滿足試驗(yàn)要求。

3 結(jié)語

該文采用市售的Cleanert BAP固相萃取柱，避免了原國標(biāo)方法中人工處理填料和裝填的繁瑣過程，大大節(jié)約工作時間，提高了工作效率，同時市售的Cleanert BAP固相萃取柱避免了原方法中實(shí)驗(yàn)人員裝填過程的誤差和由此可能導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定性，因此具有更佳的回收率和重復(fù)性。同時本方法中稱取的樣量不適宜過大，最好不要超過0.3 g，否則容易造成凈化不完全而必須進(jìn)行二次凈化。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁列江.動植物油脂中苯并（a）芘的測定 反相高效液相色譜法.

[2] 吳忠玲，何仲強(qiáng)，陳樹東，等.植物油中苯并（a）芘含量的測定研究[J].廣東微量元素科學(xué)，2012，19（6）：29-33.

[3] FALCON M S G，AMIGO S G，YUSTY M A L，et al. Determination of benzo （a） pyrene in some Spanish commercial smoked products by HPLC-FL[J].Food Additives and Contaminants，1999，16（1）：9-14.

[4] 胡傳杰，沈黎煒高效液相色譜法測定肉制品中的苯并（a）芘[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（6）：146-147.

[5] 王浩，劉艷琴，楊紅梅，等.高效液相色譜法測定化妝品中的苯并（a）芘[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2010，28（10）：221-222.

[6] GB/T22509-2008動植物油脂苯并（a）芘的測定-反相高效液相色譜法[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.endprint

1.4.2 樣品前處理

溶解：用電子天平準(zhǔn)確稱取不超過0.300 g的油樣，用5 mL的石油醚溶解并于渦旋混合器上充分混勻。

活化：用約30 mL石油醚，將固相萃取柱預(yù)先活化，活化過程直到固相萃取柱末端石油醚自然滴下約5 mL左右為止。

上樣：將溶解好的油樣添加到預(yù)先活化好的固相萃取柱中，注意操作過程中篩板不能干涸。

洗脫：分2～3次共添加80 mL石油醚，用150 mL的旋轉(zhuǎn)瓶接收，直到80 mL石油醚在重力作用下完全自然流出為止。

濃縮：將洗脫液在40～50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。如果仍然有油滴無法蒸干，說明凈化不完全，需要向油滴中添加80 mL的石油醚醚制得新樣，取一根新柱重復(fù)上述凈化過程。

定容：取2 mL乙腈四氫呋喃混合溶液（9+1）于旋轉(zhuǎn)瓶中，混勻。

過膜：將上述混勻的待分析樣品注入5 mL一次性注射器中，過0.22 μm的濾膜，裝于2 mL進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：美國Waters公司的Symmetry

C18柱

（250 mm×4.6 mm，5 ?m）

流動相：乙腈-水=88-12；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：30 ℃

進(jìn)樣量：10 ?L；

熒光檢測器：激發(fā)波長384 nm，熒光波長405 nm

在上述條件下，測得苯并（a）芘保留時間在15 min左右，苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和芝麻油樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積y（EU）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，得線性回歸方程y=1.3677x+0.2065，R2=0.9997，表明苯并（a）芘在0.01-10.5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)和峰面積有很好的線性關(guān)系。苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值和峰面積值見表1。

2.2 樣品測量值

分別使用自制的固相萃取柱柱和Cleanert BAP固相萃取柱對同一組芝麻油樣品進(jìn)行各10組平行樣檢測，檢測結(jié)果如表2。

由表2中可見，使用自制的固相萃取柱和Cleanert BAP固相萃取柱檢測苯（a）并芘的結(jié)果均在國標(biāo)GB/T22509規(guī)定的誤差范圍內(nèi)，但使用自制的固相萃取柱相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）大于Cleanert BAP固相萃取柱。

2.3 方法回收率

采用Cleanert BAP固相萃取柱做加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為2.1 ?g和4.2 ?g，每個加標(biāo)進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，測得的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。

從表3中可見，回收率在91%～100.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是3.1%，方法的回收率和精密度均滿足試驗(yàn)要求。

3 結(jié)語

該文采用市售的Cleanert BAP固相萃取柱，避免了原國標(biāo)方法中人工處理填料和裝填的繁瑣過程，大大節(jié)約工作時間，提高了工作效率，同時市售的Cleanert BAP固相萃取柱避免了原方法中實(shí)驗(yàn)人員裝填過程的誤差和由此可能導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定性，因此具有更佳的回收率和重復(fù)性。同時本方法中稱取的樣量不適宜過大，最好不要超過0.3 g，否則容易造成凈化不完全而必須進(jìn)行二次凈化。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁列江.動植物油脂中苯并（a）芘的測定 反相高效液相色譜法.

[2] 吳忠玲，何仲強(qiáng)，陳樹東，等.植物油中苯并（a）芘含量的測定研究[J].廣東微量元素科學(xué)，2012，19（6）：29-33.

[3] FALCON M S G，AMIGO S G，YUSTY M A L，et al. Determination of benzo （a） pyrene in some Spanish commercial smoked products by HPLC-FL[J].Food Additives and Contaminants，1999，16（1）：9-14.

[4] 胡傳杰，沈黎煒高效液相色譜法測定肉制品中的苯并（a）芘[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（6）：146-147.

[5] 王浩，劉艷琴，楊紅梅，等.高效液相色譜法測定化妝品中的苯并（a）芘[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2010，28（10）：221-222.

[6] GB/T22509-2008動植物油脂苯并（a）芘的測定-反相高效液相色譜法[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.endprint