萊茵衣藻磷脂二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶3在三酰甘油合成中的功能研究

鄧曉東 蔡佳佳 費(fèi)小雯

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, ?？?571101;2. 海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院, ?？?571101)

隨著全球經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展, 人類對(duì)石油等化石燃料的消耗日益增加, 并且使用化石燃料帶來了嚴(yán)重環(huán)境污染問題, 世界各國(guó)都在尋找安全的可再生能源。生物能源可以間接或者直接利用植物或微生物的光合作用, 將太陽能固定為化學(xué)能, 是可再生能源的首選。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作為汽油添加劑進(jìn)入市場(chǎng)的生物能源, 其中生物柴油的成分更接近汽油, 并且來源廣泛, 是最有可能解決石油危機(jī)的可再生能源之一[1]。生物柴油的制備主要是通過三酰甘油(TAG)與甲醇(乙醇)通過酯交換工藝制成。目前生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動(dòng)植物油脂和微藻。利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有無可比擬的優(yōu)勢(shì), 已成為制備生物柴油的主要途徑[2]。

利用微藻來生產(chǎn)生物柴油有很多工藝步驟, 其中優(yōu)良藻種的選育是關(guān)鍵。最理想的生物柴油生產(chǎn)藻株要求生長(zhǎng)迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻種的分離以及微藻大規(guī)模培養(yǎng)上。與高等植物相比, 微藻的油脂生物合成的分子機(jī)制研究還很薄弱, 關(guān)于油脂代謝網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因功能研究報(bào)告更為稀少。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是模式單細(xì)胞生物, 基因組測(cè)序已經(jīng)完成, 在缺氮條件下油脂可以積累達(dá)到胞質(zhì)的 60%, 是研究油脂代謝基因的理想藻株[2]。

最近研究表明, 植物中從二酰甘油到最終合成三酰甘油存在2條途徑[3]。其一, 以?；o酶A為?；w, 二酰甘油為受體, 由酰基-CoA-二酯酰甘油?；D(zhuǎn)移酶催化合成三酰甘油。其二, 在一些植物如向日葵(Helianthus annuus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和蓖麻(Ricinus communis)以及酵母中以磷脂作為?；w, 二酰甘油作為受體, 經(jīng)磷脂二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)催化合成三酰甘油[4—6]。不同植物中 PDAT的底物特異性不同: 在擬南芥和酵母中, 卵磷脂(Phosphatidylcholine, PC)上的脂?；晦D(zhuǎn)移到二酰甘油[7]; 在蓖麻種子中, 磷脂上的蓖麻油酸(Ricinoleic acid)則被PDAT整合到三酰甘油中[8]。Stahl, et al.研究發(fā)現(xiàn)擬南芥 PDAT基因(At5g13640)與酵母PDAT的同源率為28%?？梢岳肅10到C22的磷脂作為?；w, 并且催化結(jié)合到甘油骨架上 sn位上的效率是 sn2位的 3倍。AtPDAT突變體的根部的微粒體(Microsomes)喪失了將磷脂的脂?；D(zhuǎn)移到二酰甘油上的能力[9]; 同時(shí)他們通過在出芽酵母和裂殖酵母中過量表達(dá) PDAT基因, 結(jié)果顯示酵母細(xì)胞中三酰甘油的含量顯著增加。在微藻研究方面, Merchant, et al.預(yù)測(cè)了萊茵衣藻中存在多個(gè)PDAT的同源基因[10]。Boyle, et al.報(bào)道了萊茵衣藻中PDAT同源基因PDAT1基因。通過插入突變得到的pdat1-1、pdat1-2細(xì)胞中的三酰甘油含量相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因藻株CC425減少25%。這說明PDAT1在萊茵衣藻的油脂合成中起到重要作用[11]。本研究對(duì)在萊茵衣藻 PDAT另一個(gè)同源基因CrPDAT3進(jìn)行研究, 通過RNAi干涉的方法將該基因沉默, 研究其在三酰甘油合成中的功能, 為微藻油脂的遺傳改良提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

萊茵衣藻CC425購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 為細(xì)胞壁缺失的藻株。藻株被接種在HSM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng), 而當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)則被接種到HSM液體培養(yǎng)基中, 在恒溫?fù)u床上培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為 220 r/min, 溫度26℃, 全日光照, 光照強(qiáng)度為110 μmol/(m2×s)。大腸桿菌 DH5a 菌株購(gòu)置于上海生工生物工程有限公司, RNAi干涉載體pMaa7/XIR由購(gòu)于 Duke大學(xué)萊茵衣藻中心保存的質(zhì)粒。中間載體T282由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 萊茵衣藻總RNA的提取及cDNA合成

萊茵衣藻 CC425 在 24℃ 110 μmol/(m2×s)全光照條件下震蕩培養(yǎng), 待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 取藻液50 mL, 10000 r/min 離心1min收集藻體, 液氮速凍后碾磨成粉末, 按照Trizol的方法提取總RNA。取1 μL 提取的總 RNA, 加入 9 μL去離子甲酰胺, 70℃變性 10 min, 加 3 μL 6×Loading Buffer, 1×TBE 電泳緩沖液, 1%瓊脂糖凝膠電泳, 檢測(cè)所提取RNA樣品的質(zhì)量。按照 TAKARA公司 cDNA合成說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA[12]。

1.3 CrPDAT3基因干涉片段的克隆

根據(jù) JGI Chlamydomonas database上公布的CrPDAT3部分編碼區(qū)序列為模板, 設(shè)計(jì)如下特異性引物, 5￠-ATGTGTGAGGCTGAGGCAGT-3￠, 5￠-TCA GCTGATGACCAGCGGTCG-3￠進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物連接到 pMD18-T載體上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.coli DH5α, 挑取單菌落, 提取質(zhì)粒, 進(jìn)行酶切分析, 確認(rèn)有目標(biāo)插入片段的陽性克隆送上海生工測(cè)序, 得到載體pMD-CrPDAT3。

1.4 CrPDAT3 RNAi干涉載體的構(gòu)建

以HindⅢ和BamHⅡ分別酶切質(zhì)粒pMDCrP DAT3和中間載體T282, 回收CrPDAT3正向片段與T282連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 37℃培養(yǎng)12—16h。挑取單菌落提取質(zhì)粒, 用HindⅢ和BamHⅡ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。繼而, 以XbaⅠ和SalⅠ酶切質(zhì)粒pMDCrPDAT3和CrPDAT3正向片段-T282重組質(zhì)粒, 回收并連接上述片段, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌, XbaⅠ和 SalⅠ雙酶切鑒定, 得到含 CrPDAT3正反方向插入的中間載體, 并最終插入表達(dá)載體pMaa7IR/XIR中, 得到CrPDAT3 RNA干涉載體pMaa7IR/ CrPDAT3IR。

1.5 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化

圖1 CrPDAT3與其他物種中的同源基因聚類分析結(jié)果Fig. 1 Clustering analysis of CrPDAT orthologous genes in C.reinhardtii and other species

采用 Glass Beads方法[13], 將 500 μL藻液、400 mg玻璃珠, 100 μL 20%PEG8000和1 μg干涉載體pMaa7IR/CrPDAT3IR共混, 渦旋振蕩器上振蕩 20s。藻細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中, 溫育過夜。收集藻細(xì)胞, 涂布于TAP固體培養(yǎng)基(1.5 mmol/L L-色氨酸、5 μg/mL paromomycin)上培養(yǎng)(7—8)d。挑取單克隆, 進(jìn)行生物量、油脂含量和目標(biāo)基因表達(dá)豐度檢測(cè)。

1.6 油脂含量的測(cè)定

中性脂含量的測(cè)定采用的是酸水解法[14](國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB_T 5009.6-2003)。取適量藻液置于50 mL帶蓋離心管中, 加入滅菌蒸餾水, 混勻后小心加入鹽酸, 置于 80℃水浴中 25min, 然后向管內(nèi)加入 95%的乙醇混勻。冷卻后加入乙醚, 加蓋振搖 1min, 之后開蓋放出氣體。離心3min(4000 r /min), 將上清液移至恒重的錐形瓶中, 重復(fù)洗滌離心管中的殘?jiān)?然后將上清液轉(zhuǎn)移至原先的錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴上蒸干, 再轉(zhuǎn)移至 100℃烘箱中干燥 2h, 取出冷卻后稱重。

2 結(jié)果

2.1 CrPDAT3基因的聚類分析及干涉片段克隆

本研究涉及的萊茵衣藻磷脂二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶同源基因CrPDAT3 JGI數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白ID:186846;Genbank 序列號(hào): XP_001699748。與已報(bào)道的CrPDAT1(Genbank序列號(hào) AFB73928)同源率為41.7%。通過與其他物種的 PDAT聚類分析顯示:CrPDAT3與微藻的PDAT聚為一類, 與酵母和真菌PDAT的關(guān)系較近(圖1)。

2.2 CrPDAT3 RNAi干涉載體的構(gòu)建

RNAi正向和反向片段的獲得 以萊茵衣藻總 RNA反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA為模板, 擴(kuò)增 CrPDAT3 RNAi干涉片段序列(圖2A), 結(jié)果可以擴(kuò)增出一條約250 bp 的條帶, 與預(yù)計(jì)大小一致。經(jīng)克隆進(jìn)pMD18-T后, 得到pMD-CrPDAT3。測(cè)序結(jié)果顯示, 所克隆的CrPDAT3基因片段與JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中CrPDAT3基因序列同源性為100%。通過HindⅢ、BamHⅠ雙酶切, 將該 250 bp CrPDAT3基因干涉片段從質(zhì)粒pMD-CrPDAT3上切下來(圖2B), 然后再進(jìn)行膠回收純化目的片段, 得到CrPDAT3基因正向片段。同理,通過XbaⅠ和SalⅠ將CrPDAT3基因干涉片段從質(zhì)粒pMD-CrPDAT3上切下來(圖2B), 得到反向片段。

圖2 CrPDAT3 RNAi干涉載體構(gòu)建Fig. 2 The construction of CrPDAT3 RNAi interference vector

CrPDAT3基因正向和反向片段與 T282連接利用HindⅢ和BamHⅡ酶切載體T282, 電泳回收大片段, 將其與CrPDAT3基因正向片段連接, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α, 挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果如(圖2C)所示。CrPDAT3基因正向片段連接到T282上后。接下來是在此基礎(chǔ)上連接反向片段, 對(duì)連接有正向片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和SalI雙酶切,電泳回收目的片段, 將其與CrPDAT3基因反向片段連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 挑取單菌落, 利用 EcoRⅠ酶切鑒定(圖2D)。得到中間載體T282-CrPDAT3。

反向重復(fù)片段插入干涉載體 用 EcoRⅠ對(duì)干涉載體pMaa7 IR/XIR和中間載體T282-CrPDAT3進(jìn)行酶切, 回收目的片段并連接, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單克隆, 用EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒酶切鑒定(圖2E)。構(gòu)建成功的干涉載體命名為pMaa7 IR/PDAT3IR。

2.3 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC425及轉(zhuǎn)基因藻株檢測(cè)

各轉(zhuǎn)基因藻株的生物量隨著時(shí)間的增加而增加,其峰值出現(xiàn)在第5天, 與pMaa7 IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻株相比較, pMaa7 IR/PDAT3IR轉(zhuǎn)基因藻株生物量從第3天開始明顯減少, 其最大降幅出現(xiàn)在第4天, 分別為46.71%(圖3)。這說明對(duì)CrPDAT3基因的沉默會(huì)造成萊茵衣藻生長(zhǎng)減緩。

圖3 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株連續(xù)培養(yǎng)6d其生物量的變化Fig. 3 The biomass of CrPDAT3 RNAi transgenic C. reinhardtii after 6 days cultivation

CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株油脂含量的檢測(cè)顯示(圖4): 相對(duì)于對(duì)照pMaa7 IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻株, CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株油脂含量顯著下降, 降幅范圍為 14.65%—45.15%, 說明CrPDAT3對(duì)油脂合成起到重要的作用。顯微鏡檢結(jié)果也顯示(圖5): CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株油脂含量下降。

圖4 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株油脂含量的變化Fig. 4 Lipid content detected through Nile Red staining method in CrPDAT3 RNAi transgenic C. reinhardtii

圖 5 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株在培養(yǎng)至第4天的顯微觀察結(jié)果(×250倍)Fig. 5 Microscopic observations of CrPDAT3 RNAi transgenic C.reinhardtii after 4 days of cultivation in HSM medium, more oil droplets of CrPDAT3 RNAi transgenic algae had been found

為了檢測(cè)CrPDAT3 RNAi干涉載體干涉載體對(duì)目標(biāo)基因的沉默效果, 本實(shí)驗(yàn)采用Realtime PCR方法檢測(cè)培養(yǎng)至第4天的轉(zhuǎn)基因藻株中CrPDAT3基因的豐度[15](圖6)。CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株 CrPDAT3基因 mRNA豐度與對(duì)照 CC425和pMaa7 IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻株比較, 豐度下降, 降幅為71.28%—97.92%, 說明CrPDAT3基因被有效沉默。

3 討論

圖6 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉(zhuǎn)基因藻株CrPDAT3 mRNA豐度Fig. 6 Comparison of the mRNA abundance of CrPDAT3 in transgenic C. reinhardtii

微藻三酰甘油的合成途徑相關(guān)基因及其同源基因的功能是近期研究的熱點(diǎn)。目前, 已經(jīng)報(bào)道的有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)[16],磷脂酸磷酸酶(PAP)[17]等。它們?cè)谖⒃逵椭铣芍衅鹬匾淖饔谩Ａ字８视王；D(zhuǎn)移酶(PDAT)以磷脂作為?；w, 二酰甘油作為受體, 催化形成三酰甘油。與二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶酶(DGAT)一樣, 在萊茵衣藻油脂合成中發(fā)揮重要作用。本研究通過對(duì)萊茵衣藻CrPDAT3基因的沉默, 檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因藻株中油脂含量的降低, 說明對(duì)萊茵衣藻磷脂二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶同源基因CrPDAT3的表達(dá)量的改變, 影響了藻細(xì)胞油脂的積累, 從而推斷該基因在萊茵衣藻三酰甘油的代謝中發(fā)揮重要的作用。Boyle, et al.利用插入突變技術(shù), 篩選得到CrPDAT1基因缺陷的突變體[11]。對(duì)突變?cè)逯暧椭繖z查顯示: 相對(duì)于對(duì)照油脂含量減少 25%。本研究通過 RNAi的方法, 對(duì)萊茵衣藻CrPDAT3進(jìn)行沉默。我們分析3個(gè)knock down的轉(zhuǎn)基因藻株, 得到了轉(zhuǎn)基因藻株中油脂含量降低 14.65%—45.15%的結(jié)果。這說明 PDAT1 和PDAT3 基因在油脂合成中均發(fā)揮作用。目前, 在萊茵衣藻JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)注的有CrPDAT1、CrPDAT2、CrPDAT3三個(gè)同源基因。而同源基因是否都在油脂代謝中發(fā)揮功能, 需要實(shí)驗(yàn)加以證明。今后我們將克隆全長(zhǎng)CrPDAT3基因, 進(jìn)一步確認(rèn)該基因的重要功能, 為該基因在微藻油脂改良、轉(zhuǎn)基因良種培育實(shí)踐應(yīng)用中打下基礎(chǔ)。