電生理技術(shù)在魚類尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)研究中的應(yīng)用

呂為群 程若冰 蘭兆輝

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

電生理技術(shù)在魚類尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)研究中的應(yīng)用

呂為群 程若冰 蘭兆輝

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

200多年前, Galvani通過神經(jīng)-肌肉興奮性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)與電活動(dòng)在功能上具有本質(zhì)的聯(lián)系[1,2]。此后,眾多研究者投入了大量的精力研發(fā)電生理設(shè)備, 逐步開發(fā)出多種能夠精確測量和控制神經(jīng)元電活動(dòng)的儀器, 如:放大器、示波器、刺激器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、微電極等。現(xiàn)代電生理設(shè)備和技術(shù)的更新?lián)Q代為研究單離子通道電流甚至更為復(fù)雜的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)電特性創(chuàng)造了條件[3]。隨著近代電子技術(shù)水平和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展, 電生理技術(shù)已成為研究魚類生理功能、行為特征、環(huán)境適應(yīng)性的一種有效的技術(shù)和方法。尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)(CNSS)是魚類特有的神經(jīng)分泌系統(tǒng), 在維持魚類體內(nèi)滲透壓的平衡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生殖調(diào)控等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。本文主要圍繞電生理技術(shù)的發(fā)展和原理及其在研究 CNSS功能和 Dahlgren細(xì)胞電生理特性等方面的應(yīng)用, 綜述了國內(nèi)外的研究成果和進(jìn)展。

1 電生理技術(shù)

電生理技術(shù)用于記錄生物細(xì)胞和組織的電學(xué)特性,可測量從單離子通道蛋白到整個(gè)器官的多種規(guī)格樣本的電壓或電流變化, 研究不同神經(jīng)組織的自發(fā)和誘發(fā)電活動(dòng)與代謝的關(guān)系。該技術(shù)最初主要用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究,即用電流刺激神經(jīng)系統(tǒng)某一部位, 記錄該部位或單個(gè)神經(jīng)元的電位變化。電生理學(xué)研究方法在神經(jīng)生物學(xué)研究應(yīng)用中優(yōu)點(diǎn)頗多: 對被測樣本損害小; 測量精度高; 重復(fù)性強(qiáng); 實(shí)驗(yàn)方式多樣化, 可針對不同的研究需要采取不同記錄方式; 可以對神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)進(jìn)行定量分析; 便于和其他研究方法配合使用等[3,5,6]。電生理技術(shù)發(fā)展至今, 演化出了適合各種不同研究的記錄方式, 如: 胞外記錄(單細(xì)胞記錄、多細(xì)胞記錄)、胞內(nèi)記錄(電壓鉗、電流鉗)、膜片鉗記錄等。

1.1 電生理技術(shù)的發(fā)展

人類對于生物電現(xiàn)象的記錄可以追溯到 2000多年前。據(jù)記載, 古埃及尼羅河中有一種鯰魚(Phractocephalus hemioliopterus)可產(chǎn)生高達(dá)350V的電壓脈沖[7]。羅馬帝王Claudius時(shí)代(公元41—54年)的Scribonius Largus曾詳細(xì)描述人們利用電鰩治療頭痛病[8]。1791年, Galvani首次報(bào)道用金屬弓觸碰蛙腿肌肉或刺激神經(jīng)時(shí)看到了肌肉的收縮, 提出了動(dòng)物電的概念, 奠定了現(xiàn)代電生理學(xué)的基礎(chǔ)[1,2]。1849年Du Bois-Reymond發(fā)現(xiàn)了生物電的兩種基本形式: 靜息電位和動(dòng)作電位, 使電生理學(xué)開始成為一門獨(dú)立的學(xué)科[5]。20世紀(jì)中葉, Hodgkin, et al.成功證明了電興奮現(xiàn)象和動(dòng)作電位的產(chǎn)生是緣于特定的離子電導(dǎo)變化, 基于此, Cole, et al.發(fā)明了電壓鉗技術(shù), 后經(jīng)Hodgkin, et al.改進(jìn)[9,10]。1976年Neher和Sakmann創(chuàng)建的膜片鉗技術(shù)為電生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展乃至整個(gè)生物學(xué)研究帶來了一場革命, 人類對離子通道本質(zhì)的認(rèn)識也因此有了一個(gè)質(zhì)的飛躍[5—7]。

1.2 常用電生理技術(shù)

細(xì)胞外記錄 細(xì)胞外記錄是電生理技術(shù)常用的記錄方式之一, 其方便之處在于記錄電極不需要插入細(xì)胞,可用一根電極記錄單細(xì)胞或同時(shí)記錄多個(gè)細(xì)胞的電活動(dòng)。由于活動(dòng)部位的神經(jīng)元產(chǎn)生去極化, 不活動(dòng)部位的處于正常極化狀態(tài), 在容積導(dǎo)體中的兩部位間電位不同, 電流從一點(diǎn)流向另一點(diǎn), 兩點(diǎn)間的電位差就會被記錄電極探測到。胞外記錄受樣本限制少, 記錄到的電活動(dòng)穩(wěn)定性好, 可用于長時(shí)間電位誘導(dǎo)和記錄, 并能同時(shí)從不同的神經(jīng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行多導(dǎo)電位記錄。通過不斷地改進(jìn)與發(fā)展, 該方法由僅限于固定、半固定動(dòng)物上的應(yīng)用, 逐漸發(fā)展應(yīng)用于自由活動(dòng)的動(dòng)物[5,7,11]。

細(xì)胞內(nèi)記錄 1939年, Hodgkin, et al.將毛細(xì)玻璃微電極從槍烏賊巨軸突切口縱向插入巨軸突內(nèi), 首次實(shí)現(xiàn)了靜息電位和動(dòng)作電位的細(xì)胞內(nèi)記錄[12]。記錄膜電位需要在膜的兩側(cè)各放置一個(gè)電極形成一個(gè)環(huán)路, 因此記錄電極要插入細(xì)胞膜內(nèi), 這種記錄方法即為電生理細(xì)胞內(nèi)記錄。細(xì)胞內(nèi)記錄可以準(zhǔn)確測量靜息膜電位的絕對值,還能測定興奮性突觸后電位、抑制性突觸后電位及動(dòng)作電位。細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)的發(fā)明, 使得研究個(gè)別單一的神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)機(jī)理、神經(jīng)元膜的生理物理特性以及個(gè)別神經(jīng)元在神經(jīng)回路中的位置和作用成為可能[5,13]。

膜片鉗技術(shù) 膜片鉗技術(shù)屬于現(xiàn)代微電極技術(shù),是傳統(tǒng)微電極技術(shù)的重大進(jìn)步。通常采用尖端經(jīng)過加熱拋光的玻璃微電極吸管與細(xì)胞膜發(fā)生緊密接觸, 在吸管內(nèi)施加負(fù)壓, 使微電極尖端與細(xì)胞膜表面形成 G?級(10—100 G?)的高阻封接(Giga-seal)從而記錄穿過細(xì)胞膜的微弱的電流變化。膜片鉗技術(shù)共有四種基本記錄模式: 細(xì)胞貼附式(Cell-attached recording)、內(nèi)面向外記錄模式(Inside-out recording)、外面向外記錄模式(Outside-out recording)以及全細(xì)胞記錄模式(Whole-cell recording)[14—16]。該技術(shù)可用來記錄反應(yīng)細(xì)胞膜上離子通道分子活動(dòng)的離子電流, 并能與其他生物學(xué)方法結(jié)合進(jìn)行多領(lǐng)域研究。隨著膜片鉗技術(shù)的不斷發(fā)展, 研究對象也逐漸擴(kuò)展到離子泵、交換體以及可興奮細(xì)胞的胞吞、胞吐機(jī)制等方面[6]。

2 CNSS及Dahlgren細(xì)胞

2.1 CNSS的形態(tài)結(jié)構(gòu)

1914年美國學(xué)者Dahlgren首次報(bào)道在魚類脊髓末端發(fā)現(xiàn)有一種不同尋常的具有腺細(xì)胞形態(tài)特征的巨大細(xì)胞,這些巨大細(xì)胞后來被命名為 Dahlgren細(xì)胞。作為魚類所特有的神經(jīng)分泌系統(tǒng), CNSS在維持魚體內(nèi)的滲透壓平衡及生殖調(diào)控等方便發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CNSS由位于尾部脊髓中具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的 Dahlgren細(xì)胞、Dahlgren細(xì)胞向尾端發(fā)出的軸突以及富含軸突末梢和毛細(xì)血管網(wǎng)的尾垂體三部分組成[4,17—19]。Dahlgren細(xì)胞為大型神經(jīng)分泌細(xì)胞, 分泌物通過軸突運(yùn)送到尾垂體, 再由尾垂體直接分泌進(jìn)入尾靜脈, 這樣可以使這些分泌物迅速抵達(dá)靶器官—腎、腸、性腺和肝臟[4], 這恰好便于研究者隨時(shí)間推移測定分泌差異[20]。此外, CNSS作為研究神經(jīng)分泌機(jī)制的良好系統(tǒng)模型, 優(yōu)勢在于體內(nèi)和體外都能對其進(jìn)行研究, 麻醉魚體的CNSS可完全裸露出來, 便于標(biāo)記[21, 22]。

2.2 Dahlgren細(xì)胞形態(tài)、位置、大小

Dahgren細(xì)胞是存在于魚類CNSS中的大型神經(jīng)分泌細(xì)胞, 通常位于脊髓末端的 1—8節(jié), 其主要分泌物有尾加壓素I(UI)、尾加壓素II(UII)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)等, 這些神經(jīng)肽能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和離子平衡[4,17]。Onstott和 Elde發(fā)現(xiàn)UI肽和UII肽集中在軸突膨大部位—尾垂體, 這里是存儲分泌物的部位, 隨后這些分泌物進(jìn)入循環(huán)[23]。Dahlgren細(xì)胞是一種多突起的細(xì)胞, 其形態(tài)和大小通常是變化的, 而且在不同種類的魚中各不相同。細(xì)胞體的形狀有很多種, 如圓形、橢圓形、梭型或不規(guī)則型。細(xì)胞核通常很大, 核中有明顯的核仁。在充滿分泌物的細(xì)胞中,大多數(shù)只有一個(gè)核, 但在缺乏分泌物的細(xì)胞中則可觀察到雙核、三核等多核現(xiàn)象[24]。

3 電生理技術(shù)在CNSS研究中的應(yīng)用

魚類尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)中的 Dahlgren細(xì)胞能夠自發(fā)產(chǎn)生特征性的動(dòng)作電位, 從而影響神經(jīng)肽的分泌, 隨著魚體內(nèi)滲透壓的變化, Dahlgren細(xì)胞的動(dòng)作電位發(fā)放模式也會隨之作出相應(yīng)的改變[25]。Brierley對Dahlgren細(xì)胞幾種放電模式進(jìn)行了定義: 暴發(fā)型(Burst): 由大于20s的不連續(xù)暴發(fā)型動(dòng)作電位構(gòu)成, 每次暴發(fā)之間有大于20s靜息態(tài)間隔; 位相型(Phasic): 表現(xiàn)出不規(guī)則的動(dòng)作電位發(fā)放,包括周期性的高頻(1—3 Hz)和低頻放電(＜1 Hz); 緊張型(Tonic): 由連續(xù)的動(dòng)作電位(約1 Hz)構(gòu)成, 中間只有很少或幾乎沒有間隔[26]。根據(jù)電生理特性的不同, Dahlgren細(xì)胞可分為T1型和T2型兩種, T1型細(xì)胞表現(xiàn)較為活躍, 常會產(chǎn)生特征性的暴發(fā)放電, 而T2型Dahlgren細(xì)胞則相對安靜且興奮性較低, 在輸入去極化電流后只能誘發(fā)單個(gè)的動(dòng)作電位, 這說明T2細(xì)胞對于峰頻具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力[27]。

3.1 Dahlgren細(xì)胞burst發(fā)放的研究

能夠產(chǎn)生長時(shí)間高頻率的暴發(fā)(Burst)型放電是脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物神經(jīng)分泌細(xì)胞的的共同特征, 如哺乳動(dòng)物下丘腦神經(jīng)元[28]、胰腺 β細(xì)胞[29]、巴西利亞海兔(Aplysia brasiliana)R15神經(jīng)元[30]。暴發(fā)放電會提高神經(jīng)肽的分泌率, 隨著放電頻率的增高, 軸突末端神經(jīng)肽的分泌量也隨之增加[31]。Brierley, et al. 用高敏微電極和玻璃吸電極分別對單個(gè)Dahlgren細(xì)胞和Dahlgren細(xì)胞群進(jìn)行研究, 從而對 Dahlgren細(xì)胞產(chǎn)生的電活動(dòng)模式及細(xì)胞膜固有的性質(zhì)有了很好的了解。離體和在體情況下許多Dahlgren細(xì)胞都表現(xiàn)活躍, 且這兩種情況下 Dahlgren細(xì)胞的動(dòng)作電位發(fā)放模式也非常相似。Dahlgren細(xì)胞暴發(fā)放電的產(chǎn)生機(jī)制與已報(bào)道的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞類似, 如垂體后葉荷爾蒙神經(jīng)元[32,33]。在歐洲川鰈Dahlgren細(xì)胞中, 暴發(fā)放電的產(chǎn)生基于膜本身的性質(zhì), 一次長時(shí)間的暴發(fā)放電能夠由短暫的(小于 5s)去極化或超級化電流刺激所激發(fā), 而隨后的后去極化電位(ADP)刺激能夠維持長達(dá)200s的暴發(fā)放電。ADP的產(chǎn)生與一種凹電位(sag電位)相關(guān), sag電位是在膜電位為–50mv的情況下, 注入500ms的超級化電流導(dǎo)致的下凹型超級化應(yīng)答, 由某些離子通道產(chǎn)生的內(nèi)向電流激活。而ADP和sag都是電壓依賴性的, 只有膜電位大于–60mv的情況下才能出現(xiàn), 并且當(dāng)膜電位接近–50mv時(shí), 能夠激發(fā)動(dòng)作電位, 所以暴發(fā)放電只能產(chǎn)生于去極化狀態(tài)的細(xì)胞[34]。

藥理學(xué)研究表明ADP的產(chǎn)生依賴于L型Ca2+通道[17]。當(dāng)缺乏外部鈣離子或者存在 L型 Ca2+通道阻斷劑nifedipine(硝苯吡啶)時(shí), ADP的持續(xù)時(shí)間會明顯減少。BayK 8644(能夠增加L型離子通道開放時(shí)間)會顯著增加ADP持續(xù)時(shí)間, 但 Ca2+激活非選擇性陽離子通道阻斷劑flufenamic acid(氟滅酸)對ADP的持續(xù)時(shí)間沒有效果。用apamin(蜜蜂神經(jīng)毒素)和 charybdotoxin(卡律布德蝎毒素)對Ca2+激活K+通道抑制, 會增加ADP和暴發(fā)放電的持續(xù)時(shí)間。然而, 動(dòng)作電位的波形卻不會受到 apamin/charybdotoxin, nifedipine,BayK 8644以及移除外部Ca2+的影響。在一次暴發(fā)放電過程中, 動(dòng)作電位的發(fā)放由短持續(xù)時(shí)間(小于100ms)的去極化后電位(DAP)維持, DAP同樣具有電壓和L型Ca2+通道依賴性。這些動(dòng)作電位的發(fā)放是電壓依賴性的, 當(dāng)細(xì)胞膜逐漸去極化, 細(xì)胞從靜息態(tài)(約–70mv)轉(zhuǎn)為暴發(fā)型和位相型, 最后轉(zhuǎn)為緊張型(小于–65mv)。持續(xù)10s的暴發(fā)放電之后伴隨著一個(gè)緩慢的 ADP(振幅為 10mv,持續(xù) 10—200s), 并且能夠激發(fā)一個(gè)持續(xù)時(shí)間更長的暴發(fā)放電[34]。

3.2 環(huán)境鹽度變化對Dahlgren細(xì)胞放電的影響

鹽度是影響海水魚類生長的重要環(huán)境因素之一, 而滲透壓調(diào)節(jié)是魚類鹽度適應(yīng)性的關(guān)鍵功能。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn), 參與魚類滲透壓調(diào)節(jié)的主要是直腸腺、鰓和腎等器官上的各種離子通道, 這些通道參與了魚體內(nèi)NaCl 的動(dòng)態(tài)平衡和水分代謝的調(diào)節(jié)作用[14]。川鰈Dahlgren細(xì)胞的特征性的動(dòng)作電位發(fā)放會伴隨著魚體內(nèi)滲透壓的變化而改變。與適應(yīng)淡水(FWA)的川鰈相比, 適應(yīng)海水(SWA)的川鰈離體CNSS標(biāo)本中Dahlgren細(xì)胞暴發(fā)放電更為活躍。同樣的, CNSS在體實(shí)驗(yàn)顯示, SWA川鰈中有更高比例的 Dahlgren細(xì)胞產(chǎn)生暴發(fā)型動(dòng)作電位, 說明CNSS同樣在魚類滲透壓調(diào)節(jié)適應(yīng)中起到關(guān)鍵作用[21,26]。在SWA和FWA標(biāo)本中, T1 Dahlgren細(xì)胞的后超級化電位(AHP)持續(xù)時(shí)間約為 T2細(xì)胞的 5倍, 而 SWA標(biāo)本中T1、T2型 Dahlgren細(xì)胞動(dòng)作電位的持續(xù)時(shí)間明顯大于FWA標(biāo)本。SWA 標(biāo)本中T1型細(xì)胞在超級化電流刺激下會產(chǎn)生sag電位, 而FWA標(biāo)本sag電位的產(chǎn)生具有電壓依賴性, 只有當(dāng)膜電位大于–50mv時(shí), 超級化電流才能激發(fā)明顯的sag電位。T1、T2型Dahlgren細(xì)胞在SWA和FWA標(biāo)本中的膜參數(shù)(靜息膜電位、輸入阻抗)和動(dòng)作電位參數(shù)(閾值、振幅、持續(xù)時(shí)間等)均無明顯區(qū)別。Dahlgren細(xì)胞的放電模式會隨著外部鹽度環(huán)境的變化, 在不同放電模式間轉(zhuǎn)換[26]。

3.3 神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)對Dahlgren細(xì)胞放電調(diào)控的研究

CNSS會受到來自后腦的下行輸入調(diào)控[35], 免疫組化和生物化學(xué)研究表明有腎上腺素、血清素、泌乳刺激素以及膽堿能和肽能等神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)輸入到CNSS中[36—38]。電生理研究發(fā)現(xiàn), 這些神經(jīng)調(diào)質(zhì)能夠促進(jìn)或抑制Dahlgren細(xì)胞的放電, 并會改變動(dòng)作電位發(fā)放的類型[26,39]。Dahlgren細(xì)胞放電類型的不同或者暴發(fā)放電的持續(xù)時(shí)間長短和強(qiáng)度大小都會在很大程度上影響神經(jīng)肽的分泌。例如, 臨產(chǎn)和泌乳時(shí), 下丘腦催產(chǎn)素神經(jīng)元同時(shí)產(chǎn)生高頻率暴發(fā)動(dòng)作電位會脈沖式地釋放神經(jīng)肽, 高頻率暴發(fā)放電能提高神經(jīng)末梢肽的分泌效率, 如細(xì)胞群同時(shí)產(chǎn)生暴發(fā)放電會分泌高濃度的神經(jīng)肽。與催產(chǎn)素神經(jīng)元的染色耦合不同,盡管目前還沒有證據(jù)表明 Dahlgren細(xì)胞之間存在直接連接或突觸連接, 但這些 Dahlgren細(xì)胞動(dòng)作電位的協(xié)同發(fā)放可能會隨著魚類滲透壓水平改變[40]。

一氧化氮(NO) 在神經(jīng)系統(tǒng)中, NO作為一種重要的信使分子參與了學(xué)習(xí)與記憶等重要的神經(jīng)生理活動(dòng),同時(shí)對腦部血流具有調(diào)節(jié)作用, 并參與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫防御[41]。已有報(bào)道表明 NO在哺乳動(dòng)物下丘腦大型神經(jīng)分泌細(xì)胞中起到神經(jīng)調(diào)控的作用。在魚類多個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)中檢測到NOS(一氧化氮合酶)的存在, 如腦電機(jī)系統(tǒng)[42]、視網(wǎng)膜[43]、視前區(qū)-下丘腦-垂體系統(tǒng)[44]以及CNSS[45]。在離體CNSS標(biāo)本藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), NO供體(SNAP, SNP)會增加Dahlgren細(xì)胞動(dòng)作電位發(fā)放頻率(包括之前處于靜息態(tài)的細(xì)胞), 大部分Dahlgren細(xì)胞表現(xiàn)出位相型(phasic)動(dòng)作電位。NOS(一氧化氮合酶)底物L(fēng)-arginine(左旋精氨酸)會導(dǎo)致放電頻率的增加, 激活靜息態(tài) Dahlgren細(xì)胞放電并增強(qiáng)暴發(fā)放電。這些不會受到NOS抑制劑L-NAME(L-硝基精氨酸甲酯)的阻斷, 放電頻率反而會隨著 L-NAME的作用而提高。可見NO在CNSS中起到調(diào)控作用, 能夠有效提高Dahlgren細(xì)胞電活動(dòng)及神經(jīng)肽的分泌[40]。

皮質(zhì)醇 皮質(zhì)醇作為廣鹽性魚類適應(yīng)鹽度環(huán)境的一種重要激素, 能夠激發(fā)魚鰓氯化物分泌細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)氯離子排放, 使魚能夠適應(yīng)海水環(huán)境; 皮質(zhì)醇同樣可以通過調(diào)節(jié)氯化物分泌細(xì)胞的功能使魚類適應(yīng)淡水環(huán)境[46]。Marley, et al.對皮質(zhì)醇調(diào)節(jié)Dahlgren細(xì)胞放電作用的研究顯示, 在對離體 CNSS標(biāo)本進(jìn)行皮質(zhì)醇灌流(15min)期間, Dahlgren細(xì)胞的電活動(dòng)沒有變化, 而經(jīng)過4h的Ringer液沖洗后細(xì)胞才逐漸出現(xiàn)電生理應(yīng)答, 這種應(yīng)答延遲產(chǎn)生的原因可能是由于激活基因組應(yīng)答需要時(shí)間。應(yīng)答期間細(xì)胞電活性適度增強(qiáng), 細(xì)胞放電模式?jīng)]有顯著變化, 但表現(xiàn)出激活靜息態(tài) Dahlgren細(xì)胞并增加暴發(fā)型細(xì)胞數(shù)量的趨勢[47]。

泌乳刺激素 泌乳刺激素能夠促使魚鰓氯化物分泌細(xì)胞去分化[46], 并降低滲透調(diào)節(jié)表面離子和水的通透率,從而使魚類在低滲環(huán)境中能夠存活[48]。Marley, et al.對離體CNSS標(biāo)本進(jìn)行泌乳刺激素灌流, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 Dahlgren細(xì)胞對于泌乳刺激素的應(yīng)答延時(shí)較短, 在藥物灌流及4h的Ringer液沖洗期間內(nèi)細(xì)胞放電頻率均有所增加, Dahlgren細(xì)胞的動(dòng)作電位發(fā)放模式也發(fā)生了改變, 部分靜息態(tài)細(xì)胞被激活, 位相型和暴發(fā)型細(xì)胞數(shù)量有所增加[47]。

5-羥色胺 5-羥色胺(5-HT)出現(xiàn)在CNSS的中央神經(jīng)元部分[49], 免疫組化結(jié)果顯示 Dahlgren細(xì)胞受到下行5-HT神經(jīng)纖維的支配。Hubbard, et al.發(fā)現(xiàn), 對離體CNSS標(biāo)本灌流5-HT會引發(fā)T1型Dahlgren細(xì)胞的靜息膜電位產(chǎn)生濃度依賴性的可逆超級化(5-HT濃度越高, 超級化越明顯), 細(xì)胞膜的輸入阻抗和時(shí)間常數(shù)也會隨著細(xì)胞膜的超級化而減小。在胞內(nèi)記錄點(diǎn)附近注射5-HT會立即中斷自發(fā)性的暴發(fā)放電; 同樣, 在細(xì)胞外記錄時(shí), 灌流 5-HT會中斷所有記錄細(xì)胞的暴發(fā)放電, 停止灌流后15 min暴發(fā)放電恢復(fù), 這表明5-HT對于CNSS活性具有抑制作用。灌流更低濃度的 5-HT1受體激動(dòng)劑 5-carboxamidotryptamine(5-CT)同樣會產(chǎn)生上述效果。然而, T2型細(xì)胞對于5-HT或5-CT均未產(chǎn)生電生理應(yīng)答, 說明T1、T2型細(xì)胞之間存在著功能上的差別[50]。

乙酰膽堿 Conlon, et al.在鮭魚CNSS標(biāo)本中證實(shí)了有乙酰膽堿的分泌, 并發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞膜的去極化, 乙酰膽堿分泌量明顯增加[51]。Brierley, et al.發(fā)現(xiàn)川鰈T1型Dahlgren細(xì)胞的一個(gè)亞群會受到乙酰膽堿的刺激而興奮,乙酰膽堿是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能使這些神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生去極化的神經(jīng)遞質(zhì)[26]。已有研究表明哺乳動(dòng)物垂體后葉荷爾蒙神經(jīng)元會受到乙酰膽堿受體激動(dòng)劑 Oxotremorine (氧化震顫素)和 Nicotine (尼古丁)的調(diào)節(jié)[52,53]。oxotremorine會在很大程度上抑制Dahlgren細(xì)胞放電, 并增加一種非Dahlgren細(xì)胞(α神經(jīng)元)的電活性。分別對海水和淡水適應(yīng)性川鰈 CNSS標(biāo)本進(jìn)行藥物灌流, 發(fā)現(xiàn)Nicotine能夠誘發(fā)SWA Dahlgren細(xì)胞產(chǎn)生暴發(fā)放電(對正在暴發(fā)放電的細(xì)胞無影響), 卻會抑制FWA Dahlgren細(xì)胞的放電[26]。

類腎上腺素 Hubbard, et al.發(fā)現(xiàn)對川鰈CNSS標(biāo)本灌流腎上腺素或去甲腎上腺素會使 Dahlgren細(xì)胞靜息膜電位產(chǎn)生具有濃度依賴性的可逆大振幅超級化, 并可使Dahlgren細(xì)胞的自發(fā)性放電立即中止[50]。超級化會抑制去甲腎上腺素能神經(jīng)元活性, 從而降低激素的分泌速率。輸入阻抗和膜時(shí)間常數(shù)的波動(dòng)表明有多種細(xì)胞機(jī)制受到了超級化的影響, 如細(xì)胞膜表面選擇性離子通道的開放和關(guān)閉。灌流另一種內(nèi)生性兒茶酚胺dopamine(多巴胺)沒有效果, 說明兒茶酚胺誘發(fā)的超級化只能通過腎上腺素受體調(diào)節(jié), 而多巴胺受體沒有參與。灌流β腎上腺素受體激動(dòng)劑 isoprenaline(異丙腎上腺素)也會激發(fā)超級化(低于腎上腺素或去甲腎上腺素激發(fā)的超級化的最大值), 表明 β腎上腺素受體亞形具有一定的調(diào)節(jié)效果。灌流具有膜通透性的非水解 cAMP類似物 8-[4-chlorophenylthio]-cAMP則會引發(fā)一個(gè)小振幅的超極化, 并伴有小幅度膜電阻的增加, 說明 β腎上腺素受體在一定程度上能控制cAMP敏感性離子通道關(guān)閉[39]。已有報(bào)道表明α1腎上腺素受體激動(dòng)劑 phenylephrine(苯腎上腺素)能夠增加哺乳動(dòng)物視上核垂體后葉荷爾蒙神經(jīng)元的放電頻率[54], 而 α2腎上腺素受體激動(dòng)劑 clonidine(氯壓定)則對視上核神經(jīng)分泌細(xì)胞起抑制作用[55]。Hubbard, et al.對Dahlgren細(xì)胞灌流 phenylephrine發(fā)現(xiàn)電生理參數(shù)沒有變化, 而灌流clonidine則會引發(fā)超級化(低于腎上腺素或去甲腎上腺素激發(fā)的超級化的最大值)。這些結(jié)果表明腎上腺素抑制Dahlgren細(xì)胞的活動(dòng)會受到α2和β腎上腺素受體亞形的調(diào)節(jié)[39]。

4 總結(jié)與展望

電生理技術(shù)已滲透到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域, 成為生物學(xué)研究的一種重要技術(shù)手段。將該技術(shù)與分子生物學(xué)、免疫學(xué)、行為學(xué)等領(lǐng)域相結(jié)合, 能夠從細(xì)胞和分子水平揭示生命活動(dòng)的內(nèi)在機(jī)理及其與環(huán)境的相互作用。雖然已對Dahlgren細(xì)胞基本的電學(xué)特性進(jìn)行了報(bào)道, 但往往局限于電活性較強(qiáng)的T1型細(xì)胞, 且主要集中在鹽度應(yīng)激、神經(jīng)調(diào)質(zhì)刺激等條件下T1細(xì)胞放電的變化, 而對于相對活性較低的T2型Dahlgren細(xì)胞的電生理特點(diǎn)、興奮性較低的原因及其在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中的作用有待進(jìn)一步研究。隨著現(xiàn)代電生理技術(shù)的不斷發(fā)展, 魚類應(yīng)對其他應(yīng)激條件刺激時(shí) Dahlgren細(xì)胞的放電變化、更多種類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)對于Dahlgren細(xì)胞放電影響以及對于Dahlgren細(xì)胞膜上各種離子通道的開關(guān)機(jī)制、功能特點(diǎn)及離子的跨膜流動(dòng)等方面的研究必將更加深入。

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THE APPLICATION OF ELECTROPHYSIOLOGICAL TECHNIQUES IN THE STUDY ON THE FISH CAUDAL NEUROSECRETORY SYSTEM

Lü Wei-Qun, CHENG Ruo-Bing and LAN Zhao-Hui
(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China)

電生理技術(shù); 尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng); Dahlgren細(xì)胞; 動(dòng)作電位

Electrophysiological techniques; Caudal neurosecretory system (CNSS); Dahlgren cell; Action potential

S917

A

1000-3207(2014)04-0780-06

10.7541/2014.109

2013-06-18;

2013-12-20

國家自然科學(xué)基金(31072228、41376134); 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)基金(20113104110002); 上海市科學(xué)技術(shù)委員會項(xiàng)目(11PJ1404500); 上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助

呂為群, 教授, 博士生導(dǎo)師; 研究方向?yàn)檫m應(yīng)生理學(xué), E-mail: wqlv@shou.edu.cn