肥胖復合牙周炎大鼠血清及牙齦中TNF－α、IL－1β水平與胰島素抵抗的關系

徐 喆，倪 佳，謝寶儀，軒東英，章錦才

(南方醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院，廣東廣州 510280)

據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年公布，每年至少有280萬的成年人死于肥胖或者超重，是導致死亡的重要因素［1］。另據(jù)報道，牙周炎是成年人失牙的首要因素，并已成為影響我國成年人口腔健康的第一口腔疾?。?］。

有研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合癥可導致更加嚴重、迅速的牙周破壞，而牙周炎又會對全身性疾病產(chǎn)生一定的影響;因此，關于兩者之間的關系越來越受到人們的重視［3－4］。Hotamisligil等［5］(1993)首次提出了肥胖與炎癥聯(lián)系。此后許多研究也指出，脂肪組織不僅是能量的儲存器官，還是活躍的內(nèi)分泌器官［6］;脂肪的炎癥因子可能是連接肥胖、糖尿病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化以及代謝綜合征的紐帶［7－8］。胰島素抵抗是 T2DM 的特征，有研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α、白細胞介素 －1β(Interleukin，IL－1β)可通過介導胰島β細胞的破壞導致胰島素抵抗［9－10］;而 IL－1β 受體拮抗劑及 IL－1β 抗體均可治療 T2DM［11－13］。牙周炎，是以牙周支持組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病。牙周炎部位齦溝液中的IL－1β和TNF－α濃度均高于牙周正常部位，而治療后其濃度則有所下降;提示牙周炎的炎癥程度增加以及預后與 IL－1β的濃度增加有關［4，12.14－15］。牙周炎與肥胖相關性研究認為，牙周炎的發(fā)展除了與糖尿病患者的糖化血紅蛋白、血糖水平控制不良有關外，還與體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，簡稱BMI，體質(zhì)量公斤除以身高米的平方)的增加密切相關;而且肥胖還有可能影響牙周炎的治療效果，并導致更加嚴重的牙槽骨喪失［16－19］。牙周炎與全身疾病相關性研究指出，過高表達的炎癥因子可能會影響全身性疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［11］。本實驗通過觀察肥胖復合牙周炎大鼠牙齦組織和血清中的TNF－α及IL－1β表達水平，及其與胰島素抵抗的關系，探討牙周炎對肥胖機體胰島素抵抗影響的可能機制。

1 .材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

SPF級新生SD大鼠［中山大學實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(粵)2007－0081］;0.01 mol/L PBS 緩 沖 液 (pH7.2 ～ 7.4)、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)、水溶性封片劑 clearmount、固紅、AP－red(北京中杉金橋生物技術有限公司);多聚賴氨酸防脫片載玻片(北京世泰有限公司);兩步法鼠兔通用免疫組化染色二抗試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒(DAKO生物技術有限公司);生物素化SABC抗鼠三步法試劑盒、白細胞介素－1β抗體、腫瘤壞死因子－α抗體(武漢博士德生物工程有限公司);pH測試儀(PHSJ－3F，上海精科);磁力恒溫攪拌器(IKA，德國);電子天平0.0001g(BP110S，Sartorius，德國);恒溫孵箱(Heraeus，德國);可調(diào)移液器(Eppendorf，德國);超低溫冰箱(Sanyo，日本);倒置顯微鏡(Olypus，日本);低溫離心機(Thermo，美國);超純水機(Milli－QUltra－Pure，Millipore，Billerica，MA，德國)。

1.2 方法

1.2.1 肥胖復合牙周炎動物模型的建立

取健康新生SD大鼠32只(均為雄性)，隨機分為正常對照(C)組、牙周炎(CP)組、肥胖(OB)組、肥胖復合牙周炎(OB+CP)組，共4組，每組8只。C組各大鼠不施加任何干預措施用于對照。CP組各大鼠于12周齡時分別在100 g/L水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉下，用0～3號絲線(泰絲)結(jié)扎其左、右上頜第一、二磨牙頸部(結(jié)扎絲盡量置于齦溝內(nèi));同時在齦溝內(nèi)涂布牙齦卟啉單 胞 菌 (Porphyromonas gingivalis，Pg)ATCC33277、伴放線嗜血桿菌(Hctinobacillus actinomycetemcomitans，Ha)ATCC29523、中間普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)ATCC25611、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)ATCC255864種主要牙周致病菌的混合菌懸液(109CFU/mL)，建立牙周炎模型。OB組各大鼠分別于出生后第2、4、6、8、10 天，皮下注射谷氨酸鈉(sigma，3 mg/kg)建立肥胖模型。OB+CP組各大鼠按OB組的方法建立肥胖模型后，再于12周時按CP組的方法結(jié)扎左右上頜第一、二磨牙頸部，建立肥胖復合牙周炎模型。各組所有大鼠均于出生后21 d斷乳，單籠普通飼料(無菌真空包裝，廣東省實驗動物中心提供)飼養(yǎng);自由攝食和飲水。

建模期間，每天觀察大鼠活動、攝食、排泄等情況;并分別于實驗第0天及處死前由2名實驗人員用電子秤分別稱量各組動物體質(zhì)量2次，取平均值。

1.2.2 ELISA法檢測各組大鼠血清中 TNF－α、IL－1β的水平

建模結(jié)束后取各大鼠的血清，用免疫酶聯(lián)吸附反應(ELISA)法檢測血清中TNF－α及IL－1β的水平。ELISA具體步驟:取出酶標板分別將標準品和標記有編號的各樣品各100 μL依次加入空白微孔中;然后在標準品孔和樣品孔中各加入50 μL的酶標記溶液，(36±2)℃條件進行孵育;60 min后用PBS清洗5次(每次靜置10～20 s)，并分別于每孔加入底物 A、B 液各 50 μL，(36±2)℃避光孵育15 min;每孔加入50 μL終止液終止反應后，用酶標儀分別測各孔450 nm波長處的吸光度值(OD值)。以標準品OD值/標準品0點OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線;然后根據(jù)各樣品OD值即可在曲線上查到對應的TNF－α和IL－1β濃度值。

1.2.3 免疫組化檢測各大鼠牙周組織中TNF－α、IL－1β 的表達

建模結(jié)束后處死所有大鼠，分別取其上頜第一、二磨牙牙齦組織，并常規(guī)制備石蠟切片;然后采用免疫組化 Envision二步法檢測 TNF－α以及IL－1β的蛋白表達水平。具體方法:切片置60°C恒溫箱中烤片2 h后，常規(guī)脫蠟至水;30 mL/L過氧化氫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;PBS洗5 min×3次，滴加枸椽酸鹽溶液微波修復抗原(高火 6 min，中低火 7 min);PBS洗5 min×3次，滴加稀釋的一抗，4°C過夜;PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育20 min;PBS洗5 min×3次，顯色劑DAB顯色;自來水充分漂洗終止顯色后，透明、蘇木精復染、封片，顯微鏡下觀察。陰性對照組以PBS液代替一抗，其余步驟相同。結(jié)果判定:TNF－α以及IL－1β陽性染色為棕褐色、定位于細胞質(zhì)內(nèi)。采集各組圖像，并用圖像分析系統(tǒng)計算其光密度值作為TNF－α和IL－1β蛋白的相對表達量。

1.2.4 計算胰島素抵抗指數(shù)HOMA－IR

于大鼠處死前，禁食12 h，剪尾法取血，檢測大鼠空腹血糖(強生豪穩(wěn)微量血糖儀)值;取血清，免疫酶聯(lián)吸附反應法(ELISA法)檢測并記錄空腹血清胰島素表達水平，計算方法如下。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組血清TNF－α水平比較及其與胰島素抵抗的相關性

各組大鼠血清 TNF－α水平以正常對照組(C組)最低，OB+CP組最高，由低到高依次為:C 組(33.952±6.990)＜CP 組(42.800±7.452)＜OB組(49.356±3.159)＜OB+CP組(85.036±9.532)，各組間兩兩相比，除OB組與CP組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);干預主效應及其相互作用分析顯示:牙周炎(F=77.275，P=0.000)與肥胖(F=129.489，P=0.000)兩處理因素對于機體血清TNF－α水平的升高具有協(xié)同交互作用(F=28.061，P=0.000)(表 1)。

各組HOMA－IR評分以OB+CP組最高，依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組;相關性分析顯示，血清 TNF－α水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA－IR)呈正相關(r=0.854)(圖1)。

表1 各組血清TNF－α水平(ng/mL)比較(n=8，)

表1 各組血清TNF－α水平(ng/mL)比較(n=8，)

*主效應的F統(tǒng)計量和P值;#交互效應的F統(tǒng)計量和P值

項目 CP(+) CP(－) Sum F/t P OB(+)85.036 ± 9.53249.356 ±3.15967.196 ±19.660 10.049 0.000 OB(－ )42.800 ± 7.45233.952 ±6.99038.376 ± 8.342 2.449 0.028 Sum 63.918 ±23.32441.654 ±9.52552.786 ±20.858 77.275* 0.000*F/t P 9.8730.0005.6800.000129.489*0.000* (F=28.061，P=0.000)#

圖1 血清TNF－α水平與HOMA－IR相關性分析

2.2 各組血清IL－1β水平比較及其與胰島素抵抗的相關性

各組大鼠血清IL－1β水平以正常對照組(C組)最低，OB+CP組最高，由低到高依次為:C組(55.733±7.585)＜OB 組(65.238 ±5.959)＜ CP 組(68.245 ±7.060)＜ OB+CP 組(108.512 ±8.732)，各組間相比，除OB組與CP組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外，其余各組間均有顯著差異(P＜0.05);干預主效應及相互作用分析顯示:牙周炎(F=113.630，P=0.000)與肥胖(F=90.460，P=0.000)兩處理因素對于機體血清IL－1β水平的升高具有協(xié)同交互作用(F=34.519，P=0.000)(表2)。各組 HOMA－IR 評分顯示以OB+CP組最高，依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組;血清IL－1β水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA－IR)呈正相關(r=0.730)(圖2)。

表2 各組血清IL－1β水平(ng/mL)比較(n=8，)

表2 各組血清IL－1β水平(ng/mL)比較(n=8，)

*主效應的F統(tǒng)計量和P值;#交互效應的F統(tǒng)計量和P值

項目 CP(+) CP(－) Sum F/t P OB(+)108.512 ± 8.73265.238 ±5.959 86.875 ±23.484 11.577 0.000 OB(－) 68.245 ± 7.060 55.723 ±7.585 61.984 ± 9.587 3.417 0.000 Sum 88.378 ±22.164 60.481 ± 8.220 74.430 ±21.708113.630* 0.000*F/t P 10.1420.0002.7900.00090.460*0.000* (F=34.519，P=0.000)#

圖2 血清IL－1β水平與HOMA－IR相關性分析

2.3 各組牙齦組織中TNF－α和IL－1β的表達水平

與正常對照組相比，CP組和OB+CP復合組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平均顯著升高(P＜0.05)，其中以CP組升高最明顯，與OB+CP組相比，差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);OB組牙齦組織中的TNF－α和IL－1β水平均較正常對照組略有下降(P＞0.05)，分別與單純CP組，OB+CP復合組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3～4)。

圖3 各組大鼠牙齦組織中TNF－α相對表達量比較

圖4 各組大鼠牙齦組織中IL－1β相對表達量比較

3 討論

近20年間，肥胖在全球各發(fā)達國家以及發(fā)展中國家的發(fā)病率均在逐年上升，加之其有可能導致糖尿病、心血管疾病以及胰島素抵抗等多種影響全身健康的并發(fā)癥，而越來越受到人們的廣泛關注。此外，肥胖還與多種口腔疾病尤其是牙周病有關;而牙周炎和肥胖又均與多種炎癥相關因子的慢性分泌有關，兩者有著共同的病理機制［20－24］。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，CP組、OB組以及OB+CP組血清中的TNF－α、IL－1β的表達水平均較正常對照組顯著升高。其中以OB+CP組升高的幅度最大，與其他模型組相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。析因方差分析顯示，牙周炎和肥胖兩處理因素對大鼠血清的TNF－α、IL－1β升高有協(xié)同效應作用;而TNF－α、IL－1β水平又與抵抗指數(shù)呈正相關。提示，牙周炎可能通過促進相關炎癥因子分泌而影響肥胖機體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，分析可能機制如下:①肥胖狀態(tài)下，脂肪組織分泌的炎癥因子可導致機體發(fā)生一系列的“瀑布級聯(lián)反應”，從而使相應的炎癥反應增強，本課題組前期的研究曾發(fā)現(xiàn)，牙周炎能促進肥胖機體脂肪組織中巨噬細胞的集聚［24］;②牙周炎相關致病微生物及其產(chǎn)物可刺激牙周組織產(chǎn)生高濃度的炎癥因子，并通過破潰的牙齦上皮進入血循環(huán)，從而提高了血清中炎癥因子的水平;③細菌相關產(chǎn)物進入血液循環(huán)后，可通過與巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合而激活NF－κB信號通路，然后再進一步激活相關炎癥基因的表達，并通過復雜的相關機制促進炎癥反應以及IR的發(fā)生［25－26］。

本結(jié)果顯示:OB組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平均較正常對照組有所下降，但無顯著差異;OB+CP組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平雖較正常對照組顯著升高，但明顯低于CP組。提示，可能與肥胖狀態(tài)下機體的固有免疫機制受損，從而使得局部組織對炎癥反應水平降低有關。TNF－α是目前已知且公認的參與胰島素抵抗的重要炎癥因子［27］，也是牙周炎發(fā)生發(fā)展的重要炎癥指標。肥胖時，脂肪組織分泌的大量TNF－α不僅能降低胰島素的敏感性，而局部組織中升高的TNF－α還可通過激活破骨細胞而導致骨吸收［28］，從而加快了牙周炎的進程。IL－1β是胰島素抵抗中的關鍵因子，與胰島素抵抗、細胞因子產(chǎn)生以及炎癥信號通路激活等密切相關。有研究顯示，牙周炎狀態(tài)時，局部組織和血清的IL－1β濃度均高于健康對照者;升高的IL－1β不僅含影響代謝綜合癥的進程，還可能影響遠處的重要器官、組織，并使其產(chǎn)生相應的病理、生理學變化［29－30］。

本結(jié)果提示，在肥胖機體中，牙周炎可能通過促進其血清中TNF－α及IL－1β的分泌而加劇胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展;在不肥胖機體中，牙周炎雖可在一定程度上增加了牙齦局部組織以及血清中炎癥因子的表達，但尚不足以引發(fā)機體發(fā)生胰島素抵抗。因而，牙周健康的維護對于伴隨有肥胖且有慢性炎癥狀態(tài)的人群更具有重要的意義。

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