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    染料木素對人胃癌MGC—803細(xì)胞增殖及PKA活性的影響

    2014-11-05 01:04:22韓銀淑
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2014年28期
    關(guān)鍵詞:異黃酮細(xì)胞系培養(yǎng)液

    韓銀淑

    [摘要] 目的 本文通過研究染料木素(Gen)對體外培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞增殖以及PKA活性的影響,探討Gen抑制MGC-803細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制。方法 光鏡下觀察經(jīng)Gen處理后人胃癌MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用MTT法檢測Gen對體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖影響;PepTag法檢測Gen對MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié)。結(jié)果 與空白對照組比較,經(jīng)Gen處理后MGC-803細(xì)胞外形呈不規(guī)則狀、細(xì)胞間隙增大、折光性差;MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖,并且抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性;濃度為40 μg/mL的 Gen可以顯著上調(diào)MGC-803細(xì)胞的PKA活性(P<0.01)。結(jié)論 Gen對人胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞的增殖有抑制作用,上調(diào)PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

    [關(guān)鍵詞] 染料木素;MGC-803細(xì)胞;PKA活性

    [中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701(2014)28-0001-03

    染料木素(Genistein,Gen)是一種來源于大豆或其他豆科植物的大豆異黃酮,其具有類雌激素、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等生物活性。流行病學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Gen能降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴型腫瘤的發(fā)生率,對激素依賴型腫瘤的預(yù)防和治療有一定的療效。此外,Gen對消化道腫瘤也有明顯的抑制作用,然而其抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚[3]。本文通過研究Gen對人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖及PKA活性的影響,探討Gen抑制MGC-803細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制,為Gen在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)胞系

    人胃黏液性腺癌細(xì)胞株MGC-803由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室贈予。培養(yǎng)基選用RPMI-1640完全培養(yǎng)液,加10%滅活hyclon胎牛血清、100 IU/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。收集MGC-803細(xì)胞,稀釋至1×105/mL,接種于培養(yǎng)皿,37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)MGC-803細(xì)胞生長覆蓋了80%培養(yǎng)皿表面積時(shí)要傳代,實(shí)驗(yàn)時(shí)取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞。

    1.2 藥物與試劑

    RPMI-1640培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品;胎牛血清為Hyclon產(chǎn)品;Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA為Sigma-Aldrich產(chǎn)品;PKA活性檢測試劑盒為Promega產(chǎn)品。Gen為陜西天行健生物化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品,用1 mL MSO溶解配成濃度為40 mg/mL原液,4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液將Gen溶液稀釋到所需要的濃度。

    1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器

    Milli-Q超純水系統(tǒng)為MILLIPORE產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為NuAire生產(chǎn);電泳槽為BIO-RAD;CKX31型倒置顯微鏡為日本Olympus;IF-90紫外透射儀為上海顧林電光儀器廠生產(chǎn)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 Gen對MGC-803細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組(完全培養(yǎng)基)、空白對照組和Gen處理組。將對數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞收集、離心并去除上清液,稀釋MGC-803細(xì)胞至5×104個/mL。按每孔200 μL將MGC-803細(xì)胞接種于3塊96孔培養(yǎng)板,37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。然后棄除培養(yǎng)液,Gen處理組分別加入用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的不同濃度Gen溶液200 μL/孔(Gen濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL), 空白對照組則加RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL/孔,空白對照組和Gen處理組均設(shè)3個平行孔。在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,各組均在實(shí)驗(yàn)終止前4 h時(shí)加5 mg/mL濃度的MTT 20 μL/孔,并于4 h后棄除上清液,每孔再加DMSO 150 μL。以空白組(完全培養(yǎng)基)將酶標(biāo)儀調(diào)零,570 nm波長下測定OD值,計(jì)算Gen對GMC-803細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-Gen處理組平均OD值/空白對照組平均OD值)×100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

    1.4.2 Gen對MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組和Gen處理組。上述兩組均培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)液,空白對照組加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液,Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL,各組均設(shè)平行孔3個。37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后,光鏡下觀察經(jīng)Gen處理后MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

    1.4.3 Gen對MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié) 收集對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞,稀釋至5×104個/mL,接種于培養(yǎng)皿,并隨機(jī)分為空白對照組、40 μg/mL Gen處理組??瞻讓φ战M加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液,40 μg/mL Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL,各組均設(shè)平行孔3個,37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。按試劑盒說明分別進(jìn)行樣品提取、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白、分離磷酸化和非磷酸化的PepTag短肽、熒光光度計(jì)定量分析檢測PepTag結(jié)果及計(jì)算各組的PKA活性。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均服從正態(tài)分布。統(tǒng)計(jì)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析比較多組間均數(shù),進(jìn)一步的兩兩比較則分別采用SNK法和Dunnet-t檢驗(yàn)。兩組間采用配對t檢驗(yàn),P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Gen對MGC-803細(xì)胞增殖的影響

    MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gen對體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖有抑制作用,且抑制作用呈時(shí)間及濃度依賴性。用Gen處理24 h后,10 μg/mL Gen組、20 μg/mL Gen組、40 μg/mL Gen組與空白對照組比較,對MGC-803細(xì)胞的抑制作用顯著(P<0.01);Gen處理48h后,5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組對MGC-803細(xì)胞的抑制作用顯著(P<0.01);而處理72 h后,所有Gen處理組均對MGC-803細(xì)胞有顯著抑制作用(P<0.01)。Gen處理48 h和72 h與24 h比較,Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組與空白對照組比較有抑制作用(P<0.05),而對于2.5 μg/mL組,僅處理72 h時(shí)有抑制作用(P<0.05)。Gen處理72 h與48 h相比較,Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在Gen濃度為40 μg/mL時(shí),處理72 h后對MGC-803抑制率達(dá)72.3%,見表1。

    2.2 Gen對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響

    光鏡下可見空白對照組MGC-803細(xì)胞生長狀態(tài)良好,貼壁生長旺盛。細(xì)胞外形輪廓清晰、細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密、大小均勻,呈現(xiàn)多邊形或梭形,且細(xì)胞質(zhì)的折光性較強(qiáng)。而經(jīng)過Gen處理后,發(fā)現(xiàn)MGC-803細(xì)胞生長狀態(tài)較差,細(xì)胞外形呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則狀、細(xì)胞間隙明顯增大,且細(xì)胞質(zhì)折光性較差,見圖1 。

    2.3 Gen對MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié)

    采用濃度為40 μg/mL的Gen處理MGC-803細(xì)胞,培養(yǎng)48h后檢測PKA活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白對照組PKA活性為(0.571±0.053) U/mL,而Gen處理組PKA的活性為(0.97±0.09) U/mL,兩組間差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),如圖2。

    3 討論

    Gen是一種來源于大豆以及其他豆科植物中的大豆異黃酮,其具有雌激素、抗氧化、調(diào)血脂等功能。流行病學(xué)調(diào)查表明,在經(jīng)常食用豆制品的日本乳腺癌發(fā)病率僅為美國的1/4[4],Gen可以降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴型腫瘤的發(fā)生率。有研究[3,5]亦發(fā)現(xiàn),Gen可以抑制子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞(JEC)、人肝癌SMMC-7721、人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,然而Gen抗腫瘤作用分子機(jī)制尚不十分清楚[3]。本文研究發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比較,光鏡下經(jīng)Gen處理的MGC-803細(xì)胞折光性差,細(xì)胞間隙增大,提示Gen對體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用;而MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Gen可以顯著地抑制MGC-803細(xì)胞增殖,并隨著作用時(shí)間和濃度的增加而增強(qiáng),呈時(shí)間及濃度依賴性。

    cAMP-PKA信號通路介導(dǎo)一系列的神經(jīng)遞質(zhì)、激素等胞外信號進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),激活此通路可抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)分化[4-10]。PKA通過磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。如PKA可催化CREB(cAMP-responsive element binding Protein,CREB)、CREM(cAMP-responsive element binding modulator,CREM)及ATF1(activating transcription factor 1,ATF1)磷酸化,被激活的轉(zhuǎn)錄因子與CBP(CREB binding protein)和p300結(jié)合調(diào)控下游靶基因[8,11]。實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)Gen可以激活SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP-PKA信號通路,經(jīng)濃度為15μg/mL的Gen處理5min和10min后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高了11.0%和40.3%[9]。本文研究顯示,濃度為40μg/mL的Gen作用MGC-803細(xì)胞48h后,可以顯著提高M(jìn)GC-803細(xì)胞的PKA活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Gen亦可以不經(jīng)過第二信使cAMP而直接激活PKA,進(jìn)而抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖。綜上所述,Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細(xì)胞系的增殖,上調(diào)PKA活性可能是Gen抑制MGC-803細(xì)胞增殖機(jī)制之一。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2014-05-05)

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    (收稿日期:2014-05-05)

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