對葉百部中氧化對葉百部堿的分離鑒定及測定

王孝勛，郭振旺，李耀華，梁臣艷*，梁 丹

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530001;2.廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所，廣西梧州 543002)

對葉百部為百部科植物對葉百部Stemona tuberosa Lour.的干燥塊根，具有潤肺下氣止咳、殺蟲滅虱的功效，用于新久咳嗽、肺癆咳嗽、百日咳;外用于頭虱、體虱、蟯蟲病、陰癢?，F(xiàn)代藥理研究表明百部根的提取物具有抑菌［1］、抗真菌［2］、抗病毒［3］、殺蟲［4］、止咳［5］等作用。對葉百部為《中國藥典》2005年版、2010年版所收載百部藥材的3個來源品種之一［6］，為多基原藥材。但百部項下僅有性狀、鑒別、浸出物等項目，質(zhì)量標準研究較為薄弱，缺乏有效成分的量化評價指標。對于多基原藥材應分別進行研究，制定能反映其內(nèi)在質(zhì)量的規(guī)范標準［7］。生物堿是百部的脂溶性部位的主要成分，同時也是百部提取物的主要活性成分［8-10］。廣西為對葉百部的主要產(chǎn)地［11-13］，但未見對葉百部生物堿成分的定量測定文獻報道。本實驗用硅膠柱色譜法、制備液相等分離方法從對葉百部中分離了氧化對葉百部堿，并用HPLC法建立了中藥對葉百部中氧化對葉百部堿的定量測定，為完善中藥材對葉百部的質(zhì)量標準提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200分析型高效液相色譜儀 (美國Aglient公司、DAD檢測器);LC-8A半制備型高效液相色譜儀 (日本島津公司);RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠);Millipore Simplicity-185超純水儀 (美國Millipore公司);BP211D型電子分析天平 (德國Sartorius公司);KQ5200DB超聲波清洗儀 (江蘇昆山市超聲儀器有限公司);X-4數(shù)字顯示顯微熔點測定儀 (北京泰克儀器有限公司);柱色譜和薄層色譜用硅膠均系青島海洋化工廠生產(chǎn);乙腈為色譜純 (美國Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純;氧化對葉百部堿對照品 (自制，純度98.1%)。

對葉百部藥材采自廣西各地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物教研室韋松基教授鑒定為百部科百部屬植物對葉百部Stemona tuberosa Lour.的塊根，標本存放于廣西中醫(yī)藥大學藥學院。

2 方法與結果

2.1 氧化對葉百部堿的提取、分離和結構鑒定取對葉百部藥材3 kg，粉碎，加乙醇30 L于85℃回流提取2次，每次2 h，提取液過濾、合并，濾液80℃減壓濃縮成糖漿狀，得稠浸膏約1 kg。稠浸膏用4700 mL 4%鹽酸溶解，酸水液過濾，濾液加1000 mL氨水調(diào)pH到9，堿水液用三氯甲烷萃取2次 (三氯甲烷總用量4800 mL)，合并三氯甲烷層，三氯甲烷層用水洗滌1次 (水總用量3600 mL)，分取三氯甲烷層，減壓回收三氯甲烷，得總生物堿約30 g，得率為1%。取總生物堿30 g，甲醇溶解，硅膠60 g拌樣;上柱，硅膠600 g(柱徑比1∶9);以三氯甲烷→三氯甲烷-甲醇 (95∶5→90∶10→85∶15)→甲醇梯度洗脫。取三氯甲烷-甲醇 (95∶5)洗脫液，經(jīng)減壓濃縮后得洗脫物約15 g。取洗脫物經(jīng)多次半制備HPLC法和重結晶，得到無色細針狀結晶22 mg，經(jīng)分析型HPLC分析純度為98.1%。經(jīng)結構鑒定為氧化對葉百部堿，結構式見圖1。

圖1 氧化對葉百部堿結構式Fig.1 Structural formula of oxotuberostemonine

無色細針狀結晶 (甲醇)。mp 89～91℃ (溫度未校正)。薄層顯色反應:以三氯甲烷-甲醇(80∶20)展開，改良碘化鉍鉀顯色為橘紅色。

EI-MS(m/z):389［M］+(44)，360［MC2H5］+(100)，290 ［M-C5H7O2］+(78)。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ:2.05(1H，m，2-Hα)，1.60(1H，m，2-Hβ)，3.65(1H，m，3-H)，3.42(1H，m，5-H)，3.30(1H，m，5-H)，1.85(2H，m，6-H)，1.50(2H，m，7-H)，2.61(1H，t，8-Hα)，2.45(1H，m，8-Hβ)，2.40(1H，m，H-10)，4.26(1H，m，H-11)，3.05(1H，dd，J=8.1，11.7 Hz，12-H)，2.23(1H，m，13-H)，1.35(3H，d，J=7.2，15-H)，1.40(2H，m，16-H)，0.98(3H，d，J=6.6，17-H)，3.98(1H，s，18-H)，2.15(1H，m，19-Hα)，1.80(1H，t，J=10.5，9.9，12.0 Hz，19-Hβ)，2.72(1H，m，20-H)，1.22(3H，d，J=6.9 Hz，22-H)。13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ:87.07(C-1)，37.72(C-2)，66.73(C-3)，53.33(C-5)，26.02(C-6)，32.67(C-7)，34.57(C-8)，142.22(C-9)，122.23(C-9a)，42.68(C-10)，67.21(C-11)，38.96(C-12)，52.63(C-13)，181.98(C-14)，15.02(C-15)，27.04(C-16)，9.50(C-17)，85.12(C-18)，34.75(C-19)，36.19(C-20)，181.55(C-21)，13.17(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［14］報道基本一致，鑒定為氧化對葉百部堿。

2.2 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相為乙腈-水溶液(45∶55)，體積流量為1.0 mL/min，檢測波長242 nm，柱溫30℃。進樣量20 μL。在此色譜條件下，樣品在與對照品相對應的保留時間出現(xiàn)相同的色譜峰，理論塔板數(shù)4000以上，分離度大于1.5。見圖2。

圖2 氧化對葉百部堿對照品及對葉百部藥材HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of oxotuberostemonine and Stemona tuberose

2.3 對照品溶液的制備 取氧化對葉百部堿對照品適量，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，制得每1 mL含0.141 mg的對照品貯備液。

2.4 供試品溶液的制備 取干燥對葉百部樣品粉末約1 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，超聲提取40 min，濾過，濾渣繼續(xù)加入50 mL甲醇，超聲提取40 min，濾過，合并2次濾液，濃縮定容到2 mL量瓶中。濃縮液經(jīng)10000 r/min離心15 min，即得供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 取氧化對葉百部堿對照品貯備液1、2、4、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別取5個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積。以氧化對葉百部堿進樣量 X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得氧化對葉百部堿回歸方程為 Y=523.7X-10.57，r=0.9997。結果表明氧化對葉百部堿在0.282～2.82 μg之間呈良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗 取對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別測定氧化對葉百部堿峰面積，RSD為0.81%，結果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(廣西上思)，按“2.2”項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h注入高效液相色譜儀，測定氧化對葉百部堿的峰面積，RSD為0.35%，結果表明本實驗在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批對葉百部藥材 (廣西上思)約1 g，精密稱定，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄氧化對葉百部堿的峰面積，計算，平均含有量為2.67 mg/g，RSD為0.26%，結果表明本法重復性較好。

2.5.5 加樣回收試驗 取6份已知含有量的樣品粉末 (廣西上思)，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入與藥材相當量的氧化對葉百部堿對照品。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄氧化對葉百部堿的峰面積，計算平均回收率為99.63%，RSD為1.9%。

表1 氧化對葉百部堿加樣回收考察結果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.6 樣品測定 分別取10批藥材樣品粉末約1 g，每批樣品平行3份，精密稱定。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行分析測定。根據(jù)標準曲線計算氧化對葉百部堿的量，結果見表2。

表2 10批藥材樣品中氧化對葉百部堿的測定結果 (n=3)Tab.3 Determination of oxotuberostemonine in Stemona tuberose(n=3)

3 討論

本研究采用甲醇超聲提取、HPLC法測定對葉百部中氧化對葉百部堿的量，結果表明10批藥材樣品中均含有一定量的氧化對葉百部堿，平均含有量為2.99 mg/g。但不同產(chǎn)地的藥材中氧化對葉百部堿的量相差較大，其中廣西大新最高 (5.83 mg/g)，廣西隆林含有量最低 (0.69 mg/g)，含有量最高值和最低值相差8倍以上，說明對葉百部藥材的質(zhì)量存在較大的差異。這可能與各地土壤狀況、日照強度、栽培條件、栽培時間、采集季節(jié)等因素有關，原因有待進一步探討。

對葉百部是《中國藥典》收載的百部品種來源之一，其成分研究比較深入，報道較多，但現(xiàn)行藥典中尚無成分定量測定，有關氧化對葉百部堿的定量測定也未見報道，本研究以各產(chǎn)地藥材中制備分離得到的共有化合物氧化對葉百部堿為指標進行質(zhì)量評價，該方法簡單、可行，可在一定程度上反映對葉百部藥材的質(zhì)量，可以考慮以其為對照品，評價其質(zhì)量。為保證評價方法的科學性和可操作性，應考慮深入研究氧化對葉百部堿的生源途徑、理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及其藥效。

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