鼻腦通鼻用噴霧劑抑制過氧化氫致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的研究△

侯虹麗，孫芳玲，咸明慧，趙潤懷，肖蘇萍，艾厚喜，張麗，王文*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院，北京 100053；2.北京祈福瑞草醫(yī)藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2011ZX09102-003-05)

*

王文，主要研究方向：神經(jīng)藥理、中藥藥理；Tel：(010)83198881，E-mail：lzwwang@163.com

鼻腦通鼻用噴霧劑抑制過氧化氫致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的研究△

侯虹麗1，孫芳玲1，咸明慧2，趙潤懷3，肖蘇萍3，艾厚喜1，張麗1，王文1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院，北京 100053；2.北京祈福瑞草醫(yī)藥科技有限公司，北京 100094；3.中國藥材公司，北京 100195)

目的研究鼻腦通對H2O2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響。方法培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞給予鼻腦通(0.04，0.4，4 μg·mL-1)預(yù)孵育24 h后，加入H2O21 000 μmol·L-1作用18 h誘導(dǎo)產(chǎn)生損傷，測定細(xì)胞上清液中血管活性肽內(nèi)皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)；炎癥因子白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)；致痛物質(zhì)P物質(zhì)(SP)、5-羥色胺(5-HT)、一氧化氮(NO)的含量。結(jié)果與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液血管活性肽ET-1、CGRP含量顯著增多(P<0.01，P<0.05)；炎癥因子IL-8含量顯著增多(P<0.01)；致痛物質(zhì)SP、5-HT、NO含量顯著增多(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。而與損傷組相比，鼻腦通中、高劑量組細(xì)胞上清液血管活性肽ET-1含量降低(P<0.05，P<0.001)，且炎癥因子IL-8含量也降低(P<0.05，P<0.01)；鼻腦通中、高劑量組致痛物質(zhì)SP含量比損傷組減少(P<0.05，P<0.05)，高劑量組5-HT、NO含量比損傷組減少(P<0.05，P<0.05)。結(jié)論鼻腦通治療偏頭痛的機(jī)制可能與降低H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷后血管活性肽ET-1、炎癥因子IL-8釋放以及抑制致痛物質(zhì)SP、5-HT、NO的釋放有關(guān)。

鼻腦通；SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞；ET-1；CGRP；IL-1α；IL-8；SP；5-HT；NO

國內(nèi)外研究表明，多種心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病在一定程度上歸咎于炎癥反應(yīng)，而活性氧(ROS)則是炎癥反應(yīng)的重要誘發(fā)因素之一[1]。過氧化氫(H2O2)常用作細(xì)胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑，通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而參與多種神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)病機(jī)制。文獻(xiàn)報道顯示，在心肌細(xì)胞H2O2誘導(dǎo)損傷模型上，觀察到細(xì)胞內(nèi)TNF-α、TGF-β1、NF-κB等炎癥因子的表達(dá)[2]；在小鼠皮層神經(jīng)元H2O2誘導(dǎo)損傷模型和SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型上，檢測親環(huán)蛋白A(CypA)的表達(dá)[3]；在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞H2O2誘導(dǎo)損傷模型，來檢測IL-6、NF-ΚB-P65炎癥因子的表達(dá)[4]；以及在支氣管上皮細(xì)胞H2O2誘導(dǎo)損傷模型，檢測白細(xì)胞介素-8與谷胱甘肽的表達(dá)[5]。可見H2O2損傷細(xì)胞模型已成為研究心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎性機(jī)制及抗炎治療的常用模型。

偏頭痛是一種臨床常見的慢性神經(jīng)血管紊亂性疾病，其特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作并伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲的單側(cè)頭痛。盡管偏頭痛的病理生理機(jī)制尚未被完全闡明，目前認(rèn)為三叉神經(jīng)血管學(xué)說在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位，神經(jīng)源性炎癥是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。最新研究顯示，非甾體抗炎藥可有效治療偏頭痛及其發(fā)作過程中顱內(nèi)炎癥介質(zhì)水平的升高，并據(jù)此提出了新的假說，即偏頭痛是一種炎性疾病[7]。

鼻腦通鼻用噴霧劑是根據(jù)中醫(yī)“腦竅通于鼻”、“納鼻而通十二經(jīng)”理論研發(fā)，集川芎、冰片、大果木姜子等中藥辛溫活血、通竅止痛的組方，一部分中藥經(jīng)水提、濃縮、醇沉、回收乙醇得浸膏；一部分中藥經(jīng)醇提、水提和直接溶解，再經(jīng)β-環(huán)糊精包合、配液等現(xiàn)代工藝精制而成的鼻用噴霧劑。本藥采用液相、氣相色譜法對處方中川芎、冰片的質(zhì)量進(jìn)行測定，對川芎、大果木姜子等進(jìn)行薄層色譜鑒別，對每噴劑量、pH值、微生物限量等進(jìn)行了規(guī)定。經(jīng)動物藥效、毒理試驗研究和藥物穩(wěn)定性研究證明，本藥物具有速效止痛的藥效，無明顯毒副作用，且質(zhì)量穩(wěn)定可控，目前已獲得國家藥物臨床批件。本實驗在SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型上，檢測鼻腦通對血管肽內(nèi)皮素-1(ET-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和相關(guān)炎癥因子白介素-1α(IL-1α)、白介素-8(IL-8)以及致痛物質(zhì)P物質(zhì)(SP)、5-羥色胺(5-HT)、一氧化氮(NO)的影響，以探討鼻腦通治療偏頭痛的可能機(jī)制，為尋找預(yù)防和治療偏頭痛的有效藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

鼻腦通鼻用噴霧劑(中國藥材公司提供，規(guī)格：0.8 mg·mL-1，即1 mL溶液中含有0.8 mg生藥量)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞株(瑞典卡羅林斯卡研究所Bengt Winblad 教授和裴進(jìn)京博士贈送)。DMEM-F12(Gibco，Cat No:12400-024，Lot No:984278)。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：121017)。二甲基亞砜(DMSO)(Amresco，Lot No:12A0219。30%H2O2(北京化工廠，批號：20120331)。5-HT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130331，生產(chǎn)日期：20130331)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130318，有效日期：20130617)。SP試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130331)。ET-1試劑盒(南京建成生物工程所，批號：LOT#M20130402)。CGRP試劑盒(南京建成生物工程所，批號：LOT#M20130402)。IL-1α試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130330)。IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：LOT#M20130330)。

1.2 儀器與設(shè)備

IX71倒置顯微鏡(OLYMPOS)，CO2培養(yǎng)箱(SANYO)，全波長酶標(biāo)儀(Thermofisher Multiskan Spectrum)。BY-R320低溫高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限責(zé)任公司),HP8453紫外-可見分光光度計(美國惠普)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理

SH-SY5Y細(xì)胞于DMEM-F12培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素1×105U·L-1，在體積分?jǐn)?shù)為5% 、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液3次，傳代2次。

細(xì)胞以1×104·mL-1密度接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入150 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，吸棄原完全培養(yǎng)基后，空白組和損傷組分別加入70 μL無血清培養(yǎng)基，損傷加藥組分別加入終濃度為0.04，0.4，4 μg·mL-1的70 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基后，空白組加入70 μL無血清培養(yǎng)基，其余各組加入70 μL 1 000 μmol·L-1H2O2損傷18 h，吸取上清液。

按照試劑盒的說明進(jìn)行血管肽ET-1、CGRP和炎癥因子 IL-1α、IL-8以及致痛物質(zhì)SP、5-HT、NO各項指標(biāo)的測定。

2.2 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 鼻腦通對H2O2損傷誘導(dǎo)血管肽ET-1、CGRP升高的影響

與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液ET-1含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細(xì)胞上清液ET-1含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.001)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷后ET-1的含量，見圖1。與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液CGRP含量升高(P<0.05)，而鼻腦通給藥組細(xì)胞上清液CGRP含量與損傷組相比無明顯差別，見圖2。

3.2 鼻腦通對H2O2損傷誘導(dǎo)炎癥因子IL-8、IL-1α升高的影響

與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液IL-8含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細(xì)胞上清液IL-8含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.01)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷后IL-8的含量，見圖 3。同時檢測IL-1α的含量，與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液IL-1α有升高趨勢，但鼻腦通給藥組細(xì)胞上清液IL-1α含量與損傷組相比無明顯差異，見圖 4。

3.3 鼻腦通對H2O2損傷誘導(dǎo)致痛物質(zhì)SP、5-HT、NO升高的影響

與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液SP含量升高(P<0.01)。給藥組(中、高劑量)細(xì)胞上清液SP含量比損傷組降低(P<0.05，P<0.01)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷后SP的含量，見圖5。

與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液5-HT含量明顯升高(P<0.01)。給藥組(高劑量)細(xì)胞上清液5-HT含量比損傷組降低(P<0.05)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷后5-HT的含量，見圖6。

與對照組相比，損傷組細(xì)胞上清液NO含量升高(P<0.05)。給藥組(高劑量)細(xì)胞上清液NO含量比損傷組降低(P<0.05)，表明鼻腦通能降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷后NO的含量，見圖7。

注：與對照組比較，## P<0.01；與損傷組比較，* P<0.05，***P<0.001圖1 鼻腦通對細(xì)胞上清液ET-1含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.05圖2 鼻腦通對細(xì)胞上清液CGRP含量的影響

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 鼻腦通對細(xì)胞上清液IL-8含量的影響

圖4 鼻腦通對細(xì)胞上清液IL-1α含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖5 鼻腦通對損傷組細(xì)胞上清液SP含量的影響

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖6 鼻腦通對損傷組細(xì)胞上清液5-HT含量的影響

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05圖7 鼻腦通對損傷組細(xì)胞上清液NO含量的影響

4 討論

根據(jù)WHO全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查，2000年結(jié)果顯示，偏頭痛被列為世界第19種致殘原因，占全年殘疾的1.4%；2010年結(jié)果顯示，偏頭痛則上升為全球第7種致殘原因[8]。雖然偏頭痛病理生理學(xué)的確切機(jī)制仍不清楚，但近年對其病理機(jī)制的研究有了很大的進(jìn)展，認(rèn)為其涉及5-HT、CGRP、NO等多種因素[9]。偏頭痛的發(fā)作涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要活動，可能牽涉到離子通道和環(huán)境的變化，進(jìn)而導(dǎo)致皮層擴(kuò)布性抑制[10]，由于腦功能障礙而激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，進(jìn)一步激活三叉神經(jīng)血管反射，導(dǎo)致腦膜血管過度擴(kuò)張，血漿蛋白滲出，肥大細(xì)胞釋放組胺，血管周圍神經(jīng)釋放血管活性肽如CGRP、ET等引起神經(jīng)源性炎癥，釋放許多炎性細(xì)胞因子如白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-8、白介素-10和腫瘤壞死因子，以及血管致痛物質(zhì)SP、5-HT、His、NO等[11]。在體外實驗研究中，H2O2損傷細(xì)胞模型被廣泛用于炎癥機(jī)制以及藥物干預(yù)作用的研究。大量研究表明[12-13]，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性的損傷，激活炎性相關(guān)信號通路，通過促進(jìn)如NF-κB核因子的表達(dá)，進(jìn)一步增加細(xì)胞因子如IL-1、IL-6等的釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。據(jù)報道[14]，NF-κB/crel家族的某些轉(zhuǎn)錄因子可以直接被過氧化氫或電離輻射激活。陳花[15]在細(xì)胞過氧化氫模型上研究了辛伐他汀對炎癥因子血管黏附蛋白-1、核因子-κB表達(dá)的影響，證明辛伐他汀可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細(xì)胞核因子-κB的表達(dá)，具有抗炎抗氧化的作用；Schreck等[16]研究顯示，過氧化氫損傷Jurkat T細(xì)胞，可以激活NF-κB，從而介導(dǎo)炎癥因子的釋放。本文在過氧化氫損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型上檢測IL-1、IL-8、NO等多種炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的含量，表明鼻腦通噴霧劑可以抑制炎癥相關(guān)因子的釋放。

CGRP是三叉神經(jīng)疼痛信號的主要介質(zhì)[17]，在三叉神經(jīng)的衛(wèi)星細(xì)胞中檢測到功能性CGRP受體，具有一定的促炎效應(yīng)，能顯著增加IL-1β的作用，增加COX-2酶的表達(dá)和激活以及NO合酶和IL-1β的表達(dá)。CGRP在皮層的星型膠質(zhì)細(xì)胞中也能產(chǎn)生輕微的促炎效應(yīng)。偏頭痛發(fā)作時在血清、腦脊液和唾液中CGRP水平升高。在神經(jīng)源性炎癥中，硬腦膜上的受體促進(jìn)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，促進(jìn)血管擴(kuò)張和血管通透性的增加，CGRP介導(dǎo)長期持久的血管擴(kuò)張，增加腦血流量，這些效應(yīng)可以通過選擇性CGRP受體拮抗劑來阻斷。ET為強(qiáng)烈的腦動脈收縮劑，可能通過ETA和ETB受體介導(dǎo)神經(jīng)的輸入和輸出。正常生理狀態(tài)下，ET合成釋放很低，偏頭痛發(fā)作時ET釋放增加，引發(fā)皮層擴(kuò)布性抑制，ET通過血管平滑肌細(xì)胞膜上的受體與靶細(xì)胞膜結(jié)合，激活鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸肌醇系統(tǒng)和Ca2+通道，增高細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度而影響血管張力，觸發(fā)偏頭痛[18-19]。在我們前期研究中顯示[20]，鼻腦通能降低硝酸甘油所致偏頭痛動物血漿ET-1、CGRP含量，但對正常動物給予鼻腦通噴霧劑后，其對血漿炎癥相關(guān)介質(zhì)的釋放無影響。本實驗結(jié)果顯示，提前加入鼻腦通預(yù)孵育24 h后，能降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷組上清液ET-1含量，表明鼻腦通能抑制氧化損傷后神經(jīng)細(xì)胞血管活性肽的釋放。

偏頭痛可以刺激細(xì)胞因子的釋放，從而介導(dǎo)疼痛和免疫功能。研究表明細(xì)胞因子可能介導(dǎo)了偏頭痛疼痛產(chǎn)生的神經(jīng)血管炎癥[21]，腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6均可以導(dǎo)致超痛覺。偏頭痛發(fā)作時釋放的5-HT能夠引起毛細(xì)血管通透性增加，血漿成分滲出，導(dǎo)致頭顱血管舒縮改變、腦缺血及血管性炎癥，游離出疼痛介質(zhì)緩激肽、前列腺素等，從而增強(qiáng)痛覺。目前臨床應(yīng)用治療急性偏頭痛的有效藥物曲坦類就是5-HT1B/1D受體激動劑[6]。另外，P物質(zhì)和NO也可傳遞痛覺信息、產(chǎn)生疼痛，在偏頭痛的痛覺信息傳遞中起著重要的作用[22-23]?；贜O在偏頭痛中作用的研究，最近提出了“偏頭痛的NO假說”[9]：NO在偏頭痛中發(fā)揮著一個顯著的作用，不僅可以促進(jìn)偏頭痛的發(fā)作，而且涉及到發(fā)作的整個持續(xù)時間。它不僅參與痛覺的產(chǎn)生，而且與CGRP等重要分子之間存在一定關(guān)系。抑制NO產(chǎn)生或阻斷NO-cGMP途徑或者清除NO可能是治療偏頭痛新藥物的靶標(biāo)。目前n-NOS和i-NOS抑制劑已經(jīng)進(jìn)入早期的臨床開發(fā)，用L-NMMA抑制NOS可望有效治療急性偏頭痛的發(fā)作。本實驗結(jié)果顯示，H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞后，上清液內(nèi)的IL-8、SP、5-HT、NO含量均顯著增加，而給予鼻腦通提前孵育24 h可使上述幾種因子含量降低，表明鼻腦通能抑制神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷后炎癥因子以及致痛物質(zhì)的釋放。

隨著對偏頭痛神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的深入研究，CGRP受體拮抗劑、前列腺類受體拮抗劑、離子通道拮抗劑等肽類受體拮抗劑已成為治療偏頭痛藥物開發(fā)的新靶標(biāo)[24-25]。但偏頭痛患者對于此類藥物的依賴性逐漸凸顯，常導(dǎo)致藥物依賴性頭痛，加重原來的病情，使病情復(fù)雜化。而傳統(tǒng)中藥如天麻素、川芎嗪等都對偏頭痛有一定的治療作用，且中藥作用溫和，毒副作用小，將很好地改善上述藥物依賴現(xiàn)象。本實驗為鼻腦通治療偏頭痛的抗炎機(jī)制提供依據(jù)，也為中藥治療偏頭痛提供了現(xiàn)代藥理學(xué)研究基礎(chǔ)，為偏頭痛臨床治療提供更大選擇空間[26]。

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BinaotongInhibitsH2O2-inducedInjuryinSH-SY5YNeuroblastomaCells

HOUHongli1，SUNFangling1，XIANMinghui2，ZHAORunhuai3，XIAOSuping3，AIHouxi1，ZHANGLi1，WANGWen1*

(1.XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China;2.BeijingQiFuRuiCaoPharm-TechCo.，Ltd.，Beijing100094，China;3.ChinaNationalGroupCorp.ofTraditional&HerbalMedicine，Beijing100195，China)

Objective：To study the effects of binaotong on H2O2-induced oxidative injury in SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were pre-incubated with binaotong(0.04，0.4，4 μg·mL-1) for 24 h prior to exposure to H2O2(1 000 μmol·L-1) for 18 h.The content of vasoactive petide endothelin-1(ET-1)，calcitonin gene-related peptide(CGRP);inflammatory cytokines interleukin-1α(IL-1α)，interleukin-8(IL-8);pain producing substance substance P(SP)，5-hydroxy-tryptamine(5-HT)，nitric oxide(NO) were determined through supernatant.ResultsPretreatment the cells with binaotong(0.04，0.4，4 μg·mL-1)，supernatant of each injury group of vasoactive petide ET-1，CGRP were increased significantly compared with control group(P<0.01，P<0.05);supernatant of injury group of inflammatory cytokine IL-8 was increased significantly compared with control group(P<0.01);supernatant of each injury group of pain producing substance SP，5-HT，NO were increased compared with control group(P<0.01，P<0.01，P<0.05).However，supernatant vasoactive petide ET-1 level was decreased in the binaotong treated group with middle dose and high dose(P<0.05，P<0.001)，and supernatant inflammatory cytokine IL-8 level was also decreased(P<0.05，P<0.01);supernatant pain producing substance SP level was decreased in the binaotong treated group with middle dose and high dose(P<0.05，P<0.05)，supernatant pain producing substance 5-HT，NO level were decreased in the binaotong treated group of high dose(P<0.05，P<0.05).ConclusionDecreased supernatant vasoactive petide ET-1 level and inflammatory cytokine IL-8 level and pain producing substance SP，5-HT，NO levels after H2O2-induced injury in SH-SY5Y neuroblastoma cells were the possible mechanisms of binaotong in treating migraine.

Binaotong;SH-SY5Y neuroblastoma cells;ET-1;CGRP;IL-1α;IL-8;SP;5-HT;NO

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.007

2013-1

1-05)