土壤無(wú)機(jī)元素對(duì)當(dāng)歸品質(zhì)的影響△

王增繪，李文濤，黃林芳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

專 題

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274013)；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81130069)；人事部留學(xué)人員擇優(yōu)資助項(xiàng)目(2009-2011)；國(guó)家重大科技專項(xiàng)創(chuàng)制新藥(2011ZX09307-002-01)

*

黃林芳，副研究員，研究方向：中藥資源質(zhì)量與評(píng)價(jià)；Tel：(010)57833197，E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

土壤無(wú)機(jī)元素對(duì)當(dāng)歸品質(zhì)的影響△

王增繪，李文濤，黃林芳*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的探討當(dāng)歸品質(zhì)與土壤中無(wú)機(jī)元素的關(guān)系。方法UPLC-PDA法測(cè)定甘肅、云南、四川和湖北4個(gè)主產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞含量。ICP法測(cè)定土壤中和藥材中16種無(wú)機(jī)元素。采用相關(guān)分析、主成分分析(PCA)及單因素方差分析方法分析探究藥材道地性與土壤中及藥材中無(wú)機(jī)元素之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果土壤無(wú)機(jī)元素對(duì)當(dāng)歸品質(zhì)有一定影響；不同產(chǎn)區(qū)土壤無(wú)機(jī)元素含量有差異。甘肅產(chǎn)當(dāng)歸藥材中重金屬Cd與Pb含量顯著低于其他3個(gè)產(chǎn)地。As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影響藥材中5種主要成分含量相關(guān)的元素，Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。甘肅和云南產(chǎn)當(dāng)歸主要活性成分含量相近，且高于湖北和四川。湖北和四川產(chǎn)當(dāng)歸主要活性成分含量相似。結(jié)論甘肅與云南產(chǎn)當(dāng)歸品質(zhì)最優(yōu)、四川和湖北產(chǎn)當(dāng)歸質(zhì)量差于甘肅和云南產(chǎn)當(dāng)歸，體現(xiàn)了甘肅產(chǎn)當(dāng)歸藥材的道地性。

當(dāng)歸；土壤；無(wú)機(jī)元素；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；化學(xué)成分；品質(zhì)

當(dāng)歸藥材為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，是臨床上常用中藥。當(dāng)歸中主要化學(xué)成分有內(nèi)酯類、生物堿類、有機(jī)酸類、酚類以及揮發(fā)油類等[2-4]。2010年版《中國(guó)藥典》將阿魏酸和藁本內(nèi)酯作為當(dāng)歸質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。已有研究表明土壤中無(wú)機(jī)元素的含量影響當(dāng)歸藥材的道地性[5-6]。當(dāng)歸化學(xué)成分與當(dāng)歸無(wú)機(jī)元素相關(guān)性的研究較少。本文測(cè)定當(dāng)歸藥材中阿魏酸、藁本內(nèi)酸、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞5種主要的化學(xué)成分、藥材中無(wú)機(jī)元素以及相應(yīng)藥材生長(zhǎng)地土壤中化學(xué)元素的含量。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的相關(guān)分析、主成分分析的方法對(duì)三者之間的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)分析。探究了當(dāng)歸藥材、土壤中無(wú)機(jī)元素含量特征以及藥材和土壤中無(wú)機(jī)元素與5種主要化學(xué)成分之間的關(guān)系，為無(wú)機(jī)元素對(duì)當(dāng)歸藥材品質(zhì)的影響以及當(dāng)歸藥材道地性的評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

當(dāng)歸樣品材料，見(jiàn)表1。土壤材料在當(dāng)歸藥材采集的同時(shí)，刮取對(duì)應(yīng)根上的土壤封裝于自封袋中。所采集的藥材樣品由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館林余霖研究員，鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica.sinensis(Oliv.)Diels。

表1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品

1.2 材料處理

新鮮的當(dāng)歸藥材根，用自來(lái)水清洗至表面無(wú)土，蒸餾水沖洗3遍后，再用去離子水沖洗3遍。沖洗好的樣品放置在托盤中，室溫自然晾干。藥材粉碎，過(guò)60目篩，粉末放置于錐形瓶中備用。取部分粉末于研缽中，繼續(xù)研磨，過(guò)80目篩放置自封袋中封存，供藥材中無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定。土壤樣品放置在干凈的玻璃培養(yǎng)皿中，室內(nèi)自然晾干后，置研缽中研碎，過(guò)100目篩，置自封袋中封存，供無(wú)機(jī)元素測(cè)定使用。

1.3 分析方法

1.3.1 當(dāng)歸中5種主要化學(xué)成分提取和UPLC-PDA分析

取藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得。進(jìn)液相前用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液備用。分別精密稱取阿魏酸(ferulic acid，1)，洋川芎內(nèi)酯A(senkyunolide A，2)，正丁基苯酞(n-butylphthalide，3)，藁本內(nèi)酯(ligustilide，4)，丁烯基苯酞(butylidenephthalide，5)各1.00 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，振搖使混合均勻，配制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀-(PDA)二極管陣列檢測(cè)器。色譜柱：BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 um)；柱溫：35 ℃，樣品室溫度4 ℃，流速：0.3 mL·min-1，提取檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脫，0～4 min：5% B；4～7 min：5%-24% B；7～8 min：24%-28% B；8～10 min：28%-50% B；10～12 min：50%～70% B；12～14 min：70～100% B。

1.3.1.1 方法學(xué)考察

1.3.1.1.1 線性關(guān)系 分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000 μL至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進(jìn)樣量2 μL，按上述色譜條件進(jìn)行UPLC-PDA分析測(cè)定。以各標(biāo)品濃度數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到各線性回歸方程。最小檢測(cè)限(LOD)和最小定量限(LOQ)定義為信噪比分別等于3(S/N=3)和10(S/N=10)時(shí)樣品濃度(見(jiàn)表2)。

1.3.1.1.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的甘肅岷縣當(dāng)歸樣品DG1，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定，各對(duì)照品色譜峰的峰面積在0.61～2.89%范圍內(nèi)，表明此方法的重現(xiàn)性良好。

1.3.1.1.3 精密度 取DG1樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，測(cè)得各峰保留時(shí)間(RT)和峰積分面積(PA)。并計(jì)算RSD值，5個(gè)主要成分保留時(shí)間和峰面積RSD分別在0.24%～0.72%和1.07%～3.43%范圍內(nèi)。

表2 阿魏酸及苯酞類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及最低檢測(cè)限、定量限

1.3.1.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取上述供試品溶液，放置0、2、4、8、12、24、36 h后分別測(cè)定和記錄峰積分面積，樣品濃度的RSD值在0.76%～2.25%范圍內(nèi)，表明樣品在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.1.1.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)知含量的同一批次(甘肅岷縣-DG1)樣品6 份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入一定量(相當(dāng)于樣品中的量)5種對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件測(cè)定。5種成分的回收率在98.33%～102.22%，RSD值在1.16%～4.72%之間。

1.3.1.2 樣品測(cè)定

提取處理好的供試品樣品溶液，直接進(jìn)UPLC-PDA分析，單個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)3次，得到數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.2 當(dāng)歸藥材和土壤中無(wú)機(jī)元素的測(cè)定

參考JY/T 015-1996感偶合等離子體發(fā)射光譜方法通則標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)藥材中和土壤中無(wú)機(jī)元素測(cè)定。精密稱量樣品1 g至石英消解管中，加入硝酸與鹽酸的混酸約4 mL，置于石墨加熱爐上，60 ℃消解12 h，然后提高到120 ℃趕酸2 h，定容到25 mL，取約20 mL溶液0.22 μm濾膜，進(jìn)ICP(電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀)分析。單個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、簡(jiǎn)單相關(guān)分析；應(yīng)用The Unscrambler 9.0軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果

2.1 差異比較

2.1.1四地當(dāng)歸主要化學(xué)成分差異 甘肅岷縣和云南鶴慶縣產(chǎn)當(dāng)歸在5種主成分含量累積總量上明顯高于湖北房縣和四川中江縣，其中正丁基苯酞的含量在四地產(chǎn)當(dāng)歸中含量差異相對(duì)其余4種成分差異較小(P=0.036，其余4種成分P<0.001為極顯著差異)較小，其余4種成分中甘肅岷縣和云南鶴慶縣的都明顯高于四川中江縣和湖北房縣(見(jiàn)圖1)。甘肅岷縣、云南鶴慶縣、四川中江縣和湖北房縣產(chǎn)當(dāng)歸中阿魏酸含量的算術(shù)平均值為0.096%、0.141%、0.015%、0.005%；四地產(chǎn)當(dāng)歸阿魏酸最大值分別為0.119%、0.150%、0.019%、0.060%，最小值為0.062%、0.136%、0.013%、0.005%。標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.249、0.070、0.036、0.005；單因素方差分析表明，云南鶴慶縣當(dāng)歸和甘肅岷縣當(dāng)歸的阿魏酸含量高于湖北房縣和四川中江縣產(chǎn)當(dāng)歸。阿魏酸作為當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)之一，2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定HPLC測(cè)定法其含量不少于0.05%。從四地當(dāng)歸中阿魏酸的含量分析，可以看出甘肅岷縣和云南鶴慶縣當(dāng)歸中阿魏酸含量都高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，而湖北房縣和四川中江縣產(chǎn)當(dāng)歸中阿魏酸含量則遠(yuǎn)低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明甘肅岷縣和云南鶴慶縣的當(dāng)歸藥材合格。

四地產(chǎn)當(dāng)歸5種成分PCA分析結(jié)果表明甘肅岷縣和云南鶴縣當(dāng)歸差異較小，score plot結(jié)果顯示甘肅岷縣和云南鶴慶縣相距較近、湖北房縣和四川中江縣相距較近。Loading plot結(jié)果初步表明引起甘肅岷縣當(dāng)歸、云南鶴慶縣當(dāng)歸與湖北房縣和四川中江縣當(dāng)歸差異的因子為阿魏酸、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞(見(jiàn)圖2)，與上述單因素方差分析結(jié)果顯示一致。

2.1.2 四地當(dāng)歸藥材中無(wú)機(jī)元素差異 單因素方差分析結(jié)果顯示，Cd(P<0.001)、Ca與Ba元素在四地有顯著的差異P<0.01，Al與Pb元素在四地有顯著性差異P<0.05。其中當(dāng)歸中Cd含量：湖北房縣>云南鶴慶縣>四川中江縣>甘肅岷縣，Pb含量：湖北房縣>四川中江縣>云南鶴慶縣>甘肅岷縣，Ca含量：甘肅岷縣>云南鶴慶縣>湖北房縣>四川中江縣，Ba含量:湖北房縣>四川中江縣>甘肅岷縣>云南鶴慶縣，Al含量：云南鶴慶縣>四川中江縣>湖北房縣>甘肅岷縣。

通過(guò)對(duì)四地產(chǎn)當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素進(jìn)行PCA分析，score plot結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)產(chǎn)地表現(xiàn)出一定差異，但是湖北房縣、四川中江縣和云南鶴慶縣3個(gè)產(chǎn)地有交叉，不能通過(guò)無(wú)機(jī)元素分析很好的將4個(gè)產(chǎn)地區(qū)分開(見(jiàn)圖3)。

圖1 四個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中5種化學(xué)成分含量

圖2 當(dāng)歸藥材不同產(chǎn)地化學(xué)成分PCA分析

圖3 四個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中無(wú)機(jī)元素PCA分析

2.1.3 四地土壤中無(wú)機(jī)元素含量差異

單因素方差結(jié)果分析顯示，四地當(dāng)歸生長(zhǎng)的土壤中大多數(shù)的無(wú)機(jī)元素為顯著差異和極顯著差異。Na和Ba元素在四地當(dāng)歸中無(wú)顯著差異P>0.05，Cd和Pb元素表現(xiàn)顯著差異，其余的元素表現(xiàn)極顯著差異P<0.001。

通過(guò)對(duì)四地當(dāng)歸生長(zhǎng)地土壤無(wú)機(jī)元素PCA分析，score plot 結(jié)果表明4個(gè)產(chǎn)地表現(xiàn)出較明顯的差異(見(jiàn)圖4)。loading plot圖表明引起差異的因素，根據(jù)單因素分析結(jié)果大多數(shù)的元素含量有顯著或極顯著的差異，因而大多數(shù)的元素都是導(dǎo)致四地土壤性質(zhì)明顯差異的因素。

圖4 當(dāng)歸四個(gè)不同產(chǎn)地土壤中有機(jī)元素PCA分析

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 當(dāng)歸主要化學(xué)成分與無(wú)機(jī)元素相關(guān)分析 當(dāng)歸中阿魏酸與As、Mn元素呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；Ba元素與阿魏酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；洋川芎內(nèi)酯A與Mn元素呈顯著性正相關(guān)(P<0.01)，As、Ni元素與洋川芎內(nèi)酯A呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)；正丁基苯酞與Ca元素呈顯著性正相關(guān)(P<0.01)；藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞與As和Mn元素呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，Pb元素與藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Ba元素與藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

2.2.2 當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素之間的相關(guān)性 Fe元素與Pb、Mn、Ni(P<0.05)和As、Al元素(P<0.01)呈顯著性正相關(guān)；Al元素與As、Cd、Ni、Ba(P<0.05)Pb以及Fe元素(P<0.01)呈顯著性正相關(guān)；Cd元素與Ca元素(P<0.05)呈顯著性負(fù)相關(guān)，與Pb、Al、Na(P<0.05)和Ni元素(P<0.01)呈顯著性正相關(guān)。As元素與Mn、Fe(P<0.01)和Al元素(P<0.05)呈顯著性正相關(guān)，B元素與Na(P<0.01)和Ba元素(P<0.05)呈顯著性正相關(guān)(見(jiàn)表3)。

表3 當(dāng)歸藥材無(wú)機(jī)元素與化學(xué)成分之間相關(guān)性分析

注：*P0.05水平**P0.01水平,下同

2.2.3 土壤中無(wú)機(jī)元素與當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素之間的相關(guān)性 藥材中Mn、Mg(P<0.01)、 Ca(P<0.05)3種元素的含量與土壤中該3種元素的含量呈顯著正相關(guān)。其中Mn元素與Cu、Fe、Ba、Al和Ni元素(P<0.05)元素呈顯著正相關(guān)；Ca元素與Cd、Cu、Zn、Mn元素(P<0.05)、Sn、Al元素和Cr元素(P<0.01)呈顯著性正相關(guān)；As元素與Cu、Zn、Fe、B、Ni元素(P<0.01)、Cr、Al元素和Mn(P<0.05)元素呈顯著性正相關(guān)；Pb元素與As、Ca(P<0.05)元素呈顯著性負(fù)相關(guān)；Cd元素與Ca、Mg元素(P<0.01)呈顯著性負(fù)相關(guān)(見(jiàn)表4)。

2.3 富集系數(shù)

藥材中元素含量總和與該元素在土壤中含量總和之比為富集系數(shù)。由當(dāng)歸藥材富集系數(shù)可以看出，當(dāng)歸只對(duì)Na元素表現(xiàn)出富集作用(見(jiàn)表5)。

表4 當(dāng)歸藥材中無(wú)機(jī)元素與土壤中無(wú)機(jī)元素相關(guān)性分析

表5 當(dāng)歸對(duì)無(wú)機(jī)元素的富集系數(shù)

3 討論

3.1 當(dāng)歸藥材中5種化學(xué)成分含量評(píng)價(jià)

傳統(tǒng)研究觀點(diǎn)認(rèn)為甘肅岷縣為當(dāng)歸藥材的道地產(chǎn)區(qū)[7-9]。結(jié)合5種化合物含量分析和PCA分析，四地當(dāng)歸5種主成分含量的差異分析結(jié)果支持了甘肅岷縣為當(dāng)歸藥材道地產(chǎn)區(qū)的觀點(diǎn)。

3.2 當(dāng)歸藥材中無(wú)機(jī)元素特征

《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(WMPT2-2004)中的藥材重金屬限量指標(biāo)。As、Pb和Cd元素為有害人體健康金屬元素，本次所有當(dāng)歸樣品中含量都低于該標(biāo)準(zhǔn)，從以上分析結(jié)果顯示甘肅岷縣產(chǎn)當(dāng)歸藥材中這兩種金屬元素含量都是最低，符合綠色食品的理念和道地藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，支持甘肅岷縣產(chǎn)當(dāng)歸是道地藥材的觀點(diǎn)。

3.3土壤中無(wú)機(jī)元素評(píng)價(jià)

依據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618-1995)，四地地土壤中Cd、Pb、Cr、Ni、Cu、Zn元素含量達(dá)到一級(jí)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值，因此4個(gè)產(chǎn)地的土壤都達(dá)到了國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。《國(guó)家中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GAP)中規(guī)定中藥材產(chǎn)地的土壤應(yīng)符合土壤質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，故四地土壤均合格。

3.4 土壤中無(wú)機(jī)元素對(duì)藥材中無(wú)機(jī)元素和藥材中化學(xué)成分的影響

相關(guān)性分析結(jié)果表明，不同當(dāng)歸樣品中的多數(shù)有相關(guān)的元素之間都呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，大多數(shù)有正相關(guān)關(guān)系的元素在植物吸收的過(guò)程中可能具有協(xié)同的作用，Cd和Ca元素呈顯著性負(fù)相關(guān)，推測(cè)Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。Mn、Ca和As 3種元素在藥材中的含量與在土壤中含量呈正相關(guān)，并且這3種元素與5種主要的成分間呈顯著性正相關(guān)；同時(shí)Ni元素在藥材中與Mn、As元素呈顯著正相關(guān)，因此我們認(rèn)為Mn、Ca、As和Ni 4種元素對(duì)當(dāng)歸藥材質(zhì)量影響比較大。因此As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影響藥材中5種主要成分含量相關(guān)的元素。

本研究從有害金屬元素在土壤和藥材中含量差異、主成分含量差異以及土壤中無(wú)機(jī)元素與藥材中無(wú)機(jī)元素的差異和相關(guān)性等方面進(jìn)行研究，得出的結(jié)果支撐了甘肅岷縣產(chǎn)當(dāng)歸為道地產(chǎn)區(qū)藥材的論點(diǎn)。土壤系統(tǒng)為一個(gè)極為復(fù)雜的系統(tǒng)，藥材根際土壤中元素對(duì)藥材中成分的含量影響還需要更直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究為進(jìn)一步深入研究提供了一定的參考。

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EffectsofInorganicElementsinSoilonAngelicasinensisQuality

WANGZenghui,LIWentao，HUANGLinfang*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100093,China)

Objective：To investgate relationshi Pbetween the content of inorganic elements in soil and the quality ofAngelicasinensis.MethodsA total of 15 samples were analyzed.UPLC-PDA was used to determine the content of ferulic acid，senkyunolide A，n-Butylphthalide，ligustilide，butylidenephthalide inA.sinensis.The inorganic elements were determined by IC Pmethod.PCA method was used to discriminate different Angelica samples.One-way ANOVA and correlation analysis was used to find the relationshi Pamong the samples.ResultsThe differences of inorganic elements content inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan are greater than that from Hubei and Sihcuan.The total content of five chemical components inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were higher than that from Hubei and Sichuan.The contents of Cd and Pb in Gansu were lower than that in the other three places.ConclusionThe quality ofA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were much better than that from Hubei and Sichuan which support that，A.sinensisin Gansu is the genuine medicinal materials.

Angelicasinensis；Soil；Inorganic elements；Chemometrics；Chemical components； Quanlity

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.001

2013-10-23)