顯微組織化學(xué)定位在中藥研究中的應(yīng)用

林麗，施曉龍，高素芳，陳紅剛

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

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林麗，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中藥鑒定及中藥資源可持續(xù)利用；Tel：(0931)8765304，E-mail：xrhlin@sina.com

顯微組織化學(xué)定位在中藥研究中的應(yīng)用

林麗1，2*，施曉龍1，高素芳1，陳紅剛1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

以中藥顯微鑒定和組織化學(xué)動(dòng)態(tài)定位的相關(guān)研究為基礎(chǔ)，從顯微組織化學(xué)前沿研究、顯微組織化學(xué)特征性反應(yīng)、顯微組織化學(xué)定位等方面進(jìn)行詳細(xì)綜合論述，指出顯微化學(xué)定位在組織結(jié)構(gòu)研究中的優(yōu)勢(shì)，為中藥資源的開發(fā)利用提供方法學(xué)技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)也為中藥品質(zhì)鑒定提供新的研究思路和方法。

顯微化學(xué)；組織定位；中藥材

顯微組織定位是在中藥有效成分鑒定明確的條件下，有針對(duì)性地選擇能與有效成分產(chǎn)生沉淀、結(jié)晶或特殊顏色的化學(xué)試劑進(jìn)行染色反應(yīng)，運(yùn)用顯微鏡觀察來確定這些物質(zhì)存在部位和分布情況。中藥有效成分是植物組織細(xì)胞自身代謝的產(chǎn)物，其中包括分泌細(xì)胞對(duì)一些物質(zhì)的分泌和具有特殊功能細(xì)胞對(duì)一些物質(zhì)的合成，使得顯微組織化學(xué)在植物組織中有效成分的定位研究發(fā)揮出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前顯微組織化學(xué)定位主要應(yīng)用于臨床方面，它對(duì)精細(xì)病變組織切片進(jìn)行定位觀察，以此來輔助診斷腫瘤細(xì)胞是否擴(kuò)散，確定治療效果。顯微組織化學(xué)定位也可以用于藥用植物有效成分組織中的定位研究，確定其具體存在部位和動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)移途徑，對(duì)中藥材品種的選育、栽培及其品質(zhì)的鑒定提供科學(xué)指導(dǎo)。

科研人員嘗試借助先進(jìn)的儀器設(shè)備，運(yùn)用植物組織切片技術(shù)，在藥用植物組織定位取得相應(yīng)的研究成就，從而促使該方法在分子研究領(lǐng)域的先進(jìn)性不斷凸顯，可以預(yù)測(cè)其具有廣闊的發(fā)展前景。筆者通過檢索近期國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)，綜合分析顯微化學(xué)定位在中藥研究中的應(yīng)用，探索植物有效成分的合成途徑、代謝規(guī)律，為今后中藥品質(zhì)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 顯微組織化學(xué)的發(fā)展歷程

顯微組織化學(xué)方法最早出現(xiàn)在化學(xué)研究領(lǐng)域的一些化學(xué)反應(yīng)中，通過對(duì)化學(xué)反應(yīng)的生成物進(jìn)行染色處理制成裝片后借助顯微鏡觀察精細(xì)組織結(jié)構(gòu)，特別在有機(jī)化學(xué)研究領(lǐng)域?qū)τ袡C(jī)物的研究做出巨大貢獻(xiàn)，從而推動(dòng)了化學(xué)研究的發(fā)展。同時(shí)我們還通過資料可以找到顯微化學(xué)方法的顯微化學(xué)定位能夠?qū)χ兴幹械囊恍┨卣餍晕镔|(zhì)進(jìn)行定位確定，探索植物有效成分的合成途徑、代謝規(guī)律，具有很大的發(fā)展?jié)撃?，為今后中藥品質(zhì)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。因?yàn)槠浞稚⒘鑱y并沒有形成一定的研究體系，因而也沒有引起其他學(xué)科科研人員的足夠重視。直到蘇聯(lián)科學(xué)家德日阿帕利捷的《顯微化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)》出版[1]，使顯微化學(xué)研究有了明確的研究方向。隨著顯微組織化學(xué)方法的逐漸成熟，也逐步應(yīng)用在組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的研究上，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、快捷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高等優(yōu)勢(shì)，更好地完善了組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究體系，形成組織化學(xué)研究方法。但是對(duì)一些生理、生命現(xiàn)象，組織化學(xué)不能更好地進(jìn)行合理解釋。研究人員開始嘗試顯微化學(xué)從組織化學(xué)的學(xué)科主體進(jìn)行分離，經(jīng)過不斷發(fā)展完善，顯微組織化學(xué)在某些方面可以代替組織化學(xué)來研究組織或細(xì)胞中的化學(xué)組成、定位與定量以及代謝狀態(tài)，能夠更好地聯(lián)系細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、功能，來了解組織或細(xì)胞的代謝變化[2]，而且在一些新技術(shù)、新儀器的相繼出現(xiàn)后廣泛用于這一科研領(lǐng)域。藥用植物顯微組織定位在藥物鑒別研究方面取得相應(yīng)成就，其應(yīng)用最廣泛的是在組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上對(duì)中藥材進(jìn)行鑒定來辨別真?zhèn)?，而隨著各項(xiàng)技術(shù)的不斷成熟和對(duì)藥用資源優(yōu)化應(yīng)用的要求，人們逐漸尋找有效成分積累部位和最大積累量之間的相關(guān)性規(guī)律，為藥材的采收、加工、種屬鑒定及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

2 顯微組織化學(xué)在藥用植物研究中的技術(shù)方法及應(yīng)用

2.1 顯微組織化學(xué)在中藥不同組織及成分鑒別中常用的檢測(cè)方法

顯微組織化學(xué)方法是目前藥用植物研究中最常用的方法之一，常用間苯三酚-鹽酸(或硫酸)反應(yīng)、苯胺反應(yīng)、氯化鋅反應(yīng)、氯化鋅碘反應(yīng)、氫碘酸反應(yīng)與碘液硫酸反應(yīng)來鑒定木化、木栓化、角質(zhì)化、纖維素化或半纖維素化的細(xì)胞壁；對(duì)樹脂和揮發(fā)油類可選擇醋酸銅反應(yīng)、察列夫斯基反應(yīng)以及染色法、鹽酸升華法和蒸發(fā)法等進(jìn)行鑒定；對(duì)淀粉粒、不同的黏液質(zhì)、糊粉粒、菊糖、鞣質(zhì)、草酸鈣與碳酸鈣結(jié)晶等采用碘反應(yīng)、蘇丹紅與紫草反應(yīng)、釕紅反應(yīng)、亞甲蘭反應(yīng)、剛果紅反應(yīng)、高鐵酸反應(yīng)、鎢酸鈉反應(yīng)、A-萘酚反應(yīng)、麝香草酚反應(yīng)、稀醋酸或稀鹽酸等反應(yīng)進(jìn)行鑒別；對(duì)蛋白質(zhì)用碘反應(yīng)、三硝基酚反應(yīng)、硝酸汞反應(yīng)、硝酸脫黃反應(yīng)、氯化汞溴酚藍(lán)反應(yīng)、硫酸銅反應(yīng)進(jìn)行鑒別[1，3-4]。

2.2 顯微組織化學(xué)定位在藥用植物研究的應(yīng)用

有效藥用成分的顯微組織化學(xué)定位的研究，是研究次生代謝產(chǎn)物在植物組織器官分布規(guī)律和動(dòng)態(tài)積累過程的重要方法。顯微組織化學(xué)已在糖類、蛋白質(zhì)、脂類、樹脂和揮發(fā)油、分泌物、色素、細(xì)胞壁、苷類、鞣質(zhì)、無機(jī)鹽等物質(zhì)的鑒定上日趨完善，并在藥用植物的研究中得到成功運(yùn)用，其中在對(duì)植物的次生代謝物進(jìn)行組織化學(xué)定位研究過程中還發(fā)現(xiàn)不同植物器官中存在的類型及分布模式具有多樣性。

2.2.1 黃酮類化合物研究 葛楚源等[5]研究了黃酮組織化學(xué)定位，結(jié)果表明黃酮存在于表皮、厚角組織的分泌細(xì)胞中，葉中黃酮含量高于莖部。陳婧[6]在蕤核的形態(tài)解剖學(xué)及組織化學(xué)定位研究中發(fā)現(xiàn)黃酮多分布于葉片的柵欄組織和厚角組織?？到芊嫉萚7]通過組織化學(xué)定位實(shí)驗(yàn)觀察，指出萜類和黃酮類化合物主要分布在根的皮層、莖的皮層和韌皮部細(xì)胞中。廖云海等[8]應(yīng)用植物解剖學(xué)、組織化學(xué)和植物化學(xué)方法，對(duì)光果甘草各營(yíng)養(yǎng)器官的結(jié)構(gòu)、總黃酮的組織化學(xué)定位和含量差異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)每年可在果熟期和枯萎期之間采挖藥材，有效成分含量最高。李娜等[9]應(yīng)用顯微組織化學(xué)定位出萜類和黃酮類化合物主要分布在金粟蘭根的皮層、莖的皮層及韌皮部細(xì)胞中。

2.2.2 皂苷類化合物研究 葉祖云等[10]在太子參微塊根發(fā)育的解剖學(xué)與組織化學(xué)定位研究中發(fā)現(xiàn)，在成熟的微塊根中太子參皂苷主要分布在次生木質(zhì)部和韌皮部維管薄壁細(xì)胞中。林如等[11]通過組織結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)莖葉內(nèi)人參皂苷含量較根和根莖高。王桂芹等[12]對(duì)白頭翁藥用部位解剖結(jié)構(gòu)和皂苷組織化學(xué)定位進(jìn)行研究，指出皂苷類物質(zhì)的形成和貯藏主要與次生韌皮部、分泌腔和分泌道有關(guān)。劉世彪等[13]應(yīng)用組織化學(xué)定位技術(shù)及植物化學(xué)等方法對(duì)絞股藍(lán)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了不同發(fā)育階段莖葉的結(jié)構(gòu)與其中人參皂苷分布積累和總皂苷含量具有相關(guān)性。譚玲玲等[14]對(duì)北柴胡的組織化學(xué)定位及其含量比較研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂普和黃酮類化合物在根、莖、葉中分布，且發(fā)現(xiàn)總黃酮在根、莖、葉中的含量變化規(guī)律為葉>莖>根。

2.2.3 生物堿研究 閆晉晉等[20]應(yīng)用顯微組織化學(xué)定位觀察發(fā)現(xiàn)，生物堿主要分布在主根(川烏)次生韌皮部薄壁組織細(xì)胞與束間形成層的外側(cè)細(xì)胞、不定根(附子)和莖基部的內(nèi)皮層、韌皮部外側(cè)薄壁細(xì)胞中。李玉萍等[21]對(duì)蛇根木根部生物堿積累的組織化學(xué)定位研究指出，蛇根木種植形成層當(dāng)年根部就可以產(chǎn)生和積累生物堿。呂洪飛等[22]對(duì)不同年齡的石斛及其偽品(小葉石仙桃)的不同器官進(jìn)行生物堿組織化學(xué)定位研究，明確有效部位和最佳采收期。史文靜等[23]采用石蠟切片和組織化學(xué)的方法對(duì)苦豆子營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行研究，指出所測(cè)部位均含有生物總堿。

閆晉晉[24]對(duì)烏頭所形成的附子的形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程、藥用成分生物堿分布研究發(fā)現(xiàn)，生物堿的分布存在動(dòng)態(tài)積累過程。彭斯文等[25]采用植物組織化學(xué)定位的方法大致測(cè)定杜鵑蘭營(yíng)養(yǎng)器官中生物堿含量為假鱗莖>葉柄>葉片。劉文哲等[26]在喜樹幼枝的喜樹堿積累及其組織內(nèi)定位研究中發(fā)現(xiàn)，喜樹堿的主要積累部位是幼莖和幼葉內(nèi)部由1～2層細(xì)胞包圍而成的分泌道。杜亞填等[27]從紅豆杉藥用部位的結(jié)構(gòu)及其與多酚類化合物積累研究中發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉紫杉醇存在于幼莖皮和莖形成層愈傷組織中，曼地亞紅豆杉紫杉醇則存在于莖形成層和頂端分生組織的愈傷組織中，且各自含量差別較大。

2.2.4 蒽醌類化合物研究 劉文哲等[28]對(duì)大黃蒽醌類化合物組織化學(xué)定位研究發(fā)現(xiàn)大黃根莖內(nèi)蒽醌類化合物主要積累在次生木質(zhì)部的木射線和次生韌皮部的韌皮射線細(xì)胞中。王貴智等[29]在唐古特大黃莖蒽醌類化合物組織化學(xué)定位研究中發(fā)現(xiàn)蒽醌類化合物在唐古特大黃莖中的分布是多位點(diǎn)的，主要分布在表皮、近表皮的皮層細(xì)胞、維管束中木質(zhì)部和韌皮部的薄壁細(xì)胞及髓射線細(xì)胞中。譚凱麗等[30]應(yīng)用顯微組織化學(xué)定位方法發(fā)現(xiàn)何首烏中的蒽醌類物質(zhì)主要存在于塊根內(nèi)。沈宗根等[31]對(duì)蒽醌類物質(zhì)定位研究指出蒽醌類物質(zhì)在蘆薈葉內(nèi)的貯藏方式是呈多位點(diǎn)的，且貯水組織細(xì)胞中不貯存蒽醌類物質(zhì)。

2.2.5 揮發(fā)油研究 穆靖[32]利用石蠟切片技術(shù)和蘇丹Ⅲ溶液對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行組織化學(xué)定位，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油主要分布在根莖的皮層、髓及根的皮層中。

2.2.6 其他有效成分研究 殷奎德等[33]在擬南芥葉片超氧自由基的組織化學(xué)定位研究中指出，在逆境條件下超氧自由基可能會(huì)發(fā)生變化。呂洪飛等[34]對(duì)元寶草葉的分泌結(jié)構(gòu)與其次生產(chǎn)物研究指出，分泌細(xì)胞團(tuán)分泌的金絲桃素主要分布于海綿組織中，其中分泌小管道分泌的揮發(fā)油分布于各器官的韌皮部中，分泌囊分泌的揮發(fā)油分布于上下表皮之間或海綿組織和柵欄組織中。包英華等[36]通過實(shí)驗(yàn)研究?jī)?yōu)化了金釵石斛多糖組織化學(xué)定位方法，明確金釵石斛多糖主要分布在根的皮層薄壁細(xì)胞、莖的維管束周圍薄壁細(xì)胞內(nèi)。張瑩等[36]指出分泌道是明黨參中香豆素積累的主要場(chǎng)所。李鵬等[37]利用石蠟切片法研究紫錐菊藥用部位的結(jié)構(gòu)，利用組織化學(xué)的方法研究了多酚類化合物的分布。

3 討論

中藥材包含植物、動(dòng)物、礦物、其他等類型，其中植物藥應(yīng)用廣泛，約占中藥資源總量的80%。中藥的有效成分是藥物預(yù)防和治愈疾病的基礎(chǔ)，而這些有效成分存在中藥的組織細(xì)胞中，且大多是組織細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物包含黃酮類化合物、生物堿類化合物、多糖類化合物及油脂類化合物等，藥用植物的生理活性水平高低直接關(guān)系到中藥的品質(zhì)優(yōu)劣。因此，應(yīng)用顯微組織化學(xué)方法對(duì)植物內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)觀察，進(jìn)而對(duì)藥用部位有效成分進(jìn)行定位研究，尋找生長(zhǎng)環(huán)境迫使有效成分動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，在中藥材栽培過程中使有效成分在有效部位大量積累，從而提升中藥材的品質(zhì)，為中藥材的開發(fā)利用創(chuàng)造有利條件。

隨著顯微技術(shù)發(fā)展的逐步成熟，不僅可以用于對(duì)固定的死細(xì)胞與組織切片顯色的靜態(tài)觀察，還能對(duì)活的細(xì)胞組織中特征性物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察?？梢园研迈r藥用植物有效部位切片假想成一個(gè)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的“容器”，通過超微管道滴加試劑進(jìn)行組織間的化學(xué)反應(yīng)，可在細(xì)胞組織中直接觀察物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的全過程，顯微組織化學(xué)研究由單純的形態(tài)定位轉(zhuǎn)為結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)合研究，大大擴(kuò)充了研究范圍，也是顯微組織化學(xué)定位今后發(fā)展的一個(gè)新方向。

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TheApplicationofMicroscopicHistochemicalLocalizationinTraditionalChineseMedicineStudy

LINLi1，2*，SHIXiaolong1，GAOSufang1，CHENHonggang1

(1.DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTraditionalChineseMedicne，Lanzhou730000China；2.KeylaboratoryofChemistryandQualityforTraditionalChineseMedicineandTibetMedicineCollegesinGansuProvince，Lanzhou730000，China)

Based on studies of microstructure identification and dynamic histochemical location of Traditional Chinese Medicine，Summarized the frontier of microscopic histochemical，characteristic reaction and microscopic histochemical localization，using of key techniques and high-end instruments，in order to offer methodology and technical guidance for development and utilization of Chinese Medicine Resources，meanwhile，provide new research ideas and methods .Through the collected，analyzed，induced and summed up the relative literatures both at domestic and abroad from Chinese HowNet，Wanfang database and Springer Link electronic journal database.The comprehensive analysis microscopic histochemical localization technology could locate characterized material in Traditional Chinese Medicine，explore the synthesis pathway and metabolic law.The technology had great development potential and provided new scientific basis for quality identification of Traditional Chinese Medicine.

Microscopic，Histochemical localization，Traditional Chinese Medicine

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.06.019

2013-07-29)