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    艾塞那肽緩釋微球的制備工藝及其體外釋放特性的研究

    2014-11-02 10:26:38陳莉娜趙興華廖怡然康小寧西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院西安710061陜西省新型治療性疫苗工程中心西安710061陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)二部西安710613
    西北藥學(xué)雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:油相水相藥量

    陳莉娜 ,趙興華 ,張 卉,廖怡然,荊 晶,康小寧,3,王 冰* (1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西安710061;.陜西省新型治療性疫苗工程中心,西安 710061;3.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)二部,西安 710613)

    艾塞那肽(exendin-4)是從毒蜥蜴分泌的唾液中分離出的含有39個氨基酸的多肽,是一種胰高血糖素-1(GLP-1)類似物,是 GLP-1受體激動藥,可促進(jìn)胰腺β細(xì)胞增殖,改善其功能,具有促進(jìn)胰島素分泌、增加機(jī)體對胰島素的敏感性和延緩胃排空等作用。exendin-4注射劑于2005年在美國上市,用于2型糖尿病的治療,臨床效果明顯,不良反應(yīng)小,有很好的治療糖尿病的臨床應(yīng)用前景[1]。然而exendin-4半衰期僅有60~90min,每天需注射2次,使用不便,制約了其作為藥品的開發(fā)和利用[2]。我們以PLGA為載體,使用改良優(yōu)化的復(fù)乳法,制備了載exendin-4的PLGA微球,并對微球的制備工藝、體外釋藥特性進(jìn)行研究,以便進(jìn)一步開發(fā)成高效、低毒的長效制劑。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 85-2A數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);BSA-124sCW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);HYL-1080激光粒度分布儀(丹東市浩宇科技有限公司);THZ-82恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);日立S-6000型掃描電鏡(日本Hitachi公司)。

    1.2 試藥 exendin-4(成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%,批號120701);PLGA(濟(jì)南岱罡生物科技有限公司,批號:1201101,Mw=10 000,LA/GA=50/50,特異性黏度為0.19dL·g-1);聚乙烯醇(PVA,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙腈、甲醇(Sigma-aldrich公司,HPLC 級);二氯甲烷、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和氯化鈉(NaCl)等其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 exendin-4-PLGA 微球的制備方法 將exendin-4溶于(明膠)水溶液中,形成內(nèi)水相;將PLGA(LA/GA=50/50,相對分子質(zhì)量=10 000)溶于CH2Cl2中,形成油相;將水相加入油相超聲1min乳化得初乳。在磁力攪拌器攪拌條件下,將初乳倒入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚乙烯醇(PVA)水溶液中,攪拌2min,得到復(fù)乳。將復(fù)乳倒入一定質(zhì)量濃度的氯化鈉水溶液中,在25℃條件下繼續(xù)攪拌4h,揮發(fā)有機(jī)溶劑,固化微球,離心,洗滌3次,冷凍干燥24h,即得。

    2.2 微球載藥量和包封率的測定 精密稱取適量干燥微球,置于5mL離心管中,加入0.5mL CH2Cl2,渦漩2 min;再加入蒸餾水1mL,渦漩2min;以3 000r·min-1離心10min,上清液過0.45μm微孔濾膜,濾液作為供試品溶液,進(jìn)行HPLC分析。

    載藥量=微球中所含藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量×100%

    包封率=微球的實(shí)際載藥量/理論載藥量×100%

    HPLC的色譜條件為:Promosil C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);檢測波長為215nm;柱溫為室溫;流速為1mL·min-1;流動相A為0.05mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用100g·L-1氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH=5.0),流動相B為乙腈,A∶B為3∶1;進(jìn)樣量為15μL。exendin-4保留時間在15min左右。

    取exendin-4對照品適量,精密稱定,用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為6.25,12.5,25,50,100,200和400μg· mL-1的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液,HPLC 測 定。以exendin-4的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y=10.65 X-29.92,r=0.999 0,表明艾塞那肽的質(zhì)量濃度在6.25~400μg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

    取質(zhì)量濃度為250,125和62.5μg·mL-1艾塞那肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各以上述色譜條件進(jìn)樣測得日內(nèi)RSD(n=3)分別為0.74%,0.80%和0.67%;日間精密度RSD(n=3)分別為0.43%,0.57%和0.39%;回收率分別為97.83%,103.01%和100.19%,符合方法學(xué)要求。

    2.3 優(yōu)化配方與工藝

    2.3.1 超聲時間對包封率的影響 超聲時間是影響微球包封的主要因素[3],超聲的時間長,微球的包封好,但是超聲時間過長會影響藥物的活性。固定水相/油相的體積比為1∶50,不同超聲時間對包封率影響的結(jié)果顯示,超聲時間為5,10和15min時,包封率分別為46.8%±3.2%,40.0%±1.0%和36.2%±3.6%,提示超聲時間為5min時,包封率較高。

    2.3.2 內(nèi)水相與油相體積比對包封率的影響 水相油相的體積比是微球包封率的最主要影響因素,且水相與油相的體積比范圍在1∶50~1∶200[3]之間,結(jié)果:改變水相與油相體積比從1∶50~1∶200時,水相與油相體積比為1∶100時,包封率較高(與其他組比較P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。水相與油相體積比升高或降低,包封率都有所下降,因此選擇水相與油相體積比為1∶100較為合理。見表1。

    表1 不同W/O條件下微球的包封率及載藥量Tab.1 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different W/O ratio(xs,n=3)

    表1 不同W/O條件下微球的包封率及載藥量Tab.1 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different W/O ratio(xs,n=3)

    注:與其他實(shí)驗(yàn)組相比*P<0.05

    實(shí)驗(yàn)號 V內(nèi)水相/μL V油相/mL V內(nèi)水相/V油相 V外水相/mL 載藥量/% 包封率/%1 50 2.5 1∶50 50 1.05±0.03 42.0±1.2 2 25 2.5 1∶100 50 1.58±0.07 63.0±2.6*3 16.7 2.5 1∶150 50 0.90±0.02 35.8±0.7 4 12.5 2.5 1∶200 50 0.78±0.02 31.3±0.6

    2.3.3 外水相與初乳體積比對包封率的影響 初乳與外水相的體積比是影響微球包封率的因素且初乳與外水相的體積比范圍在1∶10~1∶25[3]之間,結(jié)果:改變外水相與初乳的體積比從1∶10~1∶25,外水相與初乳體積比為1∶20,包封率較高(與其他組比較P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異),外水相與初乳的體積比過高或過低都會使微球的包封率降低,因此選擇初乳與外水相的體積比為1∶20較為合理。見表2。

    表2 不同O/W條件下微球的包封率及載藥量Tab.2 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different O/W ratio(xs,n=3)

    表2 不同O/W條件下微球的包封率及載藥量Tab.2 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different O/W ratio(xs,n=3)

    注:與其他實(shí)驗(yàn)組相比*P<0.05

    實(shí)驗(yàn)號 V內(nèi)水相/μL V油相/mL V初乳/V外水相 V外水相/mL 載藥量/% 包封率/%1 50 5.0 1/25 50 0.93±0.10 36.9±4.1 10 50 0.98±0.03 39.3±1.3 2 33 3.3 1/15 50 1.24±0.05 49.6±1.8 3 25 2.5 1/20 50 1.57±0.06* 62.8±2.3*4 20 2.0 1/

    2.3.4 PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對包封率的影響 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響微球包封率的因素且質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在1%~3%[3]之間,改變PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù),PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時,包封率較高,與PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%組相比,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但是從節(jié)省原料成本考慮,外水相選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的PVA溶液較為合理。見表3。

    表3 不同PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下微球的包封率及載藥量Tab.3 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different concentration of PVA (±s,n=3)

    表3 不同PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下微球的包封率及載藥量Tab.3 Encapsulation efficiency and drug loading of microspheres prepared in different concentration of PVA (±s,n=3)

    注:與PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%組相比*P<0.05

    實(shí)驗(yàn)號 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 載藥量/% 包封率/%1 1 1 1.22±0.06 48.6±2.3 2 2 1.53±0.07* 61.1±2.7*3 3 1.44±0.07 57.6±2.7

    2.3.5 攪拌速度對包封率及粒徑的影響 復(fù)乳的攪拌速度是影響微球包封率及粒徑的因素,且復(fù)乳的攪拌速度范圍在800~1 2 00r·min-1[3]之間,改變復(fù)乳的攪拌速度,復(fù)乳的攪拌速度越大,微球的粒徑越小,且對微球的包封率影響較小,各實(shí)驗(yàn)組間包封率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),復(fù)乳的攪拌速度是影響微球粒徑的最主要因素,為綜合考慮微球的粒徑和包封率,選擇1 200r·min-1的轉(zhuǎn)速較為合理。見表4。

    表4 不同轉(zhuǎn)速下微球的包封率、載藥量和粒徑大小Tab.4 Encapsulation efficiency and drug loading and mean diameter of microspheres prepared in different homogenization speed(±s,n=3)

    表4 不同轉(zhuǎn)速下微球的包封率、載藥量和粒徑大小Tab.4 Encapsulation efficiency and drug loading and mean diameter of microspheres prepared in different homogenization speed(±s,n=3)

    實(shí)驗(yàn)號 復(fù)乳攪拌速度/r·min-1粒徑大小 載藥量/% 包封率/%/μm 1 800 75.18±1.59 1.56±0.06 62.3±2.5 2 1 000 62.93±3.08 1.52±0.06 61.0±2.6 3 1 200 14.87±6.04 1.45±0.06 57.8±2.6

    2.3.6 制備工藝驗(yàn)證 按最佳制備工藝即V內(nèi)水相/V油相為1∶100;復(fù)乳的攪拌速度為1 200r·min-1;PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%;超聲時間5min;V油相/V外水相為1∶20制備3批載藥微球,以粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo),結(jié)果制備的微球圓整、粒徑分布均勻、平均粒徑在18μm左右,包封率在60%左右,載藥量在1.5%左右,與單因素實(shí)驗(yàn)相符,制備工藝較為穩(wěn)定。見表5。

    表5 最佳工藝條件下微球的粒徑大小、載藥量和包封率Tab.5 Encapsulation efficiency and drug loading and mean diameter of microspheres prepared under optimal conditions

    2.4 微球的形態(tài)、粒徑大小和分布 取exendin-4微球凍干粉適量,置于雙面膠帶上,涂布均勻,濺金,置于電子掃描顯微鏡下觀察微球的形狀、大小和表面形態(tài)。取微球混懸液3mL,加入適量蒸餾水稀釋,用激光粒徑測定儀測定粒徑大小和分布。

    結(jié)果分析:從電鏡照片(圖1)可以看出微球圓整,無黏連,大小較均勻,局部放大的電鏡照片表明微球表面具有許多細(xì)小的孔洞,是制備微球過程中二氯甲烷被萃取揮發(fā)所致。從粒徑分布(圖2)表明微球的粒徑分布較為對稱,平均粒徑在15μm左右。

    圖1 exendin-4載藥微球的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Morphology of exendin-4loaded microspheres by scanning electron microscope

    圖2 exendin-4載藥微球的粒徑大小分布Fig.2 The particle size distribution of exendin-4loaded microspheres

    2.5 微球的體外釋藥實(shí)驗(yàn) 精密稱取含藥微球,將微球放入以含體積分?jǐn)?shù)為0.02%Tween-80和質(zhì)量濃度為0.2g·L-1疊氮鈉的PBS緩沖液(pH=7.4)的釋放介質(zhì)中,置于恒溫水浴搖床中,在100r·min-1,37℃條件下,進(jìn)行微球的體外釋放度測定實(shí)驗(yàn)。分別在1~7d取出全部釋放介質(zhì),高效液相色譜法測定艾塞那肽含量。剩余微球加入全新的釋放介質(zhì)繼續(xù)在水浴搖床中震蕩[4]。

    本實(shí)驗(yàn)利用在外水相中加入氯化鈉[5],使藥物不易在微球中滲透出,來大大降低微球的第1天的釋放效應(yīng)[6-9]。從表6中可以看出當(dāng)不加氯化鈉時,微球的第1天的釋放百分比較高,隨著外水相中的氯化鈉質(zhì)量濃度的增加,微球的第1天的釋放效應(yīng)百分比隨之降低,當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度為10mg·mL-1時,微球的第1天的釋放效應(yīng)百分比為16%左右,綜合考慮選擇在外水相中加入10mg·mL-1的氯化鈉溶液較為合理。見表6。

    表6 不同氯化鈉質(zhì)量濃度下制備的微球的釋放百分比Tab.6 The percentage of the release of microspheres prepared in different concentration of NaCl(s,n=3)

    表6 不同氯化鈉質(zhì)量濃度下制備的微球的釋放百分比Tab.6 The percentage of the release of microspheres prepared in different concentration of NaCl(s,n=3)

    樣品 NaCl質(zhì)量濃度/mg·mL-1第1天釋放百分比/%1 0 47.1±3.6 2 2.5 22.8±2.9 3 5 18.5±2.1 4 10 16.1±1.6 5 20 15.2±3.1

    從微球體外釋放曲線圖中可以看出,在PVA溶液中加入10mg·mL-1氯化鈉、投藥量為20mg時,第1天的釋放量在20%以下,大大降低了微球的釋放量,第2天的釋放量較多,隨后幾天都會下降,第7天累積釋放量達(dá)到了80%以上,見圖3。

    圖3 exendin-4載藥微球體外釋放Fig.3 The release curve of exendin-4loaded microspheres in vitro

    3 討論

    本研究以PLGA為載體材料,采用復(fù)乳法[7,10]制備微球,應(yīng)用單因素設(shè)計來進(jìn)行exendin-4緩釋微球制備工藝的優(yōu)化,經(jīng)工藝優(yōu)化后制備的exendin-4微球,表面光滑圓整,粒徑分布均勻,平均粒徑在15μm左右,包封率在60%左右,7d累積釋放量達(dá)到了80%以上,基本符合緩釋1周的制劑要求。

    釋放效應(yīng)已成為微球制劑必不可少的考察指標(biāo)之一,對于安全系數(shù)比較高、治療窗比較窄的藥物要嚴(yán)格控制突釋,藥物釋放效應(yīng)的影響因素較多,如聚合物的組成、相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu),藥物本身對釋放的影響,制備工藝的影響等。傳統(tǒng)的復(fù)乳法得到的微球釋放百分比較高,控制釋放的方法主要有:①外水相加滲透壓物質(zhì);②選擇適當(dāng)?shù)妮d體材料;③控制微球粒徑、載藥量。本實(shí)驗(yàn)利用在外水相中加入氯化鈉[5],使藥物不易在微球中滲透出,來大大降低微球的第1天的釋放效應(yīng)[6-11]。研究顯示,微球的體外釋藥規(guī)律符合Higuichi方程,第1天釋放量均值為16.1%,7d后累積釋放量達(dá)到80%,且其質(zhì)量濃度保持在一定的水平。因此,在7d內(nèi)exendin-4微球體外緩釋作用明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較理想。

    為了深入研究,需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)藥動學(xué)和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),考察由PLGA包裹的exendin-4緩釋微球?qū)μ悄虿游锏捏w內(nèi)釋放特性和治療作用。總之,本研究所制備的exendin-4-PLGA緩釋微球有望發(fā)展成為一種臨床治療糖尿病的長效注射劑。

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