基于微流控芯片技術(shù)研究水紅花子復(fù)方抗腫瘤的作用△

王乙同，馬立東，孟憲生，包永睿，王帥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

研究開發(fā)

“十二五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項——中藥復(fù)方多組分配伍篩選集成化微流控芯片的構(gòu)建及新藥篩選(2013ZX09507005)

△*

孟憲生，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析；Tel：(0411)87406496，E-mail：mxsvvv@126.com

基于微流控芯片技術(shù)研究水紅花子復(fù)方抗腫瘤的作用△

王乙同，馬立東，孟憲生*，包永睿，王帥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的基于微流控芯片技術(shù)研究水紅花子復(fù)方含藥血清對肝腫瘤SMMC-7721細胞的凋亡壞死影響及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分泌的影響。方法設(shè)計與制作玻璃-PDMS復(fù)合濃度梯度芯片,并對芯片藥物濃度梯度進行表征；將SMMC-7721細胞長期培養(yǎng)在芯片中，繪制細胞的生長曲線，AO/EB法檢測細胞死活率；將預(yù)制備的含藥血清通入微流控芯片，分別作用于SMMC-7721細胞24 h和48 h，凋亡壞死試劑盒檢測凋亡壞死率；收集各通道的細胞上清液，ELISA法測定VEGF的蛋白含量。結(jié)果細胞在芯片中培養(yǎng)7 d，細胞增殖活性良好，培養(yǎng)72 h期間細胞存活率≥97%。芯片可產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，線性相關(guān)系數(shù)為0.996 4。芯片中含有藥物血清的培養(yǎng)液分別作用SMMC-7721細胞24 h和48 h后，發(fā)生凋亡壞死細胞的數(shù)量隨含藥血清作用濃度升高而逐漸升高，細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量隨含藥血清作用濃度升高而逐漸減少，都呈現(xiàn)出一定的時間與濃度依賴性。結(jié)論基于微流控芯片技術(shù),進一步證明水紅花子復(fù)方含藥血清對肝腫瘤SMMC-7721細胞具有促凋亡作用,且能抑制其分泌VEGF從而間接抑制腫瘤血管新生達到抗腫瘤作用。

微流控芯片；藥物濃度梯度；中藥復(fù)方；含藥血清；藥物篩選

癌癥是導(dǎo)致現(xiàn)代人類死亡的疾病之一，當前中國腫瘤病發(fā)率和死亡率都呈加速發(fā)展態(tài)勢，根據(jù)全國腫瘤登記中心發(fā)布的《2012中國腫瘤登記年報》，全國每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬例，死亡病例約為270萬。這些數(shù)據(jù)宣告中國已進入與腫瘤鏖戰(zhàn)的前沿陣地，也使得相關(guān)抗腫瘤新藥的篩選與研發(fā)得到了我國高度的重視。我國中藥資源豐富，從中草藥中篩選抗腫瘤藥物具有得天獨厚的優(yōu)勢，但目前大部分實驗室還停留在傳統(tǒng)孔板篩選模式，實驗人員往往要面對通量低、繁瑣操作、試劑耗材消耗量大、成本高等問題，這對于從數(shù)以萬計中草藥單體(組分)中篩選出具有抗腫瘤活性藥物提出了艱巨挑戰(zhàn)。近年來隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，體外藥物篩選研究出現(xiàn)了一種新型的技術(shù),即微流控芯片(Microfluidics)技術(shù)，以其小型化[1]、操作靈活、高通量(High Throughput Screening)、高內(nèi)涵[2]、與生物體內(nèi)相似的微環(huán)境[3]等優(yōu)勢已經(jīng)逐漸受到關(guān)注，這為抗腫瘤藥物的高效篩選帶來希望。

水紅花子復(fù)方為臨床經(jīng)驗方，是由水紅花子、花蕊石、薏苡仁和白茅根4味中藥組成，具有健脾祛濕、活血化瘀、緩消癥塊等功效[4]，是經(jīng)過臨床驗證優(yōu)選出最佳配伍比例的復(fù)方，臨床證實其對肝癌患者有很好的治療效果。實驗以該復(fù)方的含藥血清作為研究對象，采用微流控濃度梯度芯片一站式生成8種濃度梯度對水紅花子中藥復(fù)方含藥血清進行抗腫瘤的體外藥效研究，同時ELISA法定量檢測不同濃度藥物干預(yù)后腫瘤細胞分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)水平的變化，初步研究中藥水紅花子復(fù)方不同含藥血清濃度對肝腫瘤的影響。本文研究旨在通過應(yīng)用微流控芯片技術(shù)，為我國抗腫瘤新藥特別是抗腫瘤中藥活性單體(組分)的快速篩選與研究提供一種新思路和新方法。

1 材料

1.1 動物

選用成年健康SD大鼠16只，雌雄各半，體重(200±20) g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXX(遼)2011-0002。

1.2 藥物與試劑

水紅花子復(fù)方：水紅花子、花蕊石、白茅根有效物質(zhì)組噴霧干燥處理后，與薏苡仁物質(zhì)組按照配伍比例混合，委托秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司加工制成納米顆粒膠囊。

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。吖啶橙(AO)、溴化乙錠(EB)、熒光素、多聚L-賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)均購自美國Sigma公司。SU8 2075光刻膠(美國 Micro-Chem 公司)。Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷(PDMS)、固化劑(美國Dow Corning 公司)。細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(Hoechst 33342和PI，碧云天生物技術(shù)研究所)。胰蛋白酶(美國GIBCO公司)。人腫瘤血管生長因子(VEGF)ELISA Kit (上海滬宇生物科技有限公司)。

1.3 細胞株

人肝癌細胞株SMMC-7721(上海復(fù)蒙生物有限公司)。SMMC-7721細胞使用含有10%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，在飽和濕度、37 ℃、5% CO2通用培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)，當細胞生長匯合至80%～90%時，將細胞進行1∶3傳代。

1.4 儀器

NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國NUAIRE公司)；SORVALL fresco高速離心機(美國科峻儀器公司)；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；AE31型倒置顯微鏡(廈門Motic公司)；BX51熒光型顯微鏡(日本Olympus公司)；圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0(IPP，美國Media Cybernetics公司)；JKG-2A 型光刻機(上海學(xué)澤光學(xué)機械有限公司)；HPDC-32G-2型等離子清洗機(美國Harrick Plasma公司)；LSP04-1A精密注射泵(保定蘭格公司)。

1.5 芯片設(shè)計與制作

實驗設(shè)計的微流控芯片為PDMS-玻璃復(fù)合芯片，如圖1所示。芯片采用軟光刻技術(shù)以及模塑法制作，氧等離子體處理進行鍵合[5-6]。芯片通道高度為100 μm，上部由細胞培養(yǎng)液入口和含有藥物的細胞培養(yǎng)液入口組成，藥物由注射泵經(jīng)入口處注入寬為100 μm濃度梯度發(fā)生區(qū)，產(chǎn)生8個濃度的藥物梯度并經(jīng)細胞緩沖區(qū)(細胞緩沖區(qū)具有8個外接出口，方便后期細胞引入)進入半徑為800 μm圓形細胞培養(yǎng)區(qū)，每個濃度梯度下的細胞培養(yǎng)腔均有4個復(fù)孔，培養(yǎng)室下部另設(shè)有8個出口，可將細胞代謝物進行收集(不需要時可由專用堵頭進行封口)。

2 方法

2.1 含藥血清制備

16只成年健康SD大鼠隨機分為2組，空白組8只，給藥組8只。給藥組將水紅花子復(fù)方膠囊制劑的內(nèi)容物取出溶于藥用大豆油中，制成0.5 mL灌胃溶液，大鼠給藥劑量參照公式：用藥劑量=臨床用量×動物等體表面積系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋倍度[7]，采用日劑量一次給藥法算出大鼠最大給藥量為125 mg·kg-1。空白組灌服相同量的空白藥用大豆油。兩實驗組灌胃前禁食不禁水12 h。大鼠采用眼眶靜脈取血，根據(jù)本實驗室已掌握的該中藥復(fù)方中活性組分的血中代謝規(guī)律，將取血時間分段為1，2，3，4 h，每次取血約0.8 mL，期間腹腔注射補充適當0.9%氯化鈉溶液。全血室溫靜置2 h，3 000 r·min-1，離心15 min，吸取血清，同組血清混合，56 ℃水浴滅活30 min，DMEM不完全培養(yǎng)基稀釋至血清含量10%，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 芯片藥物濃度梯度的表征

實驗采用熒光素染料(M：376.27)進行濃度梯度的表征實驗。熒光素染料(100 mg·L-1)和無菌水分別通過芯片上部兩個入口以0.6 μL·min-1的流速注入芯片中，待液流穩(wěn)定后用熒光顯微鏡拍攝8個細胞緩沖區(qū)通道的熒光圖片，專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 (IPP)分析每個通道的光密度平均值(Density mean)。

圖1 芯片示意圖

2.3 芯片細胞培養(yǎng)的預(yù)處理

采用0.1 mg·mL-1的多聚L-賴氨酸(PLL)對芯片下部細胞培養(yǎng)腔進行包被處理，促進細胞快速貼壁[8]。芯片在使用前通入75%乙醇10 min滅菌，后用無菌水沖洗數(shù)遍，烘干，注入細胞前紫外照射10 min。

2.4 細胞在芯片中的長期培養(yǎng)和細胞活力

將對數(shù)生長期的細胞用0.25%的胰酶進行消化，消化后進行離心富集，將細胞用培養(yǎng)液稀釋至5×105個·cm-2的密度，通入芯片后放入細胞培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁后，用精密注射泵以流速為0.6 μL·min-1將完全培養(yǎng)液注入芯片中，隨機抽取芯片8組通道中任意4個細胞培養(yǎng)腔，每24 h拍照1次，通過IPP軟件對細胞圖像進行計數(shù)分析，4個培養(yǎng)腔中細胞數(shù)取平均值并計算標準偏差，繪制出SMMC-7721肝癌細胞在芯片中的生長曲線。

SMMC-7721細胞在微流控芯片上分別培養(yǎng)24，48，72 h后，在芯片出口處將100 mg·L-1AO/EB混合液通入芯片中，避光染色5 min，PBS清洗3次，使用倒置熒光顯微鏡進行拍照，檢測細胞的存活率，每條通道中4個培養(yǎng)腔分別計數(shù)。其中正?；钚约毎?VN)：細胞呈圓形，核質(zhì)體著綠色，大小形狀較單一；壞死細胞(NVN)：細胞呈橢圓形，核質(zhì)體著桔紅色，大小形狀較單一；凋亡早期細胞(VA)：核質(zhì)體著綠色，細胞形狀不規(guī)則，呈新月形；凋亡晚期細胞(NVA)：核質(zhì)體著桔紅色，染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀。細胞存活率按公式計算：細胞存活率%=VN/VN+NVN+VA+NVA×100%。

2.5 水紅花子復(fù)方含藥血清對肝癌細胞凋亡壞死的影響

將水紅花子復(fù)方含藥血清實時注入芯片24 h和48 h后，將芯片細胞緩沖區(qū)玻璃塞打開，將細胞染色緩沖液、Hoechst 33342染液和碘化丙啶(PI)染液1∶1(V/V)依次通入芯片中，4 ℃孵育10 min，PBS清洗3遍后使用Olympus熒光顯微鏡CellSens成像軟件進行拍照。由于正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞的細胞膜完整性的差異，Hoechst 33342和PI可使不同狀態(tài)的細胞核著染不同的顏色：正常細胞核呈弱藍色熒光+弱紅色熒光，凋亡細胞核呈強藍色熒光+弱紅色熒光，壞死細胞核呈強紅色熒光+強藍色熒光。

2.6 ELISA法檢測細胞上清VEGF的含量

將芯片細胞培養(yǎng)腔下部的8個出口通過聚四氟乙烯管與離心管相連接，實時收集細胞上清液。注射泵流速為0.6 μL·min-1連續(xù)給藥，分別收集給藥24 h和48 h后各通道細胞上清液，將收集到的上清液凍存在-20 ℃冰箱中，臨用4 ℃現(xiàn)化，3 000 r·min-1，離心25 min，仔細吸取上清液。ELISA操作方法嚴格按照說明書上進行操作，對照和樣品均設(shè)3個復(fù)孔，450 nm波長測定各孔的OD值，以濃度為橫坐標，OD為縱坐標繪制標準曲線，通過公式計算出每個通道的VEGF含量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

3 結(jié)果

3.1 芯片藥物濃度梯度的表征測試

經(jīng)前期考察細胞培養(yǎng)液流速設(shè)為0.6 μL·min-1時，細胞在此剪切力下無明顯影響，芯片同時可形成較好的濃度梯度，如圖2所示。通過光密度測試后得出線性回歸方程為Y=-7.69X+62.71，r=0.998 2，說明濃度產(chǎn)生實際值與理論值[9]相近，即芯片兩注入口濃度分別為0和最終濃度c，則芯片濃度梯度發(fā)生區(qū)8個通道濃度關(guān)系為0，0.14c，0.28c，0.43c，0.57c，0.71c，0.86c，c。

圖2 熒光素濃度梯度圖(n=5)

3.2 細胞在芯片中的生長曲線和活力

經(jīng)過多聚賴氨酸處理的通道，SMMC-7721細胞能在3 h內(nèi)貼壁完全，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，細胞每天都在持續(xù)增殖，如圖3所示。通過IPP軟件對細胞圖像進行計數(shù)分析，繪制單個培養(yǎng)腔中的細胞生長曲線，如圖4所示。用熒光染料AO/EB對細胞進行前72 h的染色，計算出細胞在芯片中存活率都能達到97%以上，如圖5、圖6所示。

圖3 細胞在芯片中的生長狀態(tài)圖(×40)

圖4 細胞在芯片單個培養(yǎng)腔中生長曲線(n=4)

圖5 芯片中AO/EB雙染細胞熒光圖(×40)

圖6 芯片中細胞存活率統(tǒng)計(n=4)

3.3 芯片中含藥血清對肝癌細胞的影響

實驗采用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)雙染法觀察芯片中不同濃度梯度含藥血清對肝癌細胞凋亡壞死的影響，從圖7(A)、(C)可知細胞培養(yǎng)腔隨濃度梯度的增加，細胞核呈現(xiàn)亮藍色熒光的個數(shù)也越多，即發(fā)生凋亡的細胞數(shù)開始增多，且同濃度梯度下可明顯觀察到48 h較24 h發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量多；從圖7(B)、(D)可知細胞培養(yǎng)腔隨濃度梯度的增加，細胞核呈現(xiàn)亮紅色熒光的個數(shù)也隨之增加，即發(fā)生壞死的細胞數(shù)開始增多，同時也可觀察到同濃度梯度下48 h較24 h凋亡的細胞數(shù)量增多。由于正常細胞核著弱藍色熒光和弱紅色熒光，導(dǎo)致其在芯片縮放圖中呈現(xiàn)不明顯；所以從圖中看到呈藍色或紅色熒光的細胞均為發(fā)生凋亡或壞死的細胞。

A.24 h的Hoechst 33342染色細胞熒光圖 B.24 h的PI染色細胞熒光圖 C.48 h的Hoechst 33342染色細胞熒光圖 D.48 h的PI染色細胞熒光圖圖7 Hoechst 33342/PI雙染熒光檢測結(jié)果(×40)

3.4 水紅花子復(fù)方對細胞分泌VEGF的影響

為客觀衡量VEGF的分泌情況，實驗對芯片中24 h與48 h的細胞總數(shù)進行了分析，發(fā)現(xiàn)細胞總數(shù)變化不顯著，藥物對肝腫瘤細胞呈現(xiàn)出一定的增殖抑制作用，所以在考察VEGF的分泌情況時排除了細胞數(shù)量對實驗造成的干擾。從實驗結(jié)果可知，與空白通道(通道1)比較，加藥通道的VEGF含量明顯降低，VEGF抑制率升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。作用時間相同條件下，隨著藥物濃度的升高，VEGF的含量呈現(xiàn)降低趨勢，VEGF抑制率呈現(xiàn)增大趨勢。藥物濃度相同條件下48 h的VEGF含量較24 h的低，48 h的VEGF抑制率較24 h的高，結(jié)果見表1與圖8，VEGF含量測定標準曲線公式為Y=0.000 3X-0.032 5，r=0.994 9。

表1 水紅花子復(fù)方對細胞分泌VEGF含量的影響 /pg·mL-1

注：24 h的與同組空白組(通道1)比較，#P<0.05，#P<0.01，n=3；48 h的與同組空白組(通道1)比較，**P<0.01，n=3

圖8 水紅花子復(fù)方含藥血清對細胞VEGF抑制率的影響

4 討論

實驗通過利用一種濃度梯度芯片，研究水紅花子復(fù)方含藥血清對肝腫瘤SMMC-7721的影響，實驗整體過程操作簡單，水紅花子復(fù)方含藥血清一步自動生成8個線性良好的濃度梯度，并實時作用于肝腫瘤SMMC-7721細胞，通過熒光倒置顯微鏡實時在線觀測藥物誘導(dǎo)肝腫瘤細胞凋亡的全過程，同步測定了VEGF分泌量的動態(tài)變化。實驗發(fā)現(xiàn)藥物作用時間相同條件下，隨著藥物濃度的增大，細胞發(fā)生凋亡壞死數(shù)量呈現(xiàn)出明顯增加，同步檢測藥物對SMMC-7721細胞分泌VEGF的抑制率也均呈增大趨勢，總體表現(xiàn)出明顯的劑量與效應(yīng)關(guān)系，且在第8通道即藥物作用濃度最大時，VEGF抑制率均達50%以上。在相同藥物作用濃度下，隨著給藥時間的延長，細胞發(fā)生凋亡壞死數(shù)量及VEGF的分泌抑制率也呈現(xiàn)增長趨勢，總體表現(xiàn)出了明顯的時間與效應(yīng)關(guān)系，且當藥物作用48 h達到最佳狀態(tài)。

從實驗前期結(jié)果可知，為了驗證芯片產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度能力，對芯片做了相應(yīng)的濃度梯度表征工作，在采用0.6 μL·min-1流速下芯片形成良好的濃度梯度，濃度梯度線性回歸系數(shù)達到r=0.998 2，濃度產(chǎn)生的實際值與理論值非常相近，這為保證后期實驗結(jié)果的準確性非常重要，也證明了本實驗室設(shè)計的濃度梯度芯片的可行性。同時考慮到新加工的芯片因其結(jié)構(gòu)的改變流體剪切力也會隨之改變，從而對細胞生長環(huán)境產(chǎn)生未知的影響，所以本實驗在0.6 μL·min-1流速下對肝腫瘤SMMC-7721細胞進行了長期培養(yǎng)研究，結(jié)果顯示細胞在芯片中持續(xù)培養(yǎng)168 h其生長狀態(tài)依然良好，仍有繼續(xù)增長的趨勢，且形態(tài)未出現(xiàn)細胞膨大、核濃縮等細胞壞死現(xiàn)象；同時實驗對芯片中72 h內(nèi)的細胞進行了活力檢測，細胞存活率都達到97%以上，所有的工作從側(cè)面佐證了在0.6 μL·min-1流速下芯片的實驗性能是準確可靠的。值得一提的是該實驗過程省去了傳統(tǒng)長期細胞培養(yǎng)實驗中不斷更換培養(yǎng)液的過程，因其極低的試劑消耗量及培養(yǎng)液實時更新等特點，本實驗一次換液就達到了肝腫瘤SMMC-7721細胞長期培養(yǎng)的目的，極大地節(jié)省時間、減少人力。

綜上所述，水紅花子復(fù)方含藥血清對肝腫瘤SMMC-7721細胞具有促凋亡作用并能抑制其分泌VEGF，且這種作用具有明顯的時間、劑量、效應(yīng)關(guān)系，說明水紅花子復(fù)方可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制VEGF分泌，間接抑制腫瘤血管新生等聯(lián)合作用來達到治療腫瘤的作用。最后應(yīng)該指出的是微流控芯片作為一門新興的技術(shù)，尤其在大規(guī)模抗腫瘤新藥研發(fā)領(lǐng)域尚屬早期，目前對芯片中藥物干預(yù)后的細胞信息采集依然需要借助熒光顯微鏡后期拍照分析，其圖片分析處理過程復(fù)雜繁瑣，芯片通量受阻明顯，細胞定量手段也欠佳。相信隨著熒光實時在線定量分析技術(shù)的完善，微流控芯片技術(shù)將在不久實質(zhì)性地縮短抗腫瘤新藥研發(fā)周期，降低研發(fā)成本，催生出民族新藥。

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Anti-tumorEffectofPolygoniorientalisFructusFormulaSeruminVitroBasedonMicrofluidicTechnology

WANGYitong，MALidong，MENGXiansheng*，BAOYongrui，WANGShuai

(CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To study the effect of Polygoni orientalis Fructus formula serum on hepatoma SMMC-7721 cells apoptosis，necrosis and the secretion of VEGF based on microfluidic technology.MethodsFabrication and design of the Glass-PDMS microfluidic device，validation of the concentration gradient generation integrated on the microfluidic device.SMMC-7721 were seeded into the microfluidic device，drawing cell growth curve and determination the cytotoxicity of cells to chip by AO/EB staining.Culture medium with medicinal serum was then injected into the microfluidic device by the syringe pump.Detection of the cells apoptosis and necrosis by Hoechst 33 342 and propidium iodide (PI) double staining after 24 h and 48 h，respectively.Supernatants collected from each cell culture channel.ResultsCells cultured for 7 days on the chip，cells viability ≥97% during 72 h.There was a good correlation (r=0.996 4) between the experimental and theoretical data，demonstrating the capability of the chip to generate concentration gradients.Culture medium with medicinal serum was incubated with SMMC-7721 cells for 24 and 48 h on chip，the number of cells with apoptosis and necrosis increased in response to the increasing concentration of medicinal serum，the secretion of VEGF decreased in response to the increasing concentration of medicinal serum，the morphological changes and the secretion of VEGF appeared to be dose-dependent and time-dependent.ConclusionOur job verified that Polygoni orientalis Fructus formula could promote the apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells，and indirectly inhibited tumor angiogenesis through inhibiting VEGF secretion and thus achieved anti-tumor effect based on microfluidic technology.

Microfluidics；Drug gradient generator；Traditional Chinese Medicine formula；Medicinal serum；Drug screening

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.02.003

2013-11-01)