萬古霉素耐藥基因研究進展及納米技術(shù)在提高萬古霉素抗菌活性中的應用

侴金江，顧覺奮

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萬古霉素耐藥基因研究進展及納米技術(shù)在提高萬古霉素抗菌活性中的應用

侴金江，顧覺奮

210009 南京，中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院

萬古霉素（vancomycin）是用于治療由革蘭陽性菌引起的嚴重感染疾病的抗生素。萬古霉素能夠與肽聚糖合成前體 lipoII中的 D-Ala-D-Ala 末端結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)肽反應來阻斷高分子肽聚糖的合成，造成細菌因細胞壁缺陷破裂而死亡[1]。自 1986 年首次分離得到具有萬古霉素抗性的腸球菌菌株后，萬古霉素抗性在腸球菌屬中廣泛傳播。目前關(guān)于萬古霉素耐藥基因的研究已經(jīng)取得了一定的成果。1990 年，發(fā)現(xiàn)A 基因能誘導生成相應的抗性蛋白A，其具有 D-Ala-D-Lac 連接酶活性。而后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了H 和X 等基因，且細胞壁合成途徑的改變需要有H、A、X 等基因的參與[2]。截止目前，有多種萬古霉素耐藥基因已被發(fā)現(xiàn)并鑒定了部分耐藥基因在基因簇中的位置和編碼產(chǎn)物，匯總于表 1。針對萬古霉素的耐藥越來越普遍的現(xiàn)象，如何增強萬古霉素的抗菌活性就顯得尤為重要。目前以納米顆粒裝載萬古霉素的給藥方式顯示出了巨大的優(yōu)勢[3]。本文將就最近幾年有關(guān)萬古霉素耐藥基因的研究以及提高其抗菌活性的研究進行綜述。

1 形成萬古霉素耐藥性的機制

目前有兩種主流假說解釋萬古霉素耐藥性的形成機制。第一種也是最常見的一種機制是肽聚糖合成前體末端上的 D-Ala-D-Ala 轉(zhuǎn)變?yōu)?D-Ala-D-Lac 或者 D-Ala-D-Ser，并伴隨相關(guān)多肽酶介導的 D-Ala-D-Ala 清除。研究指出，D-Ala-D-Lac 和 D-Ala-D-Ser 結(jié)合萬古霉素的親和力比 D-Ala-D-Ala 分別低1000 倍和 6 倍[1, 4]，導致萬古霉素不能與相應部位結(jié)合進而裂解細胞。編碼萬古霉素抗性的相關(guān)酶基因位于具有多順反子性的操縱子上，具體有編碼 D-Ala-D-Lac 和 D-Ala-D-Ser 連接酶的A、B、C、D、E、G 和L 基因；編碼丙酮酸脫氫酶的H 等基因；編碼蘇氨酸解旋酶的T 和TG等基因；編碼D,D-二肽酶的X 和XB等基因；編碼 D,D-羧肽酶的Y、YB和YD基因。這一機制被視為產(chǎn)糖肽類抗生素放線菌的自我保護方式[1]。

第二種較為重要的機制認為耐藥性是由內(nèi)源的二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two-component signal transduction systems，TCS）突變而引起的，而A、B、D 基因簇均含有 TCS。研究指出能夠通過此機制獲得耐藥性，并且 TCS 控制正常細胞壁代謝和調(diào)控細胞壁損傷時的細胞應答[1]。

2 萬古霉素耐藥基因研究進展

目前針對萬古霉素耐藥基因已經(jīng)進行了很多的研究，A、B、C 等基因早已被發(fā)現(xiàn)并通過測序了解其在基因簇中的具體位置，此外許多研究也證明了這些基因與萬古霉素耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。以下將關(guān)注其中一些基因的最新研究進展。

表 1 腸球菌對糖肽類的耐藥水平[5-6]

2.1 vanA

A 基因簇是 Tn1546 轉(zhuǎn)座子的一部分，其中包含了R-S 二組分調(diào)控系統(tǒng)序列。最近，de Niederh?usern等[7]研究指出，耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（vancomycin resistant，VRSA）的萬古霉素抗性可由與之共感染的耐萬古霉素腸球菌（vancomycin resistant，VRE）中包含A 基因的 Tn1546 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移而來。該研究分別選取了 5 種 VRE（VanrRifs）和 5 種對利福平耐藥的金黃色葡萄球突變菌株（VansRifr）進行對應的菌株接合轉(zhuǎn)移，結(jié)果EMM09 和STM359 組與EMB04 和STM17 組接合轉(zhuǎn)移成功。兩種成功的接合轉(zhuǎn)移子對萬古霉素的 MIC 值為 32 μg/ml，與 EMM09 和 EMB04（MIC > 128 μg/ml）相比，MIC 偏小，但比親本高。有兩種可能的原因?qū)е铝私雍限D(zhuǎn)移子的萬古霉素抗性低于相應的供體菌，一是遺傳的不穩(wěn)定性，二是接合轉(zhuǎn)移后抗性產(chǎn)生的延遲。但也有研究表明，萬古霉素抗性的消失并不完全依賴于含有A 基因的 Tn1546 轉(zhuǎn)座子的缺失[8]。

2.2 vanV

Ribeiro 等[9]在糞腸球菌中鑒定了一種新的基因?qū)儆贐 基因簇。在XB基因的 3' 端存在2292 的開放閱讀框（open reading frame，ORF），2292 處于XB基因的下游，用 Fold-change 值衡量基因差異表達，其值為 26，與其他抗性基因處于同一誘導水平，該結(jié)果顯示2292 是B 操縱子的一部分。此外，RT-PCR 和 Northern blot 結(jié)果顯示，2292 和B 操縱子共轉(zhuǎn)錄并共用一個啟動子 PYB，并將其命名為V 基因。然而，該研究發(fā)現(xiàn)在其他 7 種和 24 種中，僅有兩株細菌能夠產(chǎn)生預期的相似復制子。萬古霉素對 V583 菌株以及V 基因缺失的 V583 菌株的 MIC 值表明，V 對萬古霉素抗性的形成沒有作用。V 基因是B 基因簇的一部分，與YBWHBBXB成線性排列（圖 1）且不參與形成萬古霉素抗性。

2.3 vanG

Peltier 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，的G 樣基因簇有 5 個 ORFs，分別是調(diào)控區(qū)（R 和S）和效應區(qū)（G、XY 和T）。630 菌株的基因組序列與腸球菌的G 基因簇有很高的相似性，但630 菌株對萬古霉素敏感。該基因座有 6153 個堿基，在基因座的 5' 端有同源的RG和SG基因組成的二組分調(diào)控系統(tǒng)，在SG基因下游 51 nt 處有一莖環(huán)結(jié)構(gòu)與依賴 Rho 因子的終止過程有關(guān)?？剐詤^(qū)域組成為G、XYG和TG樣基因。G 基因簇的結(jié)構(gòu)組成表明該基因簇范圍因兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)而擴展（圖 2）。經(jīng)實時熒光定量 PCR 檢測，XYG樣基因和TG基因是共轉(zhuǎn)錄的。該研究也證明了G 樣基因簇的存在與否對細胞壁的組成并沒有影響，因此具有G 樣基因簇的菌株依然對萬古霉素敏感。

2.4 vanN

Lebreton 等[4]發(fā)現(xiàn)UCN71 菌株具有萬古霉素抗性卻不含有已知的抗性基因，并將新基因命名為N。他們對 UCN17 的總 DNA 克隆并測序表明N 與L 有 65% 的一致性，N 基因編碼的連接酶與C、E、G、L 編碼的連接酶有 41% ~ 65% 的相似度，所有存在于 D-Ala-D-Ser 連接酶的結(jié)構(gòu)域也存在于N 中。結(jié)構(gòu)分析顯示，N 操縱子具有 5 個 ORFs，即N、XYN、TN、RN和SN，其中TN和TC具有 52% 的相似性，RN和SN二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)也和其他基因相似。RACE-PCR 測定N 的啟動子 PN與C 和E的相似。UCN71 能合成等量 Ala 和 Ser 為末端的前體。N 是第一個被發(fā)現(xiàn)存在于 D-Ala-D-Ser 型萬古霉素抗性菌株中的基因。

2.5 vanM

Xu 等[11]從具有萬古霉素抗性的Efm-HS0661 菌株中發(fā)現(xiàn)了一種新的基因簇即M?；蛐蛄蟹治鲲@示，M 的長度為 1032 bp，編碼一個 343 個氨基酸的蛋白質(zhì)。同時，M 基因簇與A、B、D 和F 等基因簇具有較高相似度。該基因簇含有 7 個 ORFs，根據(jù)其與A、B、D 等基因簇編碼蛋白的氨基酸序列相似性程度，將其中的 6 個 ORF 分別命名為RM、SM、YM、HM、M 和XM。RM-SM與A 基因簇中的R-S 二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)序列相似，而YM與A 基因簇中的Y 基因序列相似，HM則與A、B、D 等基因簇中的H、HB、HD基因序列相似，類似地，XM與A、B、D 等基因簇中的XA、XB、XD基因序列相似，以上相似度在 58.8% ~ 85.7% 間浮動。LC-MS 結(jié)果表明，由M 基因簇產(chǎn)生的萬古霉素抵抗是由于肽聚糖前體末端的組成變?yōu)榱?D-Ala-D-Lac。

圖 1 具有新基因vanV 的vanB 操縱子結(jié)構(gòu)[9]（在vanV 基因的上游和PYB啟動子的下游之間沒有其他啟動子區(qū)域）

圖2 vanG 樣基因簇結(jié)構(gòu)[10]

2.6 vanR-vanS 二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)

R-S 二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的激活是誘導細菌產(chǎn)生萬古霉素抗性所必須的，二組分調(diào)控系統(tǒng)由R 和S 兩基因構(gòu)成，R 基因可以對刺激進行應答調(diào)控，而S 則編碼一種應激蛋白，通常R 和S 基因在染色體上與H、A、B 基因相鄰。Kwun 等[2]以的抗性系統(tǒng)為模型進行體內(nèi)實驗表明，在B 型的抗性系統(tǒng)中，S 感應激酶的激活依賴于和 D-Ala-D-Ala 形成復合物。目前有兩種模型假說解釋識別S應激蛋白特異性配體的本質(zhì)：第一種模型是直接誘導，認為感應激酶是與抗生素在感應區(qū)直接結(jié)合而激活的；第二種模型是間接誘導，認為感應激酶是與細胞壁代謝物結(jié)合的，而這些代謝物是在細胞壁合成和與藥物反應過程中產(chǎn)生的。在Koteva 等[12]研究中，利用一種合成的光親和探針 VPP 證實了第一種模型為正確解釋。

3 提高萬古霉素抗菌活性的相關(guān)研究進展

目前多藥耐藥菌株的出現(xiàn)引起了研究人員的高度關(guān)注，而納米顆粒偶聯(lián)萬古霉素在應對萬古霉素耐藥問題中顯示出獨特的優(yōu)勢。

Fayaz 等[13]利用萬古霉素偶聯(lián)金納米顆粒（vancomycin bound gold nanoparticles，VBGNP）對抗VRSA 取得了一定的成果。在實驗中，他們利用真菌進行金納米顆粒的生物合成，與萬古霉素偶聯(lián)后獲得了對 VRSA、萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌（vancomycin sensitive，VSSA）和大腸桿菌的抗菌活性。結(jié)果表明，VBGNP 對于 VRSA 表現(xiàn)良好的體外抗菌活性。原因可能是 VBGNP 對于細胞壁前體末端可以無特異性地結(jié)合，從而導致 VRSA 的細胞壁合成受阻進而細胞裂解。透射電子顯微鏡照片明顯看出 VBGNP 可以輕易穿過大腸桿菌細胞內(nèi)膜和外膜，破壞脂多糖層的穩(wěn)定性，而后 VBGNP 上的萬古霉素部分就與相應的位點結(jié)合導致細胞裂解。

Chakraborty 等[14]將萬古霉素裝載到羧甲基殼聚糖-2, 2'-(乙烯基二氧)二乙胺-葉酸顆粒上制備成具有萬古霉素偶聯(lián)的納米顆粒（nanoconjugated vancomycin，NV）。實驗中測定了 NV 的萬古霉素溶出率最高可在 8 h 時達到 95.24%。實驗中 NV 比萬古霉素顯示出對 VRSA 更為強大的抗菌活性，實驗結(jié)果顯示，NV 和萬古霉素對 VSSA 的 MIC 值分別為 1 和 2 μg/ml，對 VRSA 的 MIC 值分別為 2 和 64 μg/ml；NV 和萬古霉素對 VSSA 的 MBC 值分別為 1 和 4 μg/ml；對 VRSA 的 MBC 值分別為 2 和 512 μg/ml。此外，在 NV 給藥組中，VRSA 的細胞膜懸液的光密度值顯著低于對照組和萬古霉素給藥組，提示 NV 使得 VRSA 的細胞膜厚度降低。在存活率方面，NV 給藥組中，VRSA 的存活率為 35.11%，顯著低于萬古霉素組的 95.73%。原子力顯微鏡（AFM）圖像顯示，NV 能明顯使 VRSA 的形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)破壞，在 NV 給藥組中，VRSA 的細胞壁能明顯看見被破壞，進而細胞裂解造成細菌死亡。透射電子顯微鏡圖像顯示，在 NV 給藥組中，VRSA 細胞壁厚度為（24.34 ± 4.34）nm，明顯小于萬古霉素組的（54.92 ± 5.12）nm。此外，NV 能明顯增加 VRSA 的 Na-K-ATP 酶的活性，Na-K-ATP 酶的活性增強使 K+的釋放增加并促進胞內(nèi)在 260 nm 處有吸收的物質(zhì)分解從而使細胞裂解增強。

4 總結(jié)與展望

多年來，抗生素被用于抑制和殺死細菌和其他微生物，但是目前微生物的耐藥性已經(jīng)十分普遍，從而降低了這些抗菌藥物的有效性。萬古霉素本是作為在其他抗生素無效時使用的最后一道防線藥物，卻早已在20 世紀80 年代就出現(xiàn)了耐藥菌株。因此，研究萬古霉素耐藥性產(chǎn)生的原因并解決耐藥性問題顯得十分必要。目前，關(guān)于萬古霉素耐藥基因的研究進展十分迅速，其中如何加強萬古霉素的抗菌活性是研究人員關(guān)注的焦點之一。納米技術(shù)以其自身獨特的性質(zhì)在提高抗菌活性方面有著十分廣泛的用途，目前研究較多的納米技術(shù)包括釋放 NO 的納米顆粒、殼聚糖納米顆粒以及金屬納米顆粒[3]等。這些研究將為納米技術(shù)及材料應用在臨床上以提升萬古霉素抗菌活性打下堅實基礎(chǔ)。

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顧覺奮，Email：yqyan1@126.com

2014-02-08

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.009