人谷草轉(zhuǎn)氨酶的基因改造及高效重組表達(dá)

王玉梅，徐超，劉艷，高尚先

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人谷草轉(zhuǎn)氨酶的基因改造及高效重組表達(dá)

王玉梅，徐超，劉艷，高尚先

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑室/衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

構(gòu)建人谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）高效重組表達(dá)體系。

優(yōu)化編碼人 AST 的核苷酸密碼子，合成人 AST 新的基因，并將其克隆至 pRSF-Duet 表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，以異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，并通過改變誘導(dǎo)劑濃度、振搖速度及誘導(dǎo)溫度優(yōu)化表達(dá)條件，以產(chǎn)生可溶性蛋白。可溶性蛋白經(jīng)鎳離子柱親和層析及分子篩層析純化，以SDS-PAGE 電泳及蛋白質(zhì)免疫鑒定蛋白的性質(zhì)，對重組蛋白的活性及在血清基質(zhì)中的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

經(jīng)過優(yōu)化的 AST 密碼子在大腸桿菌中的使用頻率均在 10% 以上；重組蛋白存在于上清和沉淀中，經(jīng)表達(dá)優(yōu)化，在 IPTG 終濃度為 2 mmol/L、25 ℃、150 r/min 振搖8 h 誘導(dǎo)條件下，可增加可溶性蛋白的產(chǎn)率，純化后的目的蛋白經(jīng)電泳及免疫印跡鑒定為谷草轉(zhuǎn)氨酶，活性可達(dá)136 000 U/L，且在含有蛋白酶抑制劑的血清中穩(wěn)定存在。

通過密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建了重組 AST 的高效表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白可以達(dá)到作為參考物質(zhì)原料的要求。

谷草轉(zhuǎn)氨酶； 重組表達(dá)； 基因改造； 密碼子； 參考物質(zhì)

人谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）廣泛分布于人體各組織中，其與谷丙轉(zhuǎn)氨酶是臨床酶學(xué)測定項目中測定量最大、應(yīng)用最廣泛的兩種重要血清酶[1]。AST 不僅存在于肝臟，也存在于心臟、骨骼肌、腎臟等組織，因此，可用于輔助診斷心肌梗死、骨骼肌疾病、急性腎炎、代謝性疾病等[2-3]；近年來，AST 對于冠脈搭橋等植入體的療效評價的意義也逐漸受到重視[4-5]，AST 測定值的準(zhǔn)確性直接影響到對疾病的診斷，因而質(zhì)控與評價 AST 測定試劑的質(zhì)控品、校準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品等參考物質(zhì)變得尤為重要。我國目前轉(zhuǎn)氨酶相關(guān)的參考物質(zhì)主要是篩選不同轉(zhuǎn)氨酶活性的人血清來制備，一方面存在安全隱患，另一方面受到原料來源的限制。本研究探索一種高效重組表達(dá)體系，為 AST 相關(guān)參考物質(zhì)的生產(chǎn)提供高質(zhì)量的原料來源。

1 材料與方法

1.1 主要材料

質(zhì)粒表達(dá)載體 pRSF-Duet、大腸桿菌菌株 BL21為本科室保存；限制性內(nèi)切酶H I、RI和質(zhì)粒提取試劑盒購自工程（）；Halt 蛋白酶抑制劑混合物購自美國賽默飛世爾科技公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒購自北京利德曼生化股份公司；鎳親和層析柱購自上海生工生物工程股份有限公司；兔抗人 AST 抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、NGC 色譜層析系統(tǒng)為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；ABI 9700 PCR 儀為美國ABI 公司產(chǎn)品；柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng) 4000R 為美國Carestream 公司產(chǎn)品；全自動生化分析儀為日本 HITACHI 日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 密碼子優(yōu)化與新基因合成 從 NCBI 網(wǎng)站上檢索人 AST 的氨基酸序列和基因序列。將檢索的基因序列通過 JCat（Java Codon Adaptation Tool）軟件進(jìn)行大腸桿菌偏愛密碼子使用頻率分析[6]，并根據(jù)大腸桿菌的偏愛密碼子表進(jìn)行優(yōu)化，將在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中使用頻率小于 10% 的密碼子用同義密碼子替換，在保持 AST 氨基酸序列不變的前提下，組成新的基因序列；將完成優(yōu)化的基因序列兩端增加HI和RI位點(diǎn)，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，并連接至復(fù)制型質(zhì)粒 pUC-57 上，經(jīng)測序驗(yàn)證后備亞克隆使用。

1.2.2 表達(dá)菌株的構(gòu)建與鑒定 通過HI和RI雙酶切的方法將合成的基因從復(fù)制型載體上切下，回收目的片段，連接入經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體 pRSF-Duet 中，構(gòu)建出表達(dá)載體 pRSF-Duet-，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21 中，通過卡那霉素（Kna）抗性初步篩選后，挑選大小適中的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，以HI和RI雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳判斷插入片段的大小。

為進(jìn)一步確認(rèn)目的基因序列閱讀框的正確性，將經(jīng)初步酶切驗(yàn)證的工程菌提取質(zhì)粒，送Invitrogen 公司在 PE-ABI377 DNA 分析儀上進(jìn)行序列分析，DNA 序列分析軟件為DNAstar，測序結(jié)果與質(zhì)粒圖譜進(jìn)行比對后，擴(kuò)增并保存陽性工程菌。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與條件優(yōu)化 將經(jīng)鑒定的工程菌接種至含有 Kna 抗性的 LB 培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 250 r/min，溫度為 37 ℃。當(dāng)菌液吸光度值550為 0.5 左右時，加入終濃度為 2 mmol/L的 IPTG 誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，條件調(diào)整為 150 r/min，25 ℃培養(yǎng)過夜。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的工程菌，菌體經(jīng)超聲破碎、13 000 ×離心后，取沉淀與上清分別經(jīng) SDS-PAGE 電泳，初步鑒定表達(dá)蛋白的大小及溶解性。

為增加可溶性蛋白的得率，通過改變 IPTG 濃度（0.01 ~ 2 mmol/L）、振蕩器轉(zhuǎn)速（100 ~ 250 r/min）以及誘導(dǎo)溫度（15 ~ 40 ℃），將重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)一步優(yōu)化。

1.2.4 重組蛋白的純化及鑒定 將帶 6 個 His 標(biāo)簽的可溶性蛋白經(jīng)鎳離子親和層析，分 5 次洗脫收集至一個干凈的離心管中。為去除親和層析帶入的高濃度咪唑及一些和鎳珠結(jié)合的其他蛋白，洗脫產(chǎn)物再經(jīng)葡聚糖分子篩層析系統(tǒng)純化，以信號采集器指示流出液的層析曲線，分別合并層析圖譜中相同峰的洗脫液。各峰樣品以兔抗人 AST 抗體為一抗、以 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 為二抗進(jìn)行 Western blot 法鑒定。

1.2.5 活性測定及在血清中的穩(wěn)定性 經(jīng)大小、性質(zhì)鑒定的純化蛋白用生理鹽水稀釋，在日立 7180 全自動生化分析儀上以谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒進(jìn)行測定。

純化的轉(zhuǎn)氨酶等濃度加入以下基質(zhì)：生理鹽水、基質(zhì)血清、含 1% 蛋白酶抑制劑的人基質(zhì)血清，使其靶值為 765 U/L，分別于 2 ~ 8 ℃、25 ℃放置 1 ~ 8 d，考察其在血清中的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果以 GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行無重復(fù)雙因素方差分析。

A B

Figure 1 Codon optimization of humangene

2 結(jié)果

2.1 人 AST 密碼子的優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化，獲得新的基因序列，該序列翻譯成的氨基酸序列與 GenBank 報道的完全一致。新的基因序列與人的基因序列比較，改變了密碼子在大腸桿菌中的使用頻率，尤其是使用頻率不足 1% 的密碼子。以精氨酸的密碼子為例，人類 AST 前 100 個氨基酸中有 18 個在大腸桿菌中使用頻率不足10%，其中包含 4 個精氨酸（R）密碼子（包括 AGA、CGG、CGA），而 AGA、CGG 的使用不足 1%（圖 1A），經(jīng)優(yōu)化改為 CGT 或 CGC 后，使用頻率可達(dá)到 50%；優(yōu)化后的基因中所有氨基酸密碼子使用頻率均在 10% 以上（圖 1B）。另外，軟件自動評估核酸整體分子結(jié)構(gòu)，對部分高使用頻率的密碼子也進(jìn)行了同義替換，如丙氨酸（A）的密碼子。上述密碼子的優(yōu)化奠定了 AST 在大腸桿菌中的高效表達(dá)的基礎(chǔ)。

2.2 陽性表達(dá)工程菌株的鑒定

擴(kuò)增經(jīng) Kna 抗性初步篩選的菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示基因的片段大小為 1308 bp，載體片段大小為 3849 bp，如圖 2所示，與預(yù)期大小一致，證實(shí)來自工程菌的質(zhì)粒插入了目的基因片段。

bpM 1 50003000 15001000750 500 AST

Figure 2 Restriction mapping of pRSF-Duet-

A：菌體裂解產(chǎn)物上清與沉淀的 SDS-PAGE 電泳（1：沉淀蛋白；2：上清蛋白）；B：分子篩層析洗脫峰；C：分子篩層析洗脫蛋白的 SDS-PAGE電泳（M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：b 樣品；3、4：a 樣品）；D：洗脫蛋白的 Western blot 結(jié)果（M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：b 樣品；3、4：a 樣品）

Figure 3 Purification and identification of the recombinant AST

將酶切驗(yàn)證的質(zhì)粒進(jìn)行測序并與構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，序列與合成的目的基因序列完全一致，說明谷草氨基轉(zhuǎn)移酶重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)、純化與鑒定

菌體裂解產(chǎn)物進(jìn)行的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白大部分為可溶性，但也存在一定量的不溶性蛋白（圖 3A）。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IPTG 濃度在 2 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速在 150 r/min 時能大量表達(dá)可溶性蛋白。

裂解上清蛋白經(jīng)鎳離子親和層析后，再經(jīng)分子篩層析系統(tǒng)，層析曲線顯示兩個完全不同的峰圖（圖 3B），根據(jù)這兩個峰收集的樣品電泳及 Western blot 雜交結(jié)果分析，其中，較高峰圖為目標(biāo)蛋白（箭頭所示），大小約 42 kD，與 AST 單體的預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖 3 所示。

2.4 轉(zhuǎn)氨酶的活性及血清中的穩(wěn)定性

純化的人 AST 蛋白樣品經(jīng)檢測，活性可達(dá) 136 000 U/L。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，重組 AST 在生理鹽水中 2 ~ 8 ℃和 25 ℃可穩(wěn)定保存 7 d，與初始測定值比較，相對偏差在 5% 以內(nèi)；在純基質(zhì)人血清中穩(wěn)定性較差，保存 2 d 的測定結(jié)果相對偏差達(dá) 10%（結(jié)果未顯示）；無重復(fù)雙因素方差分析結(jié)果顯示，在含蛋白酶抑制劑的基質(zhì)血清中，兩儲存溫度的穩(wěn)定性趨勢線不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 244.89，< 0.0001），以 2 ~ 8 ℃更穩(wěn)定；不同放置時間的測定值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 142.26，< 0.0001），隨放置時間延長，活性有降低趨勢，但均在允許相對偏差 5% 以內(nèi)，如圖 4 所示。

3 討論

谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶共同測定廣泛應(yīng)用于臨床診斷、治療監(jiān)測、藥理毒性研究、健康體檢及臨床用血等檢查中。AST 測定值的準(zhǔn)確性離不開各級參考物質(zhì)的校準(zhǔn)及質(zhì)控。目前，我國制備 AST 標(biāo)準(zhǔn)品等參考物質(zhì)的原料主要以人血清來源為主，這與《生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定規(guī)程》中關(guān)于“用于制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料應(yīng)有足夠的穩(wěn)定性和足夠的數(shù)量”相違背[7]。AST 原料的缺乏勢必造成標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)常處于供不應(yīng)求狀態(tài)，生產(chǎn)企業(yè)的校準(zhǔn)物、質(zhì)控物只能從國外供應(yīng)商購買，而這些物質(zhì)多以加磷酸吡哆醛的 IFCC 方法定值，與國內(nèi)不添加磷酸吡哆醛的試劑根本不相符合，這直接影響到試劑測定的準(zhǔn)確性，尤其是病理水平的測定。

圖中虛線為 5% 的相對偏差線，向下超過該線，則相對偏差超過 5%

Figure 4 The stability trend chart of the recombinant AST in serum matrix

長期以來，由于 DNA 合成的長度受技術(shù)水平的限制，該酶在原核生物的表達(dá)使用的是 AST 的 cDNA，而大腸桿菌在表達(dá)外源蛋白時為了降低負(fù)載對密碼子具有偏愛性[8]，正如人類 AST 精氨酸密碼子 CGG、AGG、AGA、CGA在大腸桿菌的使用頻率不足 1%，尤其 CGG、AGG 更屬于稀有密碼子[9]，影響了異源蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)量較低，這可能是該酶在大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)量不能滿足市場需求的原因。隨著技術(shù)的發(fā)展，大片段 DNA 合成為基因大規(guī)模改造提供了前提，需要借助生物信息學(xué)手段優(yōu)化真核生物的氨基酸在大腸桿菌中的編碼序列[10-11]。在此基礎(chǔ)上，本研究對基因進(jìn)行了密碼子改造，不僅涉及稀有密碼子，軟件在評估整體核酸分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，從更有利于翻譯角度對其他高使用頻率的密碼子也進(jìn)行了調(diào)整，進(jìn)而合成全新的基因，使所有氨基酸密碼子在大腸桿菌的使用頻率均大于 10%，該全新的基因保持了 AST 完整的氨基酸序列。另外，基因長達(dá) 1300 多個堿基對，如此大的基因序列在原核系統(tǒng)大量表達(dá)時，極易形成包涵體，影響蛋白活性，本研究通過對表達(dá)條件優(yōu)化以提高可溶性蛋白的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該優(yōu)化的基因能夠在大腸桿菌呈高效表達(dá)，且多為可溶性，單體形式保持了其轉(zhuǎn)氨酶活性。

生化測定的參考物質(zhì)需要考慮基質(zhì)的影響，因而，AST 原料在血清中的穩(wěn)定性關(guān)系到參考物質(zhì)的穩(wěn)定性，但血清中存在大量蛋白酶，將會加速血清酶的降解，尤其是沒經(jīng)過折疊、以單體存在的表達(dá)蛋白，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。筆者在前期的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備研究中曾篩選了許多原料，在基質(zhì)血清中不穩(wěn)定的現(xiàn)象大量存在，AST 國際標(biāo)準(zhǔn)品在復(fù)溶 4 h 后不穩(wěn)定[12]。為避免蛋白酶的降解，蛋白制劑在提取、加工過程中需要考慮蛋白酶抑制劑的使用[13]，本研究使用的 Halt 蛋白酶抑制劑為一種雞尾酒抑制劑混合物，能夠抑制大部分蛋白酶[14]，初步試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶抑制劑的添加對轉(zhuǎn)氨酶蛋白有良好的保護(hù)作用。

本研究制備的轉(zhuǎn)氨酶具備作為參考物質(zhì)制備的原料條件，為其他血清酶在大腸桿菌中的表達(dá)提供了新的思路，其長期穩(wěn)定性正在進(jìn)一步的考察中。

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Genetic modification andefficient recombinant expression of human aspartate aminotransferase

WANG Yu-mei, XU Chao, LIU Yan, GAO Shang-xian

To develop an efficient recombinant expression system of aspartate aminotransferase (AST), which builds the foundation for the preparation of feedstock of AST related reference materials.

A new humangene was synthesized by optimizing the codons of the nucleic acid sequence encoding human AST, and then cloned into pRSF-Duet expression vector. The recombinant plasmid pRSF-Duet-was transformed intoBL21 and the target protein expression was induced by isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG). The expression condition for soluble protein was optimized by changing the inducer concentration, shaking speed and induction temperature. The soluble protein was purified by nickel ion affinity chromatography and dextran molecular sieve chromatography, and identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. The activity and stability in serum matrix of recombinant proteins were detected.

The usage frequency inof optimized codons was more than 10% after codon optimization. The recombinant AST was present in the pellet and the supernatant. The expression level of soluble proteins was increased, after the cultures were induced by addition of 2 mmol/L IPTG at 25 ℃ with shaking speed of 150 r/min and most of target proteins were present in the supernatant.The purified protein was identified as AST with higher activity (136 000 U/L) using gelelectrophoresis and Western blot and stable in serum matrix containing protease inhibitors.

An efficient recombinant expression system of AST is developed successfully by codons optimization. The recombinant protein is obtained with the requirements of reference material feedstock.

Aspartate aminotransferase; Recombinant expression; Genetic modification; Codon; Reference material

GAO Shang-xian, Email:gaoshangxian@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.004

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)（2011AA02A115）

高尚先，Email：gaoshangxian@126.com

2014-07-08

Author Affiliation: Department of In Vitro Diagnostic Reagents, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China