豬乳鐵蛋白在4種重組乳桿菌中的表達(dá)及抑菌活性比較

于慧，姜艷平，崔文，武嘯，何佳，喬薪瑗，李一經(jīng)，唐麗杰,

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

近年來，隨著人們對(duì)食品安全問題關(guān)注度的提高，抗生素作為飼料添加劑的亂用問題也日益受到人們的重視。長期連續(xù)使用抗生素會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥性[1]以及畜牧產(chǎn)品中抗生素殘留[2]，尋找安全有效的抗生素替代品已經(jīng)成為畜牧業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。

乳鐵蛋白 (Lactoferrin, LF)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種天然的鐵結(jié)合糖蛋白，主要由中性粒細(xì)胞分泌，廣泛存在于動(dòng)物的乳汁 (初乳)、膽汁、唾液、胃液和小腸液等分泌液中[3-4]。乳鐵蛋白具有很多重要的生理功能，它不僅能抗微生物，為每天大量病原微生物入侵的黏膜系統(tǒng)提供了第一道也是非常重要的防線[5-7]，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抑制腫瘤生長等功能[8-9]。近年來，乳鐵蛋白被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、免疫調(diào)節(jié)劑和高效補(bǔ)鐵劑等方面[10]。乳鐵蛋白已經(jīng)在許多原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、酵母菌和干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得了表達(dá)[11-16]。

然而，傳統(tǒng)的從初乳中提取純化乳鐵蛋白存在著很多弊端，如原料來源有限、工藝繁瑣、耗資高，而大腸桿菌、酵母菌等基因工程的宿主菌或是動(dòng)物細(xì)胞，表達(dá)的外源蛋白大多需純化，而純化工藝復(fù)雜，這就成為乳鐵蛋白用于生產(chǎn)實(shí)踐的障礙。然而乳酸菌是食品級(jí)益生菌，由于其營養(yǎng)價(jià)值高、生長迅速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)成為表達(dá)外源蛋白、作為活載體疫苗的理想選擇[17-18]。另外乳酸菌對(duì)鐵的需求量低，不會(huì)被乳鐵蛋白抑制。

本研究優(yōu)化合成了豬乳鐵蛋白(Porcine lactoferrin, Plf)成熟肽編碼序列，并將其克隆到乳桿菌表達(dá)載體中，構(gòu)建了 4種表達(dá)豬乳鐵蛋白的重組乳桿菌，并對(duì) 4種重組乳桿菌表達(dá)產(chǎn)物的體外抑菌活性進(jìn)行了比較，為篩選最佳生物學(xué)活性的重組豬乳鐵蛋白以及其進(jìn)一步在生產(chǎn)中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

戊糖乳桿菌 Lactobacillus pentosus KLDS1.0413、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum KLDS1.0344；副干酪乳桿菌 Lactobacillus paracasei KLDS1.0652分離自乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌Escherichia coli JM109、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CVCC26003、鼠傷寒沙門氏菌 Salmonella typhimurium SL1344、李氏桿菌 Listeria CVCC0586、巴氏桿菌 Pasteurella multocida P1059均為致病菌，分離自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院菌種保藏室；干酪乳桿菌 Lactobacillus casei ATCC393、乳酸菌穿梭表達(dá)分泌型載體質(zhì)粒pPG612.1由荷蘭Jos Seegers博士惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基、工具酶和主要試劑

標(biāo)準(zhǔn) LB培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1.0 mL，蒸餾水900 mL。調(diào)pH 至6.4，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加瓊脂15.0 g。

兔抗 Plf兔血清 (實(shí)驗(yàn)室自制)[19]，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、ExTaq酶、DL 8 000 DNA marker均購自TaKaRa公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒與小量DNA膠回收試劑盒購自中科瑞泰生物有限公司；溶菌酶、氯霉素購自Sigma公司。

1.3 基因優(yōu)化合成與引物

根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的豬乳鐵蛋白氨基酸序列 (登錄號(hào)L77887)，分析其同源序列和保守區(qū)域，結(jié)合運(yùn)用 ExPASY網(wǎng)站進(jìn)行分析，根據(jù)乳桿菌的密碼子偏嗜性[20]，將序列中的稀有密碼子改為乳桿菌優(yōu)勢密碼子，由生工生物工程 (上海)有限公司優(yōu)化合成 2 016 bp的豬乳鐵蛋白基因序列 (GenBank Accession No.KJ003838)。

根據(jù)優(yōu)化合成的基因序列，用Primer軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由北京博仕生物技術(shù)有限公司合 成 ， 引 物 序 列 為 ： 上 游 引 物 (5′–3′)：GGATCCTCCTAAGAAGGGGGTTC；下游引物(5′–3′)：CTCGAGCTATTACGTGGCGATAG。

1.4 表達(dá)豬乳鐵蛋白重組乳桿菌的構(gòu)建和鑒定

1.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

pPG612.1質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切反應(yīng)體系37 ℃水浴2 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收3 290 bp的片段，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的線性化 pPG612.1與Plf成熟肽編碼序列進(jìn)行連接，體系于連接儀中16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，在10 μg/mL的LB氯霉素選擇性培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，用小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，通過單、雙酶切和 PCR方法鑒定，并將提出的陽性克隆命名為pPG612.1-plf (圖1)。

1.4.2 重組乳桿菌的構(gòu)建和鑒定

干酪乳桿菌 ATCC393、戊糖乳桿菌KLDS1.0413、植物乳桿菌 KLDS1.0344和副干酪乳桿KLDS1.0652分別制備感受態(tài)細(xì)胞[21]。

電轉(zhuǎn)化(根據(jù)美國BTX公司Transformation Apparatus BTX EC399 使用說明書進(jìn)行)：將鑒定正確的 pPG612.1-plf質(zhì)粒分別與 4種乳桿菌的感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5 min；將混合物轉(zhuǎn)入無菌預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中；選擇2 200 V電壓，立刻電擊；之后迅速加入1 mL冰預(yù)冷的含有20%蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基；37 ℃靜置培養(yǎng)2 h；取100 μL菌液涂布于含有10 μg/mL氯霉素的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)36 h。

挑取單個(gè)菌落，接種于含10 μg/mL氯霉素的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，用小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒pPG612.1-plf進(jìn)行單、雙酶切鑒定和PCR鑒定。鑒定正確后保存重組菌菌種。

圖1 pPG612.1-plf質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The schematic structure of pPG612.1-plf.

1.5 重組乳桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

1.5.1 重組乳桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

分別取 4種鑒定正確的重組乳桿菌菌種在10 μg/mL的氯霉素抗性的 MRS平板上劃線活化培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL含10 μg/mL氯霉素抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置、厭氧培養(yǎng)16 h。取培養(yǎng)菌液按1∶100比例接種于氯霉素抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)液OD600值大于1，將菌液在無菌條件下離心，收集菌體沉淀，用MRS (不含葡萄糖)液體培養(yǎng)基懸起，并加入適量的誘導(dǎo)劑木糖，37 ℃誘導(dǎo)24 h。以轉(zhuǎn)化pPG612.1質(zhì)粒的重組乳桿菌作為對(duì)照，同時(shí)用同樣的方法誘導(dǎo)。

1.5.2 重組乳桿菌表達(dá)產(chǎn)物的 Western blotting鑒定

方法如下[22]：三氯乙酸(TCA)沉淀法濃縮處理樣品。

配制12% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量為20 μL，上樣時(shí)保證每孔蛋白總量一樣，初始電壓為80 V，待指示劑進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓提高至120 V，至電泳結(jié)束。

SDS-PAGE 結(jié)束后，切下用于Western blotting檢測的凝膠，50 A恒流轉(zhuǎn)印55 min，結(jié)束后，將NC膜浸入20 mL 5%脫脂乳的PBS封閉液中室溫?fù)u動(dòng)封閉2 h，用PBST洗膜3次；接著將NC膜放入用上述封閉液 1∶200稀釋的一抗 (兔抗 Plf血清)溶液中，37 ℃作用1.5 h，用PBST洗膜3次；再將NC膜轉(zhuǎn)入用上述封閉液1∶2 000倍稀釋的酶標(biāo)二抗 (HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)溶液中，37 ℃作用2 h，取出NC膜，用PBST洗膜3次，洗去二抗后ECL顯色，曝光2 min，顯影30 s，定影2 min。

1.5.3 激光共聚焦檢測重組菌菌體表達(dá)蛋白

分別取0.5 mL誘導(dǎo)后的重組菌，5 000 r/min離心3 min；菌體沉淀用PBS緩沖液洗3次，加入5 mL PBS 1∶100 稀釋的兔抗Plf血清作為一抗，37 ℃孵育1 h；5 000 r/min離心3 min，棄上清，用無菌PBS洗3次，加入5 mL PBS 1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃孵育1 h；5 000 r/min離心3 min，棄上清，用無菌PBS洗3次；在避光條件下：用500 μL PBS 1∶1 000稀釋的DAPI染料充分懸起細(xì)菌，室溫避光作用15 min；5 000 r/min離心3 min，棄上清，用無菌PBS洗5次；菌體用200 μL PBS懸起，取10 μL涂片，待其干燥，用共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 ELISA方法比較4種重組乳桿菌豬乳鐵蛋白表達(dá)量

采用間接ELISA方法檢測表達(dá)上清中的目的蛋白，分別設(shè)帶有pPG612.1空載體的重組乳桿菌上清液作為陰性抗原對(duì)照，未免疫重組豬乳鐵蛋白的兔血清作為陰性抗體對(duì)照，以不同倍比稀釋的Plf標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性抗原對(duì)照。

以4種重組乳桿菌在同樣誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá)上清為抗原，包被96孔ELISA反應(yīng)板，每孔加入300 μL上清液，4 ℃包被過夜。用PBST洗板3次；每孔加300 μL含5%脫脂乳的PBS封閉液，37 ℃封閉2 h，用PBST洗板3次；分別用PBS緩沖液1∶200稀釋的兔抗Plf血清作為一抗，每孔100 μL，孵育1 h，用PBST洗板3次；接著每孔加入100 μL封閉液1∶3 000稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板3次；再每孔加100 μL OPD-H2O2顯色液，37 ℃避光顯色15 min，然后加入50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)，終止反應(yīng)；最后測定OD值：酶標(biāo)儀于490 nm處檢測每孔吸光度 (OD490值)。根據(jù)陽性對(duì)照的OD值和濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出4種重組菌上清中重組豬乳鐵蛋白的表達(dá)量。

1.7 重組乳桿菌表達(dá)產(chǎn)物體外抑菌活性比較

無菌條件下取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、李氏桿菌和巴氏桿菌菌種劃線于固體瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，連續(xù)傳代2次，取活化后的不同菌種接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。鼠傷寒沙門氏菌、李氏桿菌、巴氏桿菌接種于LB培養(yǎng)基中 (加入5%的血清)，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。取 OD600約為 1的各種細(xì)菌200 μL，涂于瓊脂平板，待菌液稍干后，在每個(gè)平板中打兩個(gè)孔，其中一個(gè)加入 200 μL轉(zhuǎn)入pPG612.1-plf質(zhì)粒的重組乳桿菌誘導(dǎo)后的濃縮200倍的菌液上清，另一個(gè)加入等量的轉(zhuǎn)入pPG612.1空載體的重組乳桿菌誘導(dǎo)后濃縮 200倍菌液上清作為對(duì)照，每種菌做3個(gè)重復(fù)，加入的重組菌上清均調(diào)pH為7，且經(jīng)過濾除菌處理。

將瓊脂平板放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)，細(xì)菌長滿平板后測量清晰的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 重組乳桿菌的構(gòu)建和重組豬乳鐵蛋白的Western blotting鑒定

將重組質(zhì)粒 pPG612.1-plf轉(zhuǎn)化 4種乳桿菌后，構(gòu)建了4種重組乳桿菌。4種重組菌的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析均獲得與預(yù)期片段大小一致的結(jié)果，證實(shí)已獲得轉(zhuǎn)化了plf基因的4種重組乳酸菌，分別命名為pPG612.1-plf/L. casei、pPG612.1-plf/L. pentosus、pPG612.1-plf/L. plantarum 和pPG612.1-plf/L. paracasei。

4種重組乳桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行Western blotting分析，在73 kDa位置均出現(xiàn)了特異的反應(yīng)帶，說明目的蛋白在 4種重組乳酸菌誘導(dǎo)后的上清和菌體中均得到了表達(dá) (圖2)。

2.2 激光共聚焦檢驗(yàn)重組菌表達(dá)

用激光共聚焦顯微鏡檢驗(yàn)4種重組乳酸菌表達(dá)。從 pPG612.1-plf/L. casei、pPG612.1-plf/L. pentosus、pPG612.1-plf/L. plantarum、pPG612.1-plf/L. paracasei四種重組菌均觀察到較強(qiáng)綠色熒光，表明重組豬乳鐵蛋白在4種重組乳桿菌的菌體表面亦獲得表達(dá) (圖3)。

圖2 四種重組乳桿菌的Western blotting鑒定結(jié)果Fig. 2 Western blotting identification of four species of recombinant Lactobacillus. (A)Recombinant Lactobacillus casei.(B)Recombinant Lactobacillus pentosus. (C)Recombinant Lactobacillus plantarum. (D)Recombinant Lactobacillus paracasei. 1: induced total cell protein of pPG612.1/Lactobacillus; 2: induced total cell protein of pPG612.1-plf/Lactobacillus; 3: induced supernatant of pPG612.1/Lactobacillus; 4: induced supernatant of pPG612.1-plf/Lactobacillus.

圖3 激光共聚焦檢驗(yàn)重組菌目標(biāo)蛋白的表達(dá)Fig. 3 Confocal immunofluorescent analysis of the expression of porcine lactoferrin in recombinant lactobacillus. The target protein showed green fluorescence. (A)pPG612.1-plf/L. casei. (B)pPG612.1-plf/L. pentosus. (C)pPG612.1-plf/L. plantarum.(D)pPG612.1-plf/ L. paracasei. 1: dark field examination results of recombinant Lactobacillus; 2: bright field examination results of recombinant Lactobacillus; 3: bright field examination results of recombinant Lactobacillus without filter.

2.3 四種重組乳桿菌豬乳鐵蛋白表達(dá)量的比較

根據(jù)陽性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出 4種重組菌上清中重組豬乳鐵蛋白的表達(dá)量。結(jié)果可見，4種重組乳桿菌Plf表達(dá)量分別為 9.6 μg/mL、10.8 μg/mL、12.5 μg/mL 和 9.9 μg/mL；轉(zhuǎn)化pPG612.1空載體的4種重組菌未檢測到Plf表達(dá)。4種重組菌中重組植物乳桿菌Plf表達(dá)量高于其他3種，且差異顯著(P<0.05)，另外3種重組菌表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

2.4 重組菌表達(dá)產(chǎn)物體外抑菌活性比較

抑菌試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化plf的4種重組菌表達(dá)的豬乳鐵蛋白均對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑相對(duì)較大，而對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、巴氏桿菌、李氏桿菌也均有抑制作用，但是抑菌圈相對(duì)較小，以鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈最??；并且，4種重組乳桿菌表達(dá)產(chǎn)物抑菌效果以重組植物乳桿菌最好，重組戊糖乳桿菌、重組干酪乳桿菌和重組副干酪乳桿菌相對(duì)較弱。轉(zhuǎn)化pPG612.1空載體的4種重組菌抑菌圈的測量結(jié)果與打孔器直徑一致，沒有抑菌圈產(chǎn)生，即沒有抑菌效果 (表1)。

圖4 間接ELISA檢測重組乳桿菌誘導(dǎo)后上清液中重組蛋白的表達(dá)Fig. 4 Measurement of expression of porcine lactoferrin in induced supernatant of recombinant Lactobacillus by indirect ELISA.

表1 重組乳桿菌對(duì)病原菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity assay of the recombinant Lactobacillus

3 討論

乳桿菌種類繁多，而不同乳桿菌分子結(jié)構(gòu)、生理生化特性以及生態(tài)各不相同，本研究選擇了干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌以及副干酪乳桿菌作為受體菌。已經(jīng)有研究表明，戊糖乳桿菌本身作為活菌制劑，可促進(jìn)有益菌定植于動(dòng)物的腸道，并抑制有害菌群的生長繁殖，對(duì)防治仔豬腹瀉有一定的效果[23]，植物乳桿菌具有改善腸道功能的作用，適口性好，已經(jīng)被用作豬飼料的益生素添加劑[24]，副干酪乳桿菌作為活菌制劑飼喂仔豬可顯著降低剛斷奶幼豬體內(nèi)梭菌屬和腸桿菌的數(shù)量[25]。

由于乳酸菌本身的特性，導(dǎo)致表達(dá)外源基因量小，不容易檢測到，所以本研究根據(jù)乳桿菌密碼子偏嗜性，在保證氨基酸不變的情況下，優(yōu)化了plf基因，提高了蛋白表達(dá)量，成功地通過 Western blotting和激光共聚焦驗(yàn)證了表達(dá)，并用ELISA方法得到了4種菌重組蛋白的表達(dá)量，其中重組植物乳桿菌的表達(dá)量最大，可達(dá)到12.5 μg/mL，其他3種重組乳桿菌的表達(dá)量略低，且相互間差異不顯著，這可能由于本研究所用載體為誘導(dǎo)表達(dá)型，各重組菌對(duì)誘導(dǎo)物代謝利用程度的不同，而表現(xiàn)出表達(dá)量的差異。

本研究采用傳統(tǒng)簡便、快捷的抑菌圈法檢測了重組菌表達(dá)產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、李氏桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、巴氏桿菌這5種比較常見的致病菌的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)的重組豬乳鐵蛋白對(duì)上述細(xì)菌的生長都表現(xiàn)出了一定的抑制作用。對(duì)于乳鐵蛋白的抑菌機(jī)制，一種解釋是乳鐵蛋白可以與病原微生物競爭性結(jié)合鐵離子，造成病原微生物缺乏生存所必需的鐵離子；另一種解釋是帶正電荷的乳鐵蛋白與細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂和脂多糖具有很強(qiáng)的親和性，與細(xì)胞膜結(jié)合，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，促使細(xì)胞內(nèi)容物的大量流失外泄進(jìn)而殺死細(xì)菌[26]。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制程度最為明顯，其抑菌圈明顯大于其他細(xì)菌，而對(duì)同樣作為革蘭氏陽性菌的李氏桿菌的抑菌效果與其他幾種細(xì)菌無明顯差別，這可能與細(xì)菌的細(xì)胞膜構(gòu)成差異有關(guān)。另外，重組植物乳桿菌對(duì)5種致病菌的抑菌圈均大于其他重組菌，即其抑菌效果好于其他3種重組乳桿菌，這可能是因?yàn)橹亟M植物乳桿菌的乳鐵蛋白表達(dá)量高于其他重組菌，也可能跟不同的乳桿菌本身的代謝產(chǎn)物有關(guān)。研究結(jié)果表明4種乳桿菌中，植物乳桿菌更適宜用于重組豬乳鐵蛋白的表達(dá)，本研究為進(jìn)一步探索乳桿菌系統(tǒng)表達(dá)重組豬乳鐵蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Monroe S, Polk R. Antimicrobial use and bacterial resistance. Curr Opin Microbiol, 2000, 3(5):496–501.

[2]Schwarz S, Kehrenberg C, Walsh TR. Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and food animal production. Int J Antimicrob Agents,2001, 17(6): 431–437.

[3]Sargent PJ, Farnaud S, Evans RW.Structure/function overview of proteins involved in iron storage and transport. Curr Med Chem,2005, 12(23): 2683–2693.

[4]Jacobsen LC, Sorensen OE, Cowland JB, et al.The secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)and the secondary granule protein lactoferrin are synthesized in myelocytes, colocalize in subcellular fractions of neutrophils, and are coreleased by activated neutrophils. J Leukoc Biol, 2008, 83(5): 1155–1164.

[5]Jenssen H, Hancock REW. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie, 2009, 91(1): 19–29.

[6]Van der Strate BWA, Beljaars L, Molema G, et al.Antiviral activities of lactoferrin. Antiviral Res,2001, 52(3): 225–239.

[7]Beaumont SL, Maggs DJ, Clarke HE. Effects of bovine lactoferrin on in vitro replication of feline herpesvirus. Vet Ophthalmol, 2003, 6(3): 245–250.

[8]Tanaka T, Nakatani S, Xuan X, et al. Antiviral activity of lactoferrin against canine herpesvirus.Antiviral Res, 2003, 60(3): 193–199.

[9]Conneely OM. Antiinflammatory activities of lactoferrin. J Am Coll Nutr, 2001, 20(sup5):389S–395S.

[10]Wakabayashi H, Yamauchi K, Takase M.Lactoferrin research, technology and applications.Int Dairy J, 2006, 16(11): 1241–1251.

[11]Wang J, Tian Z, Teng D, et al. Cloning,expression and characterization of Kunming mice lactoferrin and its N-lobe. Biometals, 2010, 23(3):523–530.

[12]Wang SR, Lin TY, Chen CM, et al. Isolation and expression of a porcine lactoferrin gene. Am J Vet Res, 1997, 58(10): 1152.

[13]Wang SH, Yang TS, Lin SM, et al. Expression,characterization, and purification of recombinant porcine Lactoferrin in Pichia pastoris. Protein Expres Purif, 2002, 25(1): 41–49.

[14]Chen HL, Lai YW, Chen CS, et al. Probiotic Lactobacillus casei expressing human lactoferrin elevates antibacterial activity in the gastrointestinal tract. Biometals, 2010, 23(3): 543–554.

[15]Ha Z, Zhao LL, Yu XX, et al. High-level expression and antimicrobial activity of recombinant N-terminal porcine lactoferrin. Chin J Biotech, 2010, 26(4): 523–529 (in Chinese).哈卓, 趙麗麗, 于曉旭, 等. 重組豬乳鐵蛋白 N端的高效表達(dá)及抑菌活性檢測. 生物工程學(xué)報(bào),2010, 26(4): 523–529.

[16]Tang LJ, Xing JM, Li J, et al. Consecutive expression of porcine lactoferricin gene in Pichia pastorsis and detection of its antimicrobial activity. J Northeast Agric Univ, 2012, 43(6): 1–5 (in Chinese).唐麗杰, 邢婧珉, 李杰, 等. 豬乳鐵蛋白肽LFcinP基因在巴斯德畢赤酵母中組成型表達(dá)及其抑菌活性檢測. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,43(6): 1–5.

[17]Charng YC, Lin CC, Hsu CH. Inhibition of allergen-induced airway inflammation and hyperreactivity by recombinant lactic-acid bacteria. Vaccine, 2006, 24(33): 5931–5936.

[18]Hou XL, Yu LY, Liu J, et al. Surface-displayed porcine epidemic diarrhea viral (PEDV)antigens on lactic acid bacteria. Vaccine, 2007, 26(1): 24–31.

[19]Huang WW. Construction of recombinant Lactococcus lactis expression PLF and detection biological function [D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2013 (in Chinese).黃薇薇. 表達(dá)豬乳鐵蛋白重組乳酸乳球菌的構(gòu)建及生物學(xué)活性檢測[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[20]Pouwels PH, Leunissen JAM. Divergence in codon usage of Lactobacillus species. Nuleic Acids Res, 1994, 22(6): 929–936.

[21]Kook MC, Seo MJ, Cheigh CI, et al. Enhancement of γ-amminobutyric acid production by Lactobacillus sakei B2-16 expressing glutamate decarboxylase from Lactobacillus plantarum ATCC 14917. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2010, 53(6): 816–820.

[22]Zhao LL, Liu M, Ge JW, et al. Expression of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)VP2-VP3 fusion protein in Lactobacillus casei and immunogenicity in rainbow trouts. Vaccine,2012, 30(10): 1823–1829.

[23]Zhang LF, Wang ZW. Study on effect of lactobacillus product in preventing and curing piglets diarrhea. J Clin Microbiol, 2008, 20(12):568–569 (in Chinese).張麗芳, 王占武. 戊糖乳桿菌制劑防治仔豬腹瀉效果初探. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 20(12):568–569.

[24]De Angelis M, Siragusa S, Caputo L, et al. Survival and persistence of Lactobacillus plantarum 4.1 and Lactobacillus reuteri 3S7 in the gastrointestinal tract of pigs. Vet Microbiol, 2007, 123(1): 133–144.

[25]Nemcova R, Bomba A, Gancarcikova S, et al.Study of the effect of Lactobacillus paracasei and fructooligosaccharides on the faecal microflora in weanling piglets. Berl Munch Tierarztl, 1998,112(6/7): 225–228.

[26]Ochoa TJ, Cleary TG. Effect of lactoferrin on enteric pathogens. Biochimie, 2009, 91(1): 30–34.