以異養(yǎng)細胞作為種子的橢圓小球藻產(chǎn)油脂光自養(yǎng)培養(yǎng)優(yōu)化

王軍，李元廣，王偉良，黃建科，沈國敏，李淑蘭，潘榮華

1 華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

2 上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司，上海 200237

3 嘉興澤元生物制品有限責任公司，浙江 嘉興 314000

小球藻生長速度快、胞內(nèi)油脂含量高，并且油脂組分中主要是C16-C18碳鏈的脂肪酸甘油酯，是生產(chǎn)生物燃料的理想原料[1]。目前，如何高效地獲得高含油脂的藻細胞是一個亟待解決的關(guān)鍵問題。

小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)種子擴培時間非常長[2]，擴培過程中易受雜藻和原生動物污染及天氣的影響[3]。為了克服上述弊端，近年來有學者以異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞作為光自養(yǎng)培養(yǎng)種子，即異養(yǎng)細胞種子/光自養(yǎng)培養(yǎng)小球藻。Han等[4]用該方法對3種小球藻(蛋白核小球藻、普通小球藻和橢圓小球藻)進行研究，在種子階段，異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞密度是光自養(yǎng)培養(yǎng)的14.33–16.15倍；在光自養(yǎng)階段，采用異養(yǎng)細胞作為種子進行光自養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞密度、油脂產(chǎn)率分別是采用光自養(yǎng)細胞作為種子的1.49–1.81倍和1.42–1.66倍。Zheng等[5]同樣采用該方法培養(yǎng)嗜熱小球藻Chlorella sorokiniana，結(jié)果表明采用異養(yǎng)細胞和光自養(yǎng)細胞作為種子進行光自養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞具有相似的藻細胞密度和油脂含量。上述結(jié)果表明，以異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞作為光自養(yǎng)培養(yǎng)的種子來進行光自養(yǎng)培養(yǎng)的方法具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

小球藻屬中有很多可以產(chǎn)油脂的種，而關(guān)于橢圓小球藻產(chǎn)油脂的研究較少。Yang等[6]利用市內(nèi)二次處理的污水光自養(yǎng)培養(yǎng)橢圓小球藻，油脂含量達到43%，但藻細胞密度只有425 mg/L，油脂產(chǎn)率僅為0.53 mg/(L·h)，培養(yǎng)效率低。

為了進一步探索橢圓小球藻利用異養(yǎng)細胞種子/光自養(yǎng)培養(yǎng)模式產(chǎn)油脂的潛力，本文對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)及光自養(yǎng)培養(yǎng)工藝分別進行了優(yōu)化研究。本文的研究結(jié)果可為以橢圓小球藻作為藻種的能源微藻高效培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種

橢圓小球藻Chlorella ellipsoidea，購自中國科學院武漢水生生物研究所，筆者所在實驗室自行純化。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.2.1 異養(yǎng)培養(yǎng)

橢圓小球藻在500 mL三角瓶中恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。以Endo培養(yǎng)基[7]為初始培養(yǎng)基，采用單因子分析法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

1.2.2 光自養(yǎng)培養(yǎng)

光自養(yǎng)培養(yǎng)在2 L柱式光生物反應(yīng)器中進行，藻種為500 mL搖瓶異養(yǎng)藻細胞，離心去除上清液。初始藻細胞密度0.2 g/L左右，裝液量2 L，培養(yǎng)液先用次氯酸鈉消毒，然后用硫代硫酸鈉中和，通氣量1 L/min，CO2占氣體流量2% (V/V)，連續(xù)光照，光生物反應(yīng)器外壁面光強為10 000 lux，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

1.3 分析方法

1.3.1 藻細胞密度的測定

藻細胞密度測定采用干重法，見文獻[8]。

1.3.2 油脂和脂肪酸含量的測定

油脂和脂肪酸含量的測定分別采用有機溶劑提取法和高效液相色譜液-質(zhì)譜連用法，見文獻[9]和文獻[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源種類及濃度對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響

2.1.1 不同氮源種類對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)影響

在保持初始葡萄糖濃度及C/N比相同的條件下，橢圓小球藻對不同氮源的利用差別較大。表1說明橢圓小球藻對KNO3的利用效率最高，最高細胞密度可達10.27 g/L，細胞生長速率可達0.122 g/(L·h)，且葡萄糖基本消耗完。橢圓小球藻對(NH4)2SO4的利用效果非常差，最高藻細胞密度僅有3.06 g/L，細胞生長速率只有0.032 g/(L·h)，且有大量的葡糖糖殘留。

2.1.2 不同C/N比對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響

在碳濃度保持不變的前提下，改變C/N比。隨著C/N比的增加，橢圓小球藻的生長速率逐漸增大，其中C/N比為10.84和15.84時兩者生長速率基本一致，當C/N比達到20.84的時候生長速率比初始培養(yǎng)基(C/N比為5.84)的生長速率提高23.14%，且培養(yǎng)時間明顯縮短 (表2)。

2.1.3 異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化前后的對比

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，橢圓小球藻的生長速率明顯高于其在初始培養(yǎng)基中的生長速率，最高細胞密度可達10.74 g/L，比初始培養(yǎng)基中提高了28% (表3)。

2.1.4 5 L發(fā)酵罐中異養(yǎng)培養(yǎng)過程

在5 L發(fā)酵罐中應(yīng)用上述優(yōu)化后的異養(yǎng)培養(yǎng)基，采用補料分批培養(yǎng)工藝異養(yǎng)培養(yǎng)橢圓小球藻，最高細胞密度達 73.89 g/L，平均生長速率為 0.88 g/(L·h)(圖1)，極大地提高了藻細胞密度，縮短了培養(yǎng)時間，可以為光自養(yǎng)培養(yǎng)及時提供充足的種子。

表1 不同氮源種類對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of different nitrogen sources on heterotrophic growth of C. ellipsoidea

表2 不同C/N比對橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的影響Table 2 Effects of different C/N on heterotrophic growth of C. ellipsoidea

表3 異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化前后橢圓小球藻生長特性比較Table 3 Comparison on growth characteristic of C. ellipsoidea cultivated with optimal and original medium

圖1 橢圓小球藻5 L發(fā)酵罐異養(yǎng)培養(yǎng)過程Fig. 1 The process of fed-batch cultivation of C. ellipsoidea in 5 L fermenter.

2.2 光自養(yǎng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 不同培養(yǎng)基對橢圓小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)影響

在相同培養(yǎng)條件下，3#[11]、F/2[12]、Pr[13]和BG-11[14]培養(yǎng)基條件下藻細胞密度差別不大，分別為1.20 g/L、1.18 g/L、1.17 g/L和1.11 g/L，但橢圓小球藻在 4種培養(yǎng)基中的油脂含量和油脂產(chǎn)率差別較大。雖然在BG-11培養(yǎng)基條件下藻細胞密度最低，但其油脂含量和油脂產(chǎn)率卻是最高，分別達到30.39%和4.03 mg/(L·h)；在3#培養(yǎng)基條件，雖然藻細胞密度最高，但其油脂含量和油脂產(chǎn)率卻均低于 BG-11培養(yǎng)基，分別為 22.09%和2.73 mg/(L·h)，而F/2和Pr培養(yǎng)基中藻細胞的油脂含量和油脂產(chǎn)率均低于BG-11培養(yǎng)基 (圖2)。

圖2 不同培養(yǎng)基對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響Fig. 2 Effects of different mediums on photoautotrophic cultivation and lipid accumulation of C. ellipsoidea.

2.2.2 氮濃度對橢圓小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)的影響

不同氮濃度下小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率有較大的差異。當培養(yǎng)基中不添加氮源時，藻細胞根本無法生長，油脂含量和油脂產(chǎn)率基本為零。當培養(yǎng)基中氮含量為初始培養(yǎng)基中氮含量的 2/3時，最高藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率比初始培養(yǎng)基分別提高23.58%、12.03%和56.61%；當培養(yǎng)基中氮含量為初始培養(yǎng)基中氮含量的 1/3時，最高藻細胞密度比初始培養(yǎng)基提高22.28%，但其油脂含量卻下降17.06%。

2.2.3 磷濃度對橢圓小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)的影響

如圖 4所示，當培養(yǎng)基中不添加磷源時，藻細胞依然可以生長，但其最高藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率比對照分別下降29.25%、48.85%和81.11%。此現(xiàn)象與培養(yǎng)基中不添加氮源的結(jié)果有較大差別，這可能是由于藻細胞對磷有吸附作用。雖然異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞經(jīng)過離心去除了上清液，但藻細胞可能吸附了一定量的磷，因此藻細胞依然可以在不添加磷的光自養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)基中磷含量為初始培養(yǎng)基中磷含量的 2/3時，最高藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率比初始培養(yǎng)基條件下分別提高4.08%、2.43%和9.57%；當培養(yǎng)基中磷含量為初始培養(yǎng)基中磷含量1/3時，最高藻細胞密度比初始培養(yǎng)基條件下提高8.16%，但其油脂含量卻下降8.04%。因此，優(yōu)化后確定的最佳光自養(yǎng)培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基，其中氮源和磷源濃度均為原始濃度的2/3。

2.2.4 初始細胞密度對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響

圖3 氮濃度對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響Fig. 3 Effects of nitrogen level of medium on the photoautotrophic cultivation and lipid accumulation of C. ellipsoidea.

圖4 磷濃度對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響Fig. 4 Effects of phosphorus level of medium on the photoautotrophic cultivation and lipid accumulation of Chlorella ellipsoidea.

在相同培養(yǎng)條件下，不同的初始接種密度對光自養(yǎng)培養(yǎng)的結(jié)果有較大影響。當初始接種密度在0.3 g/L以下時，隨著初始接種密度的提高，小球藻光自養(yǎng)最高藻細胞密度也越大。初始接種密度為0.2 g/L和0.3 g/L時，兩者油脂產(chǎn)率無明顯差異，但初始藻細胞密度 0.3 g/L時的油脂含量卻比0.2 g/L時下降21.94% (圖5)。

2.2.5 通氣量對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響

在相同培養(yǎng)條件下，通氣量越大，小球藻光自養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率也越大。通氣量越大，光生物反應(yīng)器中混合也越充分，藻細胞可以更好接受光照。在通氣量為2 L/min條件下，光自養(yǎng)培養(yǎng)最高藻細胞密度、油脂含量和油脂產(chǎn)率可以分別達到 1.62 g/L、36.34%和6.13 mg/(L·h)(圖 6)。

2.3 異養(yǎng)細胞/光自養(yǎng)培養(yǎng)的橢圓小球藻胞內(nèi)脂肪酸的組成

從表4可見，以異養(yǎng)細胞/光自養(yǎng)培養(yǎng)模式培養(yǎng)的橢圓小球藻中脂肪酸以 C16-C18為主，占總脂肪酸的98.88%，不飽和脂肪酸大約占總脂肪酸的64.15%。根據(jù)相關(guān)文獻[15]，上述組分的脂肪酸較適合制備生物柴油。

圖5 初始細胞密度對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響Fig. 5 Effects of initial cell density on photoautotrophic cultivation and lipid accumulation of C. ellipsoidea.

圖6 通氣量對橢圓小球藻光自養(yǎng)生長及油脂積累的影響Fig. 6 Effects of aeration rate on the photoautotrophic cultivation and lipid accumulation of C. ellipsoidea.

表4 異養(yǎng)細胞種子/光自養(yǎng)培養(yǎng)的橢圓小球藻細胞內(nèi)油脂中脂肪酸的組成Table 4 Fatty acid composition of C. ellipsoi dea cultivated by heterotrophic cells/photoautotrophic cultivation model

3 結(jié)論

異養(yǎng)細胞/光自養(yǎng)培養(yǎng)方法的關(guān)鍵是獲得高濃度的異養(yǎng)藻細胞以及提高光自養(yǎng)培養(yǎng)產(chǎn)油脂的能力。通過優(yōu)化，異養(yǎng)階段最高藻細胞密度和光自養(yǎng)培養(yǎng)階段油脂產(chǎn)率分別達到 11.04 g/L和6.1 mg/(L·h)，比Zheng等[5]報道的最高異養(yǎng)藻細胞密度9.0 g/L和油脂產(chǎn)率5.2 mg/(L·h)，分別提高了22.67%和17.12%。

通過本文的研究，使橢圓小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細胞密度有了很大提高，且培養(yǎng)規(guī)模從搖瓶放大到50 L罐，最高細胞密度達到73.89 g/L，可為光自養(yǎng)培養(yǎng)提供充足及時的種子；同時也揭示了不同培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件對光自養(yǎng)培養(yǎng)過程油脂的積累具有較大影響。上述結(jié)論說明異養(yǎng)細胞種子/光自養(yǎng)培養(yǎng)方法可以有效地提高橢圓小球藻產(chǎn)油脂的能力，這進一步表明異養(yǎng)細胞種子/光自養(yǎng)培養(yǎng)方法有望成為可異養(yǎng)的能源微藻的高效培養(yǎng)方式。

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