小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)組的整體重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記

樊鋒旭，高慧英，徐忠偉，翟琳輝，衣泰龍，張濤，吳飛林，崔春萍，徐平1,

1 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850 3 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)后出現(xiàn)的一門在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的新興學(xué)科[1-2]。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞、組織或體液等生物樣本在某些過(guò)程中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行比較分析。定量蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的是基于穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記 SILAC (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)方法，使用輕、重穩(wěn)定性同位素合成的氨基酸標(biāo)記不同來(lái)源的體外培養(yǎng)細(xì)胞。由于輕、重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記肽段具有完全一致的物理化學(xué)性質(zhì)，因此在色譜分離過(guò)程中能夠被共洗脫出來(lái)，同時(shí)經(jīng)離子化而進(jìn)入質(zhì)譜被檢測(cè)，但重穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)的肽段與輕標(biāo)記肽段的離子在質(zhì)量上會(huì)出現(xiàn)偏移，因此可辨識(shí)不同處理的樣品來(lái)源。而這些成對(duì)離子在質(zhì)譜圖中的信號(hào)強(qiáng)度與各自的含量相關(guān)，因此可用于樣品豐度的定量分析[3-4]。SILAC方法具有樣本需求量少、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。然而在體外培養(yǎng)的細(xì)胞難于復(fù)制機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，亦無(wú)法反映研究模型的生長(zhǎng)發(fā)育階段、生理甚至心理狀態(tài)等要素，使得基于細(xì)胞水平的SILAC定量蛋白組學(xué)并不能完整闡釋生理狀態(tài)下生物的生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程和疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的蛋白質(zhì)功能調(diào)控及其規(guī)律[6]。因此，基于動(dòng)物水平SILAC標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展極為重要。

小鼠的生理生化和發(fā)育過(guò)程與人類相似，并且基因組和人類 90%同源，所以人類疾病的小鼠模型可真實(shí)模擬人類疾病的發(fā)病過(guò)程[7-8]。但由于技術(shù)限制，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)整體小鼠SILAC標(biāo)記研究的報(bào)道，而國(guó)外SILAC小鼠購(gòu)買價(jià)格昂貴，動(dòng)物源性材料引進(jìn)的風(fēng)險(xiǎn)等諸多因素和限制，使得我國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)科學(xué)家難于開展SILAC小鼠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展。本研究旨在通過(guò)評(píng)價(jià)SILAC小鼠制備方法及其標(biāo)記的心、肝、脾、肺和腎等臟器的標(biāo)記效率，研究整體小鼠標(biāo)記過(guò)程中蛋白質(zhì)組水平的標(biāo)記特性，并通過(guò)構(gòu)建接近完全標(biāo)記的SILAC小鼠，為腫瘤、心血管、代謝疾病以及老年病等定量蛋白組學(xué)研究提供重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)標(biāo)樣品，促進(jìn)我國(guó)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的系統(tǒng)而深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠品系基本情況

SPF級(jí)C57BL/6J品系雌性小鼠4只，4周齡，12?14 g；雄性小鼠 2只，4周齡，13?15 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK-(軍)2012-0004，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 小鼠SILAC鼠糧

含有 1%13C6-Lysine (純度≥98%)重標(biāo)鼠糧購(gòu)自于Silantes公司 (Munich，German網(wǎng)址：http://www.silantes.com/)[9-10]。鼠糧在 4 ℃保存。

1.1.3 主要試劑與儀器

色譜級(jí)乙腈、甲醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺、碳酸氫銨(NH4HCO3)均購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司；質(zhì)譜級(jí)蛋白質(zhì)酶 Lys-C (Wako公司)；二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺 (IAA)為 Amresco公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑 Cocktail購(gòu)自 Roche公司；超聲破碎儀為寧波新芝生物科技有限公司JY98-IIIDN型號(hào)的產(chǎn)品；高精度質(zhì)譜儀 LTQ Orbitrap Velos為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超高壓納升級(jí)高效液相色譜儀 (Ultra-high Performance Liquid Chromatography)為Waters公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)方法

圖1 SILAC小鼠代謝標(biāo)記以及標(biāo)記效率檢測(cè)流程圖Fig. 1 Overview of the SILAC labeling and labeling efficiency examination workflow.

小鼠于屏障級(jí)設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，二級(jí)動(dòng)物飲水標(biāo)準(zhǔn)，每周換水 2?3次，雌雄小鼠分別喂食含有 1%13C6-Lysine的重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的SILAC鼠糧和SPF級(jí)繁殖飼料，每周添料3?4次。如圖1所示，飼養(yǎng)至8周齡，將1只成熟期雄鼠與2只喂食SILAC鼠糧的標(biāo)記小鼠 (記為F0代)合籠，隔日以陰道栓檢測(cè)有無(wú)受孕情況。受孕后及時(shí)取出雄性小鼠，隔離。雌性受孕小鼠成功受孕后繼續(xù)飼喂SILAC鼠糧，直到生產(chǎn)仔鼠，為F1代。挑選F1代雌性小鼠，繼續(xù)以SILAC鼠糧喂養(yǎng)至8周齡，與雄鼠交配后生產(chǎn)，為F2代標(biāo)記小鼠。

1.2.2 小鼠組織分離及蛋白提取

選取5周齡F2代小鼠，經(jīng)過(guò)眼球摘除法取血，降低血清中高豐度蛋白對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。如圖 1所示，眼科剪分離出大腦、肺臟、心臟、胃、小腸、肝臟、脾臟、腎臟和肌肉 (臀大肌)組織，磷酸鹽緩沖液 (Phosphate buffer solution，PBS)清洗殘留血液，濾紙吸干后置于液氮中速凍，然后放入–80 ℃冰箱凍存。

取上述9種組織各0.3 g，置于盛有液氮的研缽中速凍，均勻研磨成粉狀，加入500 μL蛋白質(zhì)裂解液 (8 mol/L尿素、50 mmol/L NH4HCO3、蛋白酶抑制劑和5 mmol/L IAA)，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，功率 300 W，工作1 s，間歇5 s，60個(gè)循環(huán)。細(xì)胞破碎后4 ℃低溫12 000×g離心10 min，收集上清，分裝后置于–80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)組樣品制備

樣品制備參考Zhai等[11]的方法進(jìn)行，取分裝9種組織全蛋白各10 μL，加入10 mmol/L的DTT，50 ℃恒溫水浴 5 min，冰浴冷卻后加入IAA (終濃度20 mmol/L)避光反應(yīng)0.5 h。再加入10 μL 2×SDS上樣緩沖液，均勻混合后，采用10% SDS-PAGE電泳，待樣品入分離膠1 cm時(shí)停止電泳。再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250染色、脫色后，將膠條均分成1 mm3膠粒，脫色、干燥。為確保每個(gè)來(lái)自 SILAC樣品的肽段可用于定量，我們選用對(duì)賴氨酸特異的 Lys-C蛋白酶進(jìn)行酶解、抽提肽段，蒸干后置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 LC-MS/MS分析

肽段樣品用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜柱采用柱內(nèi)徑為75 μm、長(zhǎng)15 cm的C18反相色譜柱，C18填料顆粒大小為1.9 μm，孔徑200 ?。將樣品用適當(dāng)體積的1%乙腈和1%甲酸的水溶液溶解后，取3 μL上樣。流動(dòng)相A為2%乙腈和0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸的乙腈溶液。使用60 min的梯度洗脫樣品：0?3 min，B相由0%升至3%；3?12 min，B相從3%升至12%；20?55 min，B 相從 12%升至 40%；55?58 min，B相從40%升至80%；58?60 min，B相維持80%，流速0.3 μL/min。洗脫組分經(jīng)納升級(jí)電噴霧離子源 (NSI)接口噴出，進(jìn)入 LTQ Orbitrap Velos分析。質(zhì)譜采用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描模式 (Data dependent MS/MS scan)碰撞誘導(dǎo)裂解 (CID)模式碎裂一級(jí)離子。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍 (300?1 600 m/z)，分辨率設(shè)置為30 000；自動(dòng)增益控制 (Automatic gain control，AGC)為 106。依次選取一級(jí)信號(hào)強(qiáng)度最高的 15個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)碎裂分析，碰撞歸一化能量 (NCE)為35%；AGC為5 000；最大離子注射時(shí)間為25 ms，動(dòng)態(tài)排除為30 s[12]。

1.2.5 蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析

使用 SorcererTM-SEQUEST?(version 4.0.4 build, Sage-N Research, Inc.)搜索引擎對(duì)質(zhì)譜產(chǎn)出的數(shù)據(jù)文件 (.raw)進(jìn)行蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，數(shù)據(jù)庫(kù)采用從NCBI下載的小鼠蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù) (Version：20110718)。搜庫(kù)參數(shù)采用固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾 (+57.021 46 Da)，Lys-C 特異性半酶切，13C6-Lysine修飾(+6.020 13 Da)；可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾(+15.994 92 Da)；母離子質(zhì)量誤差20 ppm，子離子質(zhì)量誤差 0.5 Da，允許最大漏切位點(diǎn)數(shù)目為2個(gè)，肽段長(zhǎng)度≥6個(gè)氨基酸，肽段最大修飾數(shù)目為4種。搜庫(kù)結(jié)果采用Target-decoy策略進(jìn)行過(guò)濾，并設(shè)定肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR均小于1%。數(shù)據(jù)的定量使用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部編寫軟件，基本策略是提取肽段離子的提取離子色譜圖(Extracted ion currents, XICs)，計(jì)算非標(biāo)記輕標(biāo)和 SILAC標(biāo)記的重標(biāo)肽段對(duì) XICs的信噪比(S/N)比值，進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，即為輕重離子對(duì)的定量值[12]。

1.2.6 標(biāo)記效率分析及擬合

將蛋白質(zhì)定量值 (Log2Light/Heavy)采取Gauss方程擬合數(shù)據(jù)分布，正態(tài)分布平均值的95%置信區(qū)間表示標(biāo)記效率的范圍[13]。SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

標(biāo)記效率計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 SILAC鼠糧和普通鼠糧飼養(yǎng)小鼠的生長(zhǎng)情況比較

喂食SILAC鼠糧的小鼠與SPF級(jí)維持鼠糧的對(duì)照組小鼠外觀上無(wú)明顯區(qū)別。同樣表現(xiàn)為體毛光滑，食欲旺盛，活動(dòng)有力，反應(yīng)敏捷，糞便正常呈黑色麥粒狀。F0代小鼠生長(zhǎng)至7周齡時(shí)，喂食SILAC小鼠的平均體重為17.55 g，對(duì)照組小鼠的體重為17.60 g；標(biāo)記小鼠培養(yǎng)至F2代，7周齡時(shí)體重為15.20 g，小鼠體重有輕微下降的趨勢(shì)。小鼠合籠交配發(fā)現(xiàn)性成熟期延長(zhǎng)。通過(guò)記錄對(duì)照組、F0代和F2代SILAC標(biāo)記小鼠 6、7、10和 11周齡的體重，結(jié)果如圖2A所示，進(jìn)行單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組間的顯著性P=0.110，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SILAC鼠糧飼養(yǎng)小鼠對(duì)小鼠生長(zhǎng)體重的影響不顯著。

2.2 小鼠9種器官組織全蛋白檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同鼠糧飼養(yǎng)小鼠體重對(duì)比和F2代SILAC不同臟器總蛋白圖Fig. 2 Weight variation of control, F0 and F2 generations and separation of proteins extracted from different tissues. (A)Comparison of weight variation of control, F0 and F2 generations at 6, 7, 10 and 11 weeks by repeated measure ANOVA analysis. Every generation has two repeats. (B)The extracted proteins from varied SILAC labeled tissues of F2 generation mouse were separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. The gel areas cut and followed by destaining and in-gel digestion were indicated by square marking.

將從9種不同組織提取的全蛋白各取10 μL，用10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250染色和脫色。結(jié)果如圖2B所示，蛋白條帶清晰沒(méi)有彌散現(xiàn)象，說(shuō)明液氮碾磨裂解和尿素裂解液能較好地防止組織蛋白降解。對(duì)比膠圖上蛋白條帶的深淺，我們發(fā)現(xiàn)相同濕重的器官組織，如肝臟、腎臟和肌肉組織等實(shí)質(zhì)性器官的蛋白含量較高；而心臟、脾臟、肺和腦組織等蛋白質(zhì)的量較低，我們分析認(rèn)為是由于這些器官含有較多空腔，造成蛋白的提取效率較低；同樣，由于胃和腸道組織因含有部分食物殘?jiān)?，也?huì)造成提取的蛋白質(zhì)較少。

2.3 蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)目情況

將 9種不同器官樣品的蛋白條帶從SDS-PAGE膠上切下，進(jìn)行膠內(nèi)蛋白酶Lys-C酶消化后，抽提消化后的肽段，用LC-MS/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定和定量。結(jié)果如表 1所示，我們共鑒定1 889個(gè)蛋白，有定量結(jié)果的蛋白數(shù)目1 876個(gè)，定量蛋白數(shù)占鑒定蛋白數(shù)的98 %以上，表明我們檢測(cè)的蛋白質(zhì)的信號(hào)較強(qiáng)。每個(gè)組織樣品平均鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目為：(531.6±63.3)個(gè)，定量為 (521.8±59.3)個(gè)。其中在9種組織樣品中被共同鑒定和定量的蛋白質(zhì)有9個(gè)，分別是：ATP 合成酶 β 亞基 (ATP synthase β subunit)；延長(zhǎng)因子 1α (Elongation factor 1 alpha， eEF1A)；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 A3 (Protein disulfide isomerase A3，PDIA3)；轉(zhuǎn)酮醇酶(Transketolase)；葡萄糖 6磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase，GPI)；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (Protein disulfide isomerase，PDI)；泛素-60S核糖體蛋白L40 (Ubiquitin-60S ribosomal protein L40)；熱休克70蛋白8 (Heat shock 70 kDa protein 8，HSPA8)和 β5微管蛋白(Tubulin beta-5)。

2.4 蛋白質(zhì)代謝標(biāo)記分析結(jié)果

基于代謝標(biāo)記的SILAC定量策略是根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)同一肽段在一級(jí)質(zhì)譜中的輕和重標(biāo)離子對(duì)的強(qiáng)度進(jìn)行比較，計(jì)算的比值就是相對(duì)定量的結(jié)果[14]。在本研究中所有組織器官共定量的9種蛋白中，對(duì)比Genecard中PaxDb數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)HSPA8蛋白在各種小鼠組織中均高表達(dá) (數(shù)據(jù)庫(kù)含有的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和大腦 6種器官組織數(shù)據(jù)中，表達(dá)豐度均為各器官的蛋白豐度Top 5%)，是較好反映不同組織間標(biāo)記效率差異的蛋白。如圖3所示，HSPA8中的一個(gè)定量肽段 SINPDEAVAYGAAVQAAILS GDK，根據(jù)輕重離子對(duì)的比例，計(jì)算重離子所占總離子的比例，即被13C6-Lysine標(biāo)記的肽段占總肽段的比例，就可以計(jì)算出代謝標(biāo)記的蛋白標(biāo)記效率。分析HSPA8的結(jié)果顯示肝臟標(biāo)記效率為98.00%，心臟標(biāo)記效率為93.63%，脾臟標(biāo)記效率為96.46%，肺標(biāo)記效率為96.18%，腎臟標(biāo)記效率為97.88%，胃標(biāo)記效率為97.02%，腸標(biāo)記效率為 96.11%，腦組織標(biāo)記效率為94.52%，肌肉組織標(biāo)記效率為95.16%。

表1 各組織器官鑒定和定量蛋白數(shù)量列表Table 1 Protein number of identified and quantified on different tissues

圖3 通過(guò)計(jì)算HSPA8蛋白的特征肽段的輕重離子對(duì)的相對(duì)峰強(qiáng)度反映不同臟器的標(biāo)記效率Fig. 3 Analysis of labeling efficiency by comparing the relative peak intensity between the light and heavy ion pairs.Labeling of a representative peptide across different tissues of F2 generation SILAC mouse was selected. Proteins of nine tissues were extracted, in-gel digested, and analyzed by nanoLC-MS/MS to examine labeling efficiency.

進(jìn)一步對(duì)器官組織的所有蛋白的定量信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以計(jì)算出器官的整體標(biāo)記效率。為減少因標(biāo)記導(dǎo)致輕標(biāo)氨基酸肽段過(guò)少或缺失引發(fā)的強(qiáng)迫匹配以及由此引起的定量誤差，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了過(guò)濾，排除了信噪比S/N<10的肽段，并對(duì)保留的肽段逐個(gè)作了手工檢查，最后各組織得到接近200個(gè)定量蛋白質(zhì)。用高斯方程對(duì)過(guò)濾后蛋白質(zhì)的定量值數(shù)據(jù)分布進(jìn)行正態(tài)性擬合，如圖 4所示，根據(jù)正態(tài)分布的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，利用標(biāo)記效率計(jì)算公式，計(jì)算各種組織的整體標(biāo)記效率：肝臟為96.34%±0.90%；心臟為94.12%±1.42%；脾臟為95.96%±1.19%；肺臟為95.01%±1.86%；腎臟為95.60%±0.94%；胃臟為 95.71%±1.22%；腸為95.71%±1.98%；大腦為92.62%±1.98%；肌肉為94.16%±1.41%。結(jié)果顯示標(biāo)記效率最高的是肝臟 96.34%±0.90%，標(biāo)記效率最低的是心臟94.12±1.42%和大腦92.62%±1.98%，而小鼠整體的標(biāo)記效率為95.80%±0.64%。

德國(guó)科學(xué)家Krüger等研究顯示[15]，SILAC定量蛋白組學(xué)穩(wěn)定和準(zhǔn)確的定量結(jié)果的前提是作為內(nèi)標(biāo)的蛋白質(zhì)組樣本的整體標(biāo)記效率應(yīng)滿足≥95.00%，即在器官/組織中蛋白質(zhì)含有的Lysine至少有95%經(jīng)過(guò)代謝替換成13C6-Lysine。本研究中，F(xiàn)2代的 SILAC小鼠整體標(biāo)記效率95.80%±0.64%，完全符合以上標(biāo)準(zhǔn)，因此可以成為后續(xù)研究中的定量?jī)?nèi)標(biāo)。

我們分析的結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)2代的SILAC小鼠肝臟的標(biāo)記效率高于整體標(biāo)記水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)；而小鼠心臟和大腦組織低于整體標(biāo)記水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)。因此，F(xiàn)2代SILAC小鼠標(biāo)記效率具有組織特異性。

圖4 各組織器官定量蛋白的標(biāo)記效率定量值的高斯擬合圖Fig. 4 Histograms of log2Light/Heavy using the quantified proteins from different tissues. Labeling efficiencies were analyzed using the population of proteins quantified by the log-transformed ratio of heavy versus light peptides representing protein labeling efficiency.

圖5 各組織器官整體標(biāo)記效率Fig. 5 Comparison of SILAC labeling efficiencies in different tissues. The labeling efficiency of liver was higher than whole labeling efficiency of mouse, and the labeling efficiencies of heart and brain were lower. The differences were statistically significant (P <0.05).

3 討論

目前基于穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記的SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的重要方向。SILAC定量方法在不同樣品的細(xì)胞或者蛋白質(zhì)層面進(jìn)行混樣，使得后續(xù)的生物學(xué)處理組和重標(biāo)對(duì)照組樣品的處理過(guò)程完全保持一致，可有效排除后續(xù)樣品的純化、預(yù)分離、蛋白質(zhì)消化、肽段抽提等一系列蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備過(guò)程各步驟可能引入的誤差，有效提高定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的準(zhǔn)確性[3]。

由于標(biāo)記技術(shù)的限制和標(biāo)記成本的昂貴，SILAC技術(shù)主要應(yīng)用在微生物以及細(xì)胞等的定量研究中，難以拓展到對(duì)動(dòng)物模型的代謝標(biāo)記。在諸多的模式生物中，小鼠具有與人類高度同源等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究中的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記的模式小鼠能為各種疾病小鼠模型、基因敲除小鼠模型和微生物感染小鼠模型的研究提供定量?jī)?nèi)標(biāo)。這為研究基因或蛋白質(zhì)的功能、代謝或信號(hào)通路提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐[16-18]。

本研究在國(guó)內(nèi)首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC標(biāo)記方法，利用含有重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記賴氨酸 (13C6-Lysine)的 SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠，結(jié)合LC-MS/MS對(duì)不同器官組織進(jìn)行了定量標(biāo)記分析，證明F2代小鼠的整體標(biāo)記效率達(dá)到 95%以上。由于不完全標(biāo)記時(shí)作為定量?jī)?nèi)標(biāo)的SILAC重標(biāo)小鼠中摻雜有未被代謝標(biāo)記的輕標(biāo)蛋白，在與需要比較的樣品混合后，殘留的輕標(biāo)蛋白與樣品蛋白難以區(qū)分，會(huì)對(duì)依據(jù)輕重標(biāo)記的離子對(duì)定量的結(jié)果帶來(lái)干擾，難以實(shí)現(xiàn)高精度的準(zhǔn)確定量比較。因此基于目前定量蛋白組學(xué)研究中內(nèi)標(biāo)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，95%的標(biāo)記效率是代謝標(biāo)記的基本要求[15]。通過(guò)不斷地方法改進(jìn)提高標(biāo)記效率是值得繼續(xù)探索的課題。然而標(biāo)記效率不能無(wú)限提升至100%，因?yàn)闃?biāo)記效率一方面受到穩(wěn)定同位素的純度的限制 (目前使用的13C6-Lysine的純度為98.00%)；另一方面跟器官/組織細(xì)胞的代謝效率和增殖速度有關(guān)。

不同的器官組織存在著不同的標(biāo)記效率。肝臟是機(jī)體代謝的核心器官，擁有肝動(dòng)脈和門靜脈雙重血液供應(yīng)。腸道吸收的13C6-Lysine經(jīng)過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟為其提供了充足的標(biāo)記物質(zhì)。肝臟細(xì)胞是可再生細(xì)胞，這使得肝臟具有良好的自我增殖能力，在應(yīng)對(duì)物質(zhì)損傷凋亡后能迅速完成修補(bǔ)，因此肝臟的蛋白質(zhì)更新較快，整體代謝標(biāo)記效果好。大腦組織作為神經(jīng)系統(tǒng)與心臟組織的心肌細(xì)胞相似，均是終末分化細(xì)胞，因此這兩個(gè)組織的標(biāo)記效率低于整體水平。這些與 Zanivan等[17]報(bào)道結(jié)果一致。在Mann等[14]關(guān)于小鼠蛋白質(zhì)代謝動(dòng)力學(xué)的研究中，以MRPL12蛋白 (Mitochondrial 39S ribosomal protein L12)為例，肝臟更新速率為0.205/d，心臟更新速率為 0.065/d。標(biāo)記一半的MRPL12，肝臟只需要3.4 d，而心臟需要10.6 d。對(duì)肝臟和心臟定量的242種蛋白進(jìn)行分析，肝臟的蛋白質(zhì)平均更新速率為 0.16/d，心臟的蛋白質(zhì)平均更新速率為 0.04/d[19]。肝臟蛋白質(zhì)更新速率明顯高于心臟，這使得在相同時(shí)間內(nèi)，肝臟更容易被SILAC標(biāo)記，而心臟標(biāo)記效率較低。通過(guò)延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間或者對(duì)其子代小鼠進(jìn)行標(biāo)記可以提高大腦和心臟等不易于代謝標(biāo)記組織器官的完全標(biāo)記。

在研究中，課題組成功地將SILAC方法從微生物和細(xì)胞系水平拓展到哺乳動(dòng)物模型，在國(guó)內(nèi)首先建立了用于各種動(dòng)物模型研究的蛋白質(zhì)組學(xué)定量?jī)?nèi)標(biāo)[11-13-20]。SILAC小鼠能用于各種組織器官的定量蛋白組學(xué)或比較蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域，將研究水平從培養(yǎng)的細(xì)胞層面，提升到整體動(dòng)物的組織/器官層面，并且能夠研究某種干預(yù)對(duì)于機(jī)體的不同器官的影響，闡釋不同器官間的內(nèi)在聯(lián)系。這為定量蛋白組學(xué)研究疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了有力工具。

致 謝：感謝張瑤在英文修改中提供的支持。

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