人OX40胞外區(qū)基因的克隆、原核表達(dá)及單克隆抗體的制備

呂衛(wèi)東，李俊鑫，劉綠艷，李欣，崔璐璐，萬(wàn)曉春

?

人OX40胞外區(qū)基因的克隆、原核表達(dá)及單克隆抗體的制備

呂衛(wèi)東，李俊鑫，劉綠艷，李欣，崔璐璐，萬(wàn)曉春

518055 深圳，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院（呂衛(wèi)東、李俊鑫、劉綠艷、萬(wàn)曉春）；121000 錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（李欣、崔璐璐）

制備抗人OX40 單克隆抗體，為進(jìn)一步研究OX40/OX40L 通路以及針對(duì)該通路進(jìn)行疾病干預(yù)、疾病治療和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

PCR擴(kuò)增人OX40 胞外區(qū)的基因序列，將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a(+) 中，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)OX40 胞外區(qū)蛋白，經(jīng)Ni 柱純化后獲得目的蛋白。以純化的OX40 胞外區(qū)蛋白為免疫原免疫小鼠，采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)ELISA和多次克隆化培養(yǎng)，篩選出分泌特異性鼠抗人OX40 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過(guò)ELISA、Western blot 和免疫熒光檢測(cè)抗體的效價(jià)及特異性。

成功構(gòu)建人OX40 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-OX40，并在BL21(DE3) 中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot 鑒定、Ni 柱純化、透析后獲得OX40 胞外區(qū)蛋白；以此純化蛋白為免疫原，成功制備具有較強(qiáng)親和力的單克隆抗體。

克隆表達(dá)并純化了人OX40 蛋白，成功制備針對(duì)該蛋白的高親和力單克隆抗體，為進(jìn)一步研究OX40/OX40L 的生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

受體，OX40； 基因表達(dá)； 抗體，單克隆

OX40（CD134）屬于 TNFR 超家族成員之一，為 I 型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)在活化的 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞表面，其配體 OX40L 在活化的 B 細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)[1-2]。在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中，OX40/OX40L 作為一對(duì)重要的共刺激分子，為 T、B 細(xì)胞的激活提供了重要的共刺激信號(hào)，其信號(hào)傳導(dǎo)也與效應(yīng)細(xì)胞存在和功能相關(guān)[3-4]。由于 OX40/OX40L 在機(jī)體的免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，并隨著生物學(xué)功能的進(jìn)一步揭示逐漸成為臨床干預(yù)自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的一個(gè)理想靶點(diǎn)[5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pET32a(+)、pLVX-IRES-ZsGreen、BL21(DE3)、HEK293T 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；人 OX40 基因全長(zhǎng) ORF 克隆購(gòu)自北京義翹神舟生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT 及 PEG4000 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；限制性核酸內(nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量標(biāo)記均購(gòu)自日本 Takara 公司；T4 DNA 連接酶為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)于北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司。6~ 8 周齡 SPF 級(jí)BALB/c 雌性小鼠，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 pET32a(+)-OX40 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以人全長(zhǎng) OX40 cDNA 為模板，上游引物 F：CATGAACTCCACTGTGTCGGGGACACC，下游引物 R：CCCTTAGATGGCGGCA ACCGCACG（下劃線分別為I和d III酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增 OX40 基因。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 50 s，52 ℃復(fù)性 35 s，72 ℃延伸 50 s，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳及膠回收后連接到原核表達(dá)載體 pET32a(+) 上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)，經(jīng)I和d III雙酶切鑒定的陽(yáng)性克隆送至Invitrogen 公司測(cè)序。

1.2.2 OX40 蛋白的原核表達(dá)、鑒定及純化 將測(cè)序正確的菌株接種于 3 ml LB 氨芐培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600= 0.6 ~ 0.8，加入至終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，于 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，4 h 后分別取菌液 1 ml 離心收集菌體，SDS-PAGE 電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況，并用 HRP 標(biāo)記的 Anti-His 抗體對(duì)其進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)。

1.2.3 OX40 蛋白純化 驗(yàn)證正確的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，離心收菌體，用 PBS 重懸后超聲破碎，離心后取上清，用 0.45 μm 的濾器過(guò)濾，上樣于 Ni-Seproase 6FF 親和柱，經(jīng)鎳柱親和純化后，取少量上清液做 12% 的 SDS-PAGE 電泳驗(yàn)證蛋白純化效果。其余上清液轉(zhuǎn)移至超濾管中于 4 ℃條件下離心，濃縮蛋白，采用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，并于–80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 OX40 免疫小鼠及滴度測(cè)定 將純化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，初次免疫100 μg/只，將蛋白與弗氏完全佐劑 1:1 比例完全乳化后，皮下多點(diǎn)注射。間隔 2 周后，進(jìn)行第 2 次免疫，將蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后，皮下多點(diǎn)注射，100 μg/只。間隔 2 周后第 3 次免疫，方法同第 2 次。第 3 次免疫后眼眶取血測(cè)定抗體滴度。OX40 包被 ELISA 板，20 ng/孔，4 ℃包被過(guò)夜，5% 的脫脂奶粉 37 ℃封閉 1 h，PBS-T 洗滌 3 次后加入系列稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育 1 h，用 PBS-T 洗滌 3 次，加 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗（1:8000）孵育 30 min。用 PBS-T 洗滌 3 次，TMB避光顯色 10 min，2 mol/L 的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀 450 nm 測(cè)定值。

1.2.5 OX40 單克隆抗體的制備 選取滴度高的小鼠，腹腔注射 100 μg/只加強(qiáng)免疫，3 d 后取脾臟，采用 PEG 法與Sp2/0 細(xì)胞融合。HAT 培養(yǎng)基加壓篩選并克隆化篩選陽(yáng)性克隆，雜交瘤細(xì)胞接種 BALB/c 小鼠，制備并純化抗 OX40 抗體。

1.2.6 免疫熒光法測(cè)定 mAb 對(duì)膜表面 OX40 的識(shí)別 將培養(yǎng)的 293T 細(xì)胞以 1 × 105個(gè)/ml 的細(xì)胞密度接種到放置預(yù)處理的蓋玻片的 24 孔板中，利用脂質(zhì)體將 pLVX-IRES-ZsGreen 及 pLVX- IRES-OX40-ZsGreen 分別轉(zhuǎn)染到 293T 細(xì)胞中，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。用冰冷的 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用 3.7% 的多聚甲醛于室溫固定30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。1% BSA 室溫封閉 30 min 后，加入 1% BSA 稀釋的抗 OX40 單抗，于室溫孵育 1 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min。加入 1:400 稀釋的 Dylight594 標(biāo)記的羊抗鼠二抗于室溫孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次5 min。利用抗淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot 測(cè)定 mAb 對(duì)膜表面 OX40的識(shí)別特異性 利用脂質(zhì)體將 pLVX-IRES-ZsGreen及 pLVX-IRES-OX40-ZsGreen 分別轉(zhuǎn)染到 293T 細(xì)胞中，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的 RIPA 抽提后，將獲得的膜蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后用 5% 脫脂奶粉于 37 ℃封閉 1 h，之后于 37 ℃用制備的單抗進(jìn)行孵育，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 抗體作為二抗，分別孵育 8F8 株，4H11 株表達(dá)上清及羊抗鼠二抗，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以人全長(zhǎng) OX40 cDNA 為模板，設(shè)計(jì)上、下游引物通過(guò) PCR 擴(kuò)增 OX40 胞外區(qū)基因，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示目的片段大小為 576 bp，與預(yù)期值相符（圖 1）。OX40 基因片段與原核表達(dá)載體 pET32a 經(jīng)過(guò)雙酶切后通過(guò) T4 連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證，1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示電泳條帶與預(yù)期值相符（圖 2），確定表達(dá)載體 pET32a-OX40 構(gòu)建正確。

bp M 1 2000 1000750500 250100

Figure 1 PCR products of the extracellular domain of OX40

bp M 1 2 3 4 5 6 7 2000 1000750500 250100

Figure 2 The clone PCR results of transformants

2.2 融合蛋白的表達(dá)及鑒定

將陽(yáng)性菌于 37 ℃，0.2 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，細(xì)菌經(jīng)超聲波破碎后離心取上清進(jìn)行 SDS-PAGE（圖 3），與空載對(duì)照相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)物在 38 kD 處有明顯的條帶，表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。Western blot 分析結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約 38 kD 處有明顯條帶，與預(yù)期值相符。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化及 SDS-PAGE 鑒定

表達(dá)菌體經(jīng)超聲破碎后離心上清上樣于Ni-Seproase 6FF 親和層析柱，經(jīng)200 mmol/L 咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫后得到純化的目的蛋白（圖 4），經(jīng) Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，純化后的 OX40 蛋白的濃度為 400 μg/ml。

Figure 3 IPTG-induced expression ofOX40

kD M 1 2 3 4 1701301007055 40 35 25 15

Figrue 4 SDS-PAGE analysis of purified OX40

2.4 OX40 抗體效價(jià)測(cè)定

純化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，第3 次免疫后眼眶取血利用間接ELISA 法測(cè)定抗OX40 抗體的效價(jià)，由圖 5 可知，免疫 OX40 后，產(chǎn)生了高效價(jià)的抗 OX40 抗體。

2.5 單克隆抗體的制備及特異性鑒定

利用 PEG 法進(jìn)行細(xì)胞融合，共融合 10 塊96 孔板。將復(fù)測(cè)為陽(yáng)性的克隆連續(xù)進(jìn)行 2 次克隆化，獲得兩株穩(wěn)定的抗人 OX40 的雜交瘤細(xì)胞株。間接免疫熒光檢測(cè)表明，這兩株單抗均能識(shí)別 293T細(xì)胞表面表達(dá)的 OX40 蛋白（圖 6）。Western blot分析結(jié)果顯示，這兩株單抗均能與 293T 表達(dá)的OX40 蛋白特異性結(jié)合，空載對(duì)照組則無(wú)相應(yīng)條帶（圖 7）。

OD4504.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1234567 抗血清稀釋倍數(shù)The proportion of antiserum dilution

Figure 5 The titer of antiserum determined by indirect ELISA

圖 6 免疫熒光檢測(cè) OX40 單抗的特異性（1：空載對(duì)照；2：同型抗體對(duì)照；3：8F8 株；4：4H11 株）

Figure 6 Identification of OX40 mAb by immunofluorescence (1: Negative control of pLVX-IRES-ZsGreen plasmid; 2: IgG isotype control; 3: 8F8 cell line; 4: 4H11 cell line)

1 2 3

Figure 7 Western blot analysis of OX40 mAb

3 討論

OX40/OX40L 已被證實(shí)在炎性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤及移植排斥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[6-7]。通過(guò)對(duì)其干預(yù)所進(jìn)行的免疫治療在動(dòng)物模型上已取得較好的效果[8]。干預(yù) OX40/OX40L 途徑已經(jīng)作為治療許多臨床慢性炎性反應(yīng)性疾病的目標(biāo)之一[9-10]。

本研究通過(guò)基因工程手段克隆得到 OX40 胞外區(qū)片段并在原核細(xì)胞中高效表達(dá)，純化后用于免疫 BALB/c 小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)、單克隆抗體篩選及抗體純化技術(shù)獲得高效價(jià)的抗 OX40 抗體。通過(guò) ELISA 和免疫熒光鑒定所制備的單克隆抗體具有良好的特異性和高度的親和力，為進(jìn)一步研究 OX40/OX40L 的生物學(xué)活性及進(jìn)一步尋找針對(duì) OX40/OX40L 通路的治療藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前對(duì)于 OX40 分子抗腫瘤機(jī)制的研究還處于起步階段，但已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是振奮人心的[11]。將 OX40 分子作為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)已顯現(xiàn)出了積極的作用。而抗人 OX40mAb 的成功研制，為深入研究 OX40/OX40L 分子的作用以及信號(hào)通路提供了有力的新工具[12]。相信隨著對(duì) OX40 分子研究的深入，將會(huì)為協(xié)同刺激分子在腫瘤及其他疾病的免疫學(xué)治療等方面提供更有價(jià)值的線索和幫助。

[1] Ishii N, Takahashi T, Soroosh P, et al. OX40-OX40 ligand interaction in T-cell-mediated immunity and immunopathology. Adv Immunol, 2010, 105:63-98.

[2] Song J, So T, Croft M. Activation of NF-kappaB1 by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival. J Immunol, 2008, 180(11):7240-7248.

[3] Kaur D, Brightling C. OX40/OX40 ligand interactions in T-cell regulation and asthma. Chest, 2012, 141(2):494-499.

[4] Gough MJ, Weinberg AD. OX40 (CD134) and OX40L. Adv Exp Med Biol, 2009, 647:94-107.

[5] Zhang XK, Wang Q, Zhang XG. OX40/OX40L signal and autoimmune diseases. Chin J Immunol, 2012, 28(2):172-176. (in Chinese)

張雪琨, 王勤, 張學(xué)光. OX40/OX40L信號(hào)與自身免疫性疾病. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2012, 28(2):172-176.

[6] Farres MN, Al-Zifzaf DS, Aly AA, et al. OX40/OX40L in systemic lupus erythematosus: association with disease activity and lupus nephritis. Ann Saudi Med, 2011, 31(1):29-34.

[7] Mahmood T, Yang PC. OX40L-OX40 interactions: a possible tar-get for gastrointestinal autoimmune diseases. N Am J Med Sci, 2012, 4(11):533-536.

[8] Croft M. Control of immunity by the TNFR-related molecule OX40 (CD134). Annu Rev Immunol, 2010, 28:57-78.

[9] Redmond WL, Ruby CE, Weinberg AD. The role of OX40-mediated co-stimulation in T-cell activation and survival. Crit Rev Immunol, 2009, 29(3):187-201.

[10] Griseri T, Asquith M, Thompson C, et al. OX40 is required for regulatory T cell-mediated control of colitis. J Exp Med, 2010, 207(4): 699-709.

[11] Compaan DM, Hymowitz SG. The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex. Structure, 2006, 14(8):1321- 1330.

[12] Moran AE, Kovacsovics-Bankowski M, Weinberg AD. The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 as targets for cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol, 2013, 25(2):230-237.

Prokaryotic expression of the extracellular region of human OX40 and preparation of its antibody

Lü Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, LI Xin, CUI Lu-lu, WAN Xiao-chun

To prepare novel anti-OX40 functional monoclonal antibodies and characterize their distinct biological functions.

The gene fragment of extracellular region of OX40 was amplified by PCR and cloned into pET-32a(+) prokaryotic expressing vector. The expressed products were purified by Ni sepharose and identified by Western blot. The purified recombinant protein was used as antigen to immunize BALB/c mice. Then the immunized spleen cells were isolated from immunized mice and fuse with Sp2/0, a kind of myloma. After screening by ELISA, hybridomas secreting anti-OX40 mAb were acquired and used to generate specific Abs. At last, biological activities of Abs were investigated by ELISA, Western blot.

The recombinant OX40 extracellular domain protein was successfully expressed in BL21 and purified by Ni sepharose. It was a protein with about 38 kD molecular weight as analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The data of FACS demonstrated that the antiserum had high affinity to OX40 expressed on the membrane of OX40-transfected cells.

The purified protein OX40 has been successfully obtained. The prepared monoclonal antibody shows high specificity and titer in immunized mice. The preparation of recombinant OX40 and its monoclonal antibody has provided reliable tools for the future study on the biologic activity of OX40/OX40L.

Receptors, OX40; Gene expression; Antibodies, monoclonal

WAN Xiao-chun, Email: xc.wan@siat.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.006

深圳市孔雀計(jì)劃團(tuán)隊(duì)引進(jìn)資助項(xiàng)目（Y2A206）

萬(wàn)曉春，Email：xc.wan@siat.ac.cn

2014-07-08

Author Affiliations: Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Shenzhen 518055, China (Lü Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, WAN Xiao-chun); College of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou121000, China (LI Xin, CUI Lu-lu)