基于UPLC-PDA生物堿指標性成分含量和特征圖譜的不同產(chǎn)區(qū)黃連（味連）整體質量表征研究＊

彭 平，解素花，彭平安，冉孟國，遲玉明，劉 希，杜 菁，張蓓，李東影，田瑞華

（1.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司 北京 100079；2.重慶旺隆黃連科技有限公司 重慶 409100；3.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司 北京 100079；4.北京中醫(yī)藥大學 北京 100029；5.中國北京同仁堂（集團）有限責任公司 北京 100079）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch,、三角葉黃連Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖。以上3 種分別習稱“味連”、“雅連、“云連”[1]。由于黃連生產(chǎn)量與市場需求量關系，目前中藥材市場中黃連的主要流通品種以“味連”為主。2015 版《中華人民共和國藥典》黃連項下，采用鹽酸-甲醇提取液，磷酸鹽緩沖流動相分析方法對“味連”進行質量控制，以鹽酸小檗堿對照品峰面積為對照，分別計算表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的含量。研究發(fā)現(xiàn)，黃連中除了以生物堿為主的活性成分之外，還含有多種其他類成分，如酚類、木質素類，黃連降血糖、抗菌等藥效為各類成分的協(xié)同作用[2-5]。因此，同時分析研究黃連中生物堿以及非生物堿成分，有助于更為全面的對黃連質量進行評價。現(xiàn)已有文獻報道采用HPLC 指紋圖、UPLC-MA/MS 指紋圖譜等方法對黃連藥材進行了較為全面的質量研究[6-11]，但未從黃連藥材生物堿和非生物堿類成分同時整體評價黃連藥材質量?；诖?，本研究采用UPLCPDA 液相色譜法，首次建立了可同時分析測定黃連中生物堿和非生物堿類成分的特征圖譜分析方法，對31批次不同來源黃連藥材進行整體質量分析，對比分析了四川、石柱、湖北等“味連”主產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量差異，為黃連藥材的質量評價提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC HCLASS-2998PDA detector（沃特世科技（上海）有限公司）；純水儀；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；MettlerML204 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利集團）；MettlerXP205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利集團），0.22 μm 微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

1.2 樣品信息

黃連樣品分2 次收集了重慶產(chǎn)區(qū)15 批次黃連藥材，一次收集了湖北產(chǎn)區(qū)5批次藥材，一次收集了四川產(chǎn)區(qū)11 批次黃連藥材樣品，均為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch，味連（表1）。

1.3 對照品

表小檗堿對照品（含量98%，批號B20108；購自上海源葉生物有限公司），鹽酸黃連堿（含量95.1%，批號：112026-201601）、鹽酸巴馬?。ê?6.8%，批號：110732-201611）、鹽酸小檗堿（含量86.8%，批號：1107113-201613）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 對照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含鹽酸小檗堿75 μg、鹽酸黃連堿30 μg、表小檗堿15 μg、鹽酸巴馬汀30 μg的混合溶液，即得。

1.5 供試品溶液的制備

取本品粉碎，過四號篩，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性

色譜柱：Waters CORTECS Shield RP18 Column（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；以乙腈為流動相A、0.3%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0-3 min，2-13 % A；3-15 min，13-15%A；15-20min,15%A;20-22min,15-2%A）流速0.4 mL?min-1，柱溫35 ℃，檢測波長為210 nm，進樣體積1 μL，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應不低于6 000。色譜圖見圖1。

表1 黃連藥材樣品來源信息

2.2 色譜峰化學成分類型歸屬

根據(jù)色譜峰DAD 光譜圖，結合對照品標定，對黃連征圖譜中18個主要特征峰進行化學成分類型歸屬，指認了其中4 個生物堿類成分色譜峰。其中6、9、10為酚類成分，11-18號色譜峰為生物堿類成分，其余為其他類成分

2.3 線性關系考察

圖1 黃連（味連）特征圖譜

表2 黃連特征圖譜色譜峰信息

精密稱定鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品，配制成濃度分別為148.116 μg?mL-1、34.616 μg?mL-1、22.280 μg?mL-1、16.443 μg?mL-1的混標溶液，精密吸取混標溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 μL 分別平行進樣兩針，計算平均峰面積。以進樣量X（μg）為橫坐標，對照品峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。建立色譜峰面積對進樣量的回歸方程（表3），結果表明，各成分在檢測的濃度范圍內線性關系良好。

2.4 精密度考察

取同一樣品溶液，連續(xù)進樣6次，進樣量均為1 μL，記錄峰面積值，計算RSD 值，結果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD 分別為0.7%，0.8%，0.5%，0.8%，其他各色譜峰峰面積和相對保留時間精密度均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性考察

取樣品6份，分別按樣品處理方法制備樣品溶液，并進樣測定，記錄峰面積，計算各指標性成分含量。結果鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀平均含量分別為17.32，9.63，56.95，9.27 mg?g-1；RSD分別為1.4%，1.4%，1.0%，1.1%；其他色譜峰峰面積和相對保留時間重復性RSD 值均小于3%。表明該方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一樣品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h 進樣測定，進樣量均為1 μL。結果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為1.3%，1.5%，1.1%，1.3%，其他各色譜峰峰面積和相對保留時間精密度均小于3%，表明樣品溶液在24 h 內基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率考察

取已知4 個生物堿指標性成分含量的黃連粉末6份，每份50 mg，每份分別加入用甲醇配制的混合對照品溶液50 mL（鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀濃度分別為17.064 μg?mL-1，8.912 μg?mL-1，55.648 μg?mL-1，8.466 μg?mL-1），稱定重量，超 聲（250 w，50 kHz）使溶解，放冷，用甲醇配制的混合對照品溶液補足重量，過濾，取續(xù)濾液，進樣1 μL測定。根據(jù)測得的各成分的量，計算各成分的加樣回收率和RSD（表4）。

表3 4種生物堿類成分的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍

2.8 多批次黃連樣品指標性成分含量測定結果

取31 批次黃連粉末各0.1 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進樣1 μL，測定峰面積，按照外標一點法計算各成分含量（表5）。

2.9 多批次黃連樣品特征圖譜質量表征結果

取31 批次黃連粉末各0.1 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進樣1 μL，記錄黃連樣品特征圖譜及特征圖譜峰面積值。對比31 批次特征圖譜發(fā)現(xiàn)，31 批次不同產(chǎn)地黃連藥材特征圖譜特征峰數(shù)量無明顯差異，均檢測到18 個特征色譜峰，但特征峰峰面積值差異較大，1 號、2 號、4 號、5 號未知類成分色譜峰峰面積值可直觀看出較明顯差異（圖2）。

以鹽酸小檗堿為對照，分別計算黃連特征圖譜中11、12、13、14 號色譜峰對應生物堿類成分含量，并計算生物堿成分總含量（表6）；以色譜峰面積值/稱樣量，計算黃連特征圖譜中1-10號非生物堿類成分含量表征值（表7）；以鹽酸小檗堿色譜峰為參比，計算18個特征峰相對峰面積比值（表8）。

2.10 不同批次黃連藥材整體質量表征差異分析

結合表6、表7中黃連藥材生物堿類成分含量和非生物堿類成分相對含量，對31批次黃連藥材按質量差異分3 次排列分類：①以生物堿類成分總含量為指標由低到高排列，取低于總樣本中位值的黃連藥材批次歸為第3 級；②余下批次以酚類成分相對含量總和為指標由低到高排列，取值低于總樣本中位值的黃連藥材批次歸為第2 級；③余下批次以其他類成分相對含量總和為指標由低到高排列，取值高于總樣本中位值歸為第1 級，余下批次歸為第2 級；排列結果見表9。關聯(lián)黃連藥材樣品產(chǎn)區(qū)來源可知，第1 級主要來源于四川和重慶1 產(chǎn)區(qū)；第2 級主要來源于四川產(chǎn)區(qū)和部分重慶1 產(chǎn)區(qū)、湖北產(chǎn)區(qū)；第3 級主要來源于重慶2 產(chǎn)區(qū)、湖北產(chǎn)區(qū)和部分重慶1產(chǎn)區(qū)。

表5 31批次黃連樣品含量測定結果（n=2）

圖2 編號s8、s6、s5、s22、s25、s26號黃連藥材特征圖譜對比圖

表6 以鹽酸小檗堿為對照的31批次黃連藥材生物堿含量表征（mg·g-1）

2.11 不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材整體質量表征差異分析

（1）不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材生物堿類成分含量表征差異分析

根據(jù)表6結果，分別對應黃連藥材產(chǎn)地信息，以31批次黃連藥材中各生物堿成分含量中位值為標準，統(tǒng)計各產(chǎn)區(qū)高于中位值的黃連藥材樣本量，由表10 可知，31 批次黃連藥材總樣本量中，重慶1 產(chǎn)區(qū)樣品11號色譜峰生物堿成分含量高于中位值的黃連藥材批次占比明顯較其他產(chǎn)區(qū)多；四川產(chǎn)區(qū)樣品12-18 號色譜峰生物堿成分含量和生物堿成分總含量高于中位值的黃連藥材批次占比較多，其次為重慶1產(chǎn)區(qū)；四川和重慶1產(chǎn)區(qū)黃連藥材生物堿類成分含量較高。

（2）不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材非生物堿類成分含量表征差異分析

根據(jù)表7結果，分別對應黃連藥材產(chǎn)地信息，以31批次黃連藥材中各非生物堿類成分含量中位值為標準，統(tǒng)計各產(chǎn)區(qū)高于中位值的黃連藥材樣本量，由表11 可知，31 批次總樣本量中，四川產(chǎn)區(qū)樣品1、5 號色譜峰表征值高于中位值的黃連藥材批次占比明顯較其他產(chǎn)區(qū)多；四川和重慶1 產(chǎn)區(qū)樣品2、4、7、9、10 號色譜峰表征值，酚類成分含量表征總和，其他成分含量表征總和，高于中位值的黃連藥材批次占比均較多；4個產(chǎn)區(qū)樣品3、6、8號色譜峰表征值高于中位值的黃連藥材批次占比相近；四川和重慶1 產(chǎn)區(qū)黃連藥材非生物堿類成分含量表征較高，重慶1 產(chǎn)區(qū)酚類成分含量略高于四川產(chǎn)區(qū)，四川產(chǎn)區(qū)其他類成分含量略高于重慶1產(chǎn)區(qū)。

表7 31批次黃連藥材非生物堿類成分含量質量表征值（AU·mg-1）

（3）不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材整體質量表征差異分析

以31批黃連藥材特征圖譜相對峰面積值為數(shù)據(jù)，采用SIMCA-P12.0 統(tǒng)計軟件PLS-DA 模型，以黃連藥材不同產(chǎn)區(qū)為分類，經(jīng)統(tǒng)計分析得到PLS-DA 得分散點圖和載荷散點圖、變量重要性因子分布圖（表7，圖3，圖4，圖5）。

從得分圖中可以看出樣品的聚集以及離散程度，即樣品分布點越聚集，這些樣品中所含有的成分含量比值越接近，反之樣品點較分散時，則說明成分含量比值差異越大。圖中可見4 個產(chǎn)區(qū)黃連藥材有所交叉。其中四川產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量相對較為集中區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)主要集中在第三、四象限，部分分散與第一象限與重慶1 產(chǎn)區(qū)交叉；重慶1 產(chǎn)區(qū)分為兩部分，一部分分布于第一象限與四川產(chǎn)區(qū)交叉，一部分分布于第二象限與重慶2 和湖北產(chǎn)區(qū)交叉；重慶2 產(chǎn)區(qū)和湖北產(chǎn)區(qū)都聚集于第二象限，相互交叉（圖3）。

表8 以鹽酸小檗堿為參比的31批次黃連藥材特征圖譜特征峰相對峰面積值

在載荷圖中，每一個點代表一個成分相對峰面積值，距離原點（0，0）較遠的點，決定樣品區(qū)分中的作用越大；由圖4結合圖5變量重要性投影（VIP）值，VIP值大于1 的色譜峰有9 個。第一象限主成分有9 號色譜峰；第二象限主成分有11、6、8 號色譜峰；第三象限主成分有1 號色譜峰；第四象限主成分有13、2、5、12 號色譜峰（圖4）。

綜上分析可知，重慶1 產(chǎn)區(qū)和四川產(chǎn)區(qū)部分黃連藥材以第一象限主成分9號色譜峰相對含量為主要相關成分；湖北、重慶2、重慶1產(chǎn)區(qū)黃連藥材以第二象限主成分11、6、8號色譜峰相對含量為主要相關成分；四川產(chǎn)區(qū)黃連藥材以第三、四象限主成分1、13、2、5、12號色譜峰相對含量為主要相關成分。

（4）不同批次黃連藥材質量分類關聯(lián)不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材整體質量表征差異分析

關聯(lián)不同批次黃連質量分類結果和不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量PLS-DA 分析結果，如圖6 所示，第一級黃連藥材主要聚集于第一象限，主成分為9（酚類）號色譜峰；第二級黃連藥材主要聚集于第三、四象限，主成分為1（未知）、13（黃連堿）、2（酚類）、5（其他）、12（生物堿）色譜峰；第三級黃連藥材主要聚集于第二象限，主成分為11（生物堿）、6（酚類）、8（未知）號色譜峰。

表9 31批黃連藥材分類結果

表10 不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材生物堿類含量差異分析

3 討論

綜上分析可知，不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量表征為，四川產(chǎn)區(qū)黃連藥材生物類成分、其他類成分高含量占比較多，重慶1 產(chǎn)區(qū)黃連藥材酚類成分高含量占比較多，其中四川產(chǎn)區(qū)樣品具有明顯1、5 號色譜峰成分高含量特征，重慶1 產(chǎn)區(qū)樣品具有明顯11 號色譜峰成分高含量特征；以生物堿類成分含量和非生物堿類成分相對含量同時考量，可將黃連藥材分為3類：第一級黃連藥材主要來源于四川、重慶產(chǎn)區(qū)，以鹽酸小檗堿為參比的9（酚類）號色譜峰成分相對含量為主要相關成分；第二級黃連藥材主要來源于四川、重慶產(chǎn)區(qū)，以鹽酸小檗堿為參比的1（未知）、13（黃連堿）、2（酚類）、5（其他）、12（生物堿）號色譜峰成分相對含量為主要相關成分；第三級黃連藥材主要來源于湖北、重慶、四川產(chǎn)區(qū)，以鹽酸小檗堿為參比的11（生物堿）、6（酚類）、8（未知）號色譜峰成分相對含量為主要相關成分。

表11 不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材非生物堿類成分相對含量表征差異分析

圖3 不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量PLS-DA分析得分分布圖

黃連藥材以生物堿類成分為主要有效物質基礎，生物堿類成分含量可達10%以上，其中以小檗堿含量為主，但研究發(fā)現(xiàn)黃連藥材藥效作用與其不同生物堿類成分含量比例相關，與生物堿和非生物堿類成分比例相關，因此，黃連藥材質量評價不能單以小檗堿成分含量高低作為單一指標[3,5,11]，根據(jù)黃連藥材整體質量相對含量差異，將黃連藥材分為3 類，包括了黃連“味連”藥材3 大主要產(chǎn)區(qū)黃連藥材的質量類型，后續(xù)可針對對不同質量表征類型黃連藥材開展藥效表征研究，加以評價黃連藥材質量。

圖6 不同批次黃連藥材質量分類結合不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量PLS-DA分析得分分布圖

本文建立了UPLC-PDA 測定黃連藥材生物堿和非生物堿類成分特征圖譜，已成功用于多批次不同產(chǎn)區(qū)黃連藥材質量差異分析，該方法簡捷、穩(wěn)定、準確，可在20分鐘內完成黃連藥材整體質量分析，可為黃連藥材質量評價提供方法。