乙型腦炎病毒可視化分型基因芯片的制備

薛斐 ，辛舒，2，田宇飛，孫文超，2，溫樹波，2，閻富龍，2，盛媛，2，王茂鵬，3，朱羿龍，3，田明堯，金寧一

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，省部共建吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；3.吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062

乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒（Japanese en?cephalitis virus，JEV），屬披膜病毒科黃病毒屬，為單股RNA病毒，由其引起的疾病稱為乙型腦炎。乙型腦炎是一種中樞系統(tǒng)人畜共患急性傳染病，以高熱和狂暴、抑郁等神經(jīng)癥狀為特征[1]。三帶喙庫蚊為JEV的主要傳播媒介，豬是主要的傳染源，病毒通常在豬-蚊-蚊或人等動物間循環(huán)[2]。

基于進(jìn)化樹分析對JEV進(jìn)行分型的方法有2種，一種依據(jù)PrM蛋白基因進(jìn)行分型[3-4]，另一種則依據(jù)E蛋白基因進(jìn)行分型[5]。由于PrM基因長度較短，使得分析結(jié)果存在一定程度的可變性，所以根據(jù)E蛋白基因序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析已逐漸成為主要的分型方法。依據(jù)E蛋白基因序列，可將JEV分為5種基因型（Ⅰ～Ⅴ）。JEV主要在亞洲流行，我國目前分離到的毒株有Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型[3-4]，但主要是Ⅰ型和Ⅲ型。

目前，乙型腦炎診斷方法主要有血清學(xué)診斷、分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法[6]，一次試驗(yàn)一般只能檢測樣品中的一種基因型，樣品量較大時不能在短時間內(nèi)提供檢測結(jié)果。因此，建立一種具有同步檢測和鑒別診斷功能的快速、靈敏、高效的診斷方法有重要意義。我們擬設(shè)計(jì)JEV型特異性探針，用于對JEV基因的分型檢測，以期為JEV的快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測提供有效的檢測技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料

含JEV-Ⅰ PrM和E基因（GenBank登錄號：AF045551.2）的質(zhì)粒、含基孔肯亞病毒（CHIKV）E基因（GenBank登錄號：FJ95103）的質(zhì)粒、含辛德比斯病毒（SINV）E基因（GenBank登錄號：U38305）的質(zhì)粒均由Blue Heron生物技術(shù)公司合成；含JEV-ⅢPrM和E基因（GenBank登錄號：JN604986.1）的質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；2×Taq PCR Master Mix購自天恩生物有限公司；Simply P總RNA提取試劑盒購自BioFlux公司；Axyprep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和Axyprep DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；鏈霉親和素標(biāo)記納米金和銀染試劑購自NanoProbes公司；SDS、20×SSC購自Promega公司；點(diǎn)樣緩沖液、光學(xué)級醛基基片、芯片雜交盒、芯片蓋玻片等購自北京博奧生物有限公司；生物素標(biāo)記的特異性引物（上游引物為5'-BIOTIN-AAGCTTyTGATGACCATCA AC-3'，下游引物為5'-AAGCTTyTGATGACCATCA AC-3'）及氨基修飾寡核苷酸探針（表1）由上海生工生物工程有限公司合成。

Micro GridⅡ610基因芯片點(diǎn)樣儀（Genomic So?lutions公司）；離心濃縮儀（Eppendrof公司）；Genepi×personal 4100A掃描儀（Axon公司）；TC-512型PCR儀（Techne公司）；IF-Ⅲ分子雜交爐（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金南儀器制造有限公司）。

1.2 探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ基因組序列，用BLAST、Accelrys Gene和Array Designer 4.0等生物信息學(xué)軟件，按照探針設(shè)計(jì)基本原則，設(shè)計(jì)1條陽性對照探針和3條用于檢測的18～21 mer Oligo探針（表1），探針終濃度為50 μmol/L，將點(diǎn)樣液與探針等體積混勻，加入384孔板中，-20℃保存。

1.3 陣列設(shè)計(jì)、打印及玻片處理

芯片微陣列設(shè)計(jì)為3×3陣列，每個位點(diǎn)包含一種探針的一個4×4陣列（圖1）。用Micro GridⅡ610基因芯片點(diǎn)樣儀將探針有序地打印在玻片上，將醛基玻片放入雜交盒中，于37℃恒溫箱中固定12 h，固定結(jié)束后用37℃預(yù)熱的洗滌液（2 g/L SDS）清洗2 min，在雙蒸水中清洗1 min，最后放在封閉液中封閉5 min，用雙蒸水洗脫，離心甩干。

1.4 雜交與檢測

將PCR產(chǎn)物加熱至96℃變性5 min，立即取出并冰浴3 min，每一個樣品取15 μL PCR變性產(chǎn)物，與5 μL上游引物和20 μL雜交緩沖液混勻，將混合物加至芯片陣列孔上，將雜交盒置42℃水浴4 h；雜交結(jié)束后取出芯片，立即放入42℃預(yù)熱的洗液Ⅰ（2×SSC，1 g/L SDS）、洗液Ⅱ（0.1×SSC，1 g/L SDS）、洗液Ⅲ（0.1×SSC），在42℃雜交爐中各清洗2 min，雙蒸水洗脫1 min，離心甩干，置4℃保存；加入鏈霉親和素標(biāo)記的納米金（用1×PBS+5 g/L BSA 1∶400稀釋），40 μL/孔，37℃水浴 25 min，用 1×PBS洗脫 2 min，雙蒸水洗脫1 min，離心甩干；每孔加入銀染A液和銀染B液各20 μL混勻，37℃孵育5 min，雙蒸水洗脫，離心甩干，重復(fù)操作，37℃孵育2 min，雙蒸水洗脫；肉眼觀察可見明顯陽性信號，也可用普通掃描儀或照相機(jī)記錄。

1.5 芯片特異性試驗(yàn)

分別提取本實(shí)驗(yàn)室保存的藍(lán)耳病病毒（PRRSV，長春株）、豬新城疫病毒JL01株（由本室2000年分離保存）、H9N2型禽流感病毒（由本室2004年分離保存）雞胚尿囊液的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用已設(shè)計(jì)好的特異性引物進(jìn)行PCR；另外，以含基孔肯亞病毒E基因的質(zhì)粒、含辛德比斯病毒E基因的質(zhì)粒、JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的含PrM和E基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR。將以上6種PCR產(chǎn)物分別與芯片雜交，進(jìn)行可視化，用普通掃描儀掃描結(jié)果。

表1 JEV寡核苷酸探針即序列

圖1 芯片3×3陣列圖

1.6 芯片靈敏性試驗(yàn)

測定JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ質(zhì)粒質(zhì)量濃度分別為40.8和 44.2 μg/mL，計(jì)算初始拷貝數(shù)分別為 8.1×1013和7.9×1013拷貝/mL，然后用ddH2O分別將JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質(zhì)粒進(jìn)行1/10梯度稀釋，以稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，與芯片雜交，實(shí)現(xiàn)可視化。

1.7 芯片重復(fù)性試驗(yàn)

分別以JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ的含PrM和E基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，應(yīng)用同批5片芯片、不同批5片芯片分別進(jìn)行雜交，以檢測不同批次芯片制備的重復(fù)性及同一批次芯片的同一性。

2 結(jié)果

2.1 芯片雜交試驗(yàn)

分別以含JEV-Ⅰ或JEV-Ⅲ的PrM和E基因的重組質(zhì)粒為模板，用生物素修飾的特異性引物進(jìn)行PCR，得到460 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期相符。

預(yù)雜交的芯片滴加5 μL 5'端生物素修飾的上游引物、15 μL生物素修飾的PCR變性產(chǎn)物和20 μL雜交緩沖液混合物，在42℃水浴鍋中雜交4 h，經(jīng)可視化后用普通掃描儀掃描，結(jié)果見圖3，1號陽性坐標(biāo)探針即Ynyxdz探針、2號探針即Yn0b探針處均有陽性信號，JEV-Ⅰ掃描結(jié)果中3號探針即Yn1b探針處有信號，JEV-Ⅲ掃描結(jié)果中4號探針即Yn3a探針處有信號。由此可知，2號探針可用于鑒定JEV，3號和4號探針可用于JEV的分型。

2.2 特異性試驗(yàn)

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 JEV鑒定及分型可視化結(jié)果

將1.5中描述的6種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交，可視化后用普通掃描儀掃描芯片。結(jié)果表明，藍(lán)耳病病毒、豬新城疫病毒、禽流感病毒、基孔肯亞病毒、辛德比斯病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物除陽性坐標(biāo)探針有信號外，其他探針均無陽性信號，JEV的2種亞型質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后能同時檢出陽性信號（圖4）。

2.3 靈敏性試驗(yàn)

用ddH2O分別將JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質(zhì)粒按一定比例稀釋后進(jìn)行PCR，當(dāng)質(zhì)粒至105拷貝/mL時，PCR產(chǎn)物電泳條帶難以辨認(rèn)，當(dāng)稀釋至104拷貝/mL時已無條帶出現(xiàn)（圖5）。

以稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交，用掃描儀掃描，結(jié)果見圖6。當(dāng)JEV-Ⅰ稀釋至8.1×105拷貝/mL時有微弱信號，稀釋至8.1×104拷貝/mL或更低時，未檢測到陽性信號。當(dāng)JEV-Ⅲ質(zhì)粒為7.9×105拷貝/mL時，除陽性坐標(biāo)探針有信號外，2號和4號探針仍有微弱信號；當(dāng)稀釋至7.9×104拷貝/mL或更低時，未檢測到陽性信號。

圖4 PCR（A）與芯片（B）檢測JEV的特異性試驗(yàn)

圖5 JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質(zhì)粒梯度稀釋后PCR產(chǎn)物電泳圖

圖6 芯片檢測JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ質(zhì)粒的靈敏度試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別以JEV-Ⅰ、JEV-Ⅲ含PrM和E基因的2種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增出的熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與芯片雜交。隨機(jī)抽取同一批次制備的芯片5張，在同一條件下進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性，表明同批制作的芯片具有同一性；隨機(jī)抽取不同批次制備的芯片5張，在相同條件下進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性，說明不同時間制備的芯片重復(fù)性、穩(wěn)定性好。

3 討論

利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行人和動物疫病的檢測是未來疾病診斷的一個發(fā)展方向?；蛐酒瑱z測技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可從核酸水平對病原進(jìn)行檢測，而且可將多種不同病原的探針集成到同一張芯片上，對相關(guān)病原同時進(jìn)行檢測，還可以做到對病原體進(jìn)行血清型和毒力的區(qū)分。基因芯片技術(shù)對病原微生物進(jìn)行基因分型最為突出的例子是在肝炎病毒研究方面。目前研究較多的是利用短Oligo基因芯片對流感病毒[7-8]、HIV、人乳頭瘤病毒[9]、輪狀病毒[10]、肝炎病毒[11]等進(jìn)行基因分型。Lin等[12]建立的Oligo基因芯片可檢測9種呼吸道病毒（流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠狀病毒、副流感病毒等）和9種其他呼吸道病原體（炭疽桿菌、百日咳桿菌、肺炎衣原體、土拉菌、肺炎支原體、耶爾森菌等），采用多重PCR擴(kuò)增病原體基因，可對臨床標(biāo)本中以上病原體進(jìn)行種及分離株的檢測及分型。

在本研究中，我們制備了針對Ⅰ型與Ⅲ型JEV的分型及鑒定基因芯片。我們根據(jù)GenBank中的JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的PrM和E基因序列差異，設(shè)計(jì)出JEV分型引物及寡核苷酸探針，且引物5'端帶有生物素修飾，其中1號探針作為陽性坐標(biāo)探針。實(shí)驗(yàn)證明，探針濃度為50 μmol/L時雜交信號可達(dá)到飽和，效果最佳。通過37℃水浴固定、2 g/L SDS清洗和2.5 g/L NaHB4封閉后，將稀釋的探針固定于醛基化玻片上，分別以含JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ的PrM和E基因的2種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物與探針在42℃[13]雜交爐中雜交，通過可視化獲得肉眼可見結(jié)果。普通掃描結(jié)果顯示，除陽性坐標(biāo)探針外，共有3條寡核苷酸檢測探針特異地與相應(yīng)的標(biāo)記樣品雜交，芯片上呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性雜交信號，其中2號探針一直能出現(xiàn)信號，說明2號探針可用于鑒定JEV。3、4號探針可分別用于鑒定JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ。通過特異性、靈敏度及重復(fù)性試驗(yàn)的驗(yàn)證，制備的基因芯片具有病毒特異性和可靠的重復(fù)性，靈敏度比PCR高10倍。以上結(jié)果表明，本研究制備的基因芯片可為JEV的檢測及分型提供一種快速、準(zhǔn)確、高通量的方法。

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