內(nèi)皮和造血系統(tǒng)特異性敲除Rictor基因?qū)μジ卧煅挠绊?/h1>

2014-10-27 09:04:36穆曉環(huán)王偉麗趙云澤倪艷麗李專顧潔張麗艷汪曉敏程濤劉漢芝袁衛(wèi)平劉兵

生物技術(shù)通訊訂閱 2014年3期 收藏

關(guān)鍵詞：基因型胚胎干細(xì)胞

穆曉環(huán)，王偉麗，趙云澤，倪艷麗，李專，顧潔，張麗艷，汪曉敏，程濤，劉漢芝，袁衛(wèi)平，劉兵

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所，血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院腫瘤學(xué)研究室，北京 100071

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是哺乳動(dòng)物雷帕霉素的作用靶點(diǎn)[1]，調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理活動(dòng)[2]。mTOR可以形成2種蛋白復(fù)合體mTORC1和mTORC2，而Rictor（rapamy?cin-insensitive companion of TOR）是mTORC2不可或缺的組成部分[3]。mTORC2影響PI3K-Akt通路中Akt S473位點(diǎn)的磷酸化，PI3K-Akt通路不僅在感受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與抑制中起重要作用，而且其調(diào)節(jié)異常時(shí)還會(huì)誘發(fā)腫瘤的生成[4]。雖然mTOR信號(hào)通路一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，但有關(guān)胚胎造血中Rictor的研究幾乎空白。通過(guò)探討Rictor對(duì)胚胎造血的影響，將有利于研究血液系統(tǒng)腫瘤及研發(fā)靶向治療的新藥。

在胚胎發(fā)育過(guò)程中，第一個(gè)造血干細(xì)胞（hema?topoietic stem cell，HSC）出現(xiàn)在主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)（aorta-gonad-mesonephros region，AGM區(qū)），隨后出現(xiàn)在胎盤、卵黃囊[5]。近來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)頭部與AGM區(qū)類似，是造血干細(xì)胞產(chǎn)生的又一位點(diǎn)[6]。不同位點(diǎn)產(chǎn)生的造血前體細(xì)胞或造血干細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)遷移到胎肝，在胎肝中成熟或擴(kuò)增[7]。研究表明，胚胎第12 d（E12.0）小鼠胎肝約含有100個(gè)造血干細(xì)胞，在E15達(dá)到頂峰，大約擴(kuò)增10倍左右[8]。

基于Cre-LoxP的條件基因打靶技術(shù)為造血發(fā)育的研究帶來(lái)新的機(jī)遇，Cre轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的細(xì)胞譜系示蹤策略可為造血干細(xì)胞起源研究提供最有力的生理證據(jù)。2008～2009年，利用VEC-Cre（vascular en?dothelial cadherin-Cre）轉(zhuǎn)基因小鼠的譜系示蹤系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的命運(yùn)，Iruela-Arispe和Speck先后證明一群特殊的血管內(nèi)皮細(xì)胞（而非間質(zhì)細(xì)胞或其他中胚層前體）是造血干細(xì)胞發(fā)育的直接前體[9-10]。而Vav1-Cre能夠示蹤所有的血細(xì)胞[11]。通過(guò)這2種小鼠模型，可以準(zhǔn)確地觀察特定基因?qū)υ煅l(fā)生不同階段的作用。

我們利用 VEC-Cre、Vav1-Cre與 Rictorf/f小鼠特異性基因敲除系統(tǒng)，在小鼠發(fā)育過(guò)程中特異性敲除具有VEC啟動(dòng)子活性或Vav1啟動(dòng)子活性的細(xì)胞中的Rictor基因，在E15左右取出胎肝，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析在內(nèi)皮及造血系統(tǒng)特異敲除Rictor基因后對(duì)胎肝造血的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Rictorf/f小鼠及Vav1-Cre小鼠均來(lái)自天津血液學(xué)研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，VEC-Cre小鼠由清華大學(xué)郭偉教授惠贈(zèng)，均在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)；普通PCR試劑TransStart Fast Pfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物購(gòu)自Invitrogen公司；流式抗體 Lin-Biotin（Ter119、GR-1、Mac-1、B220、CD3、CD4、CD8）、SAVAPC-CY7、Sca-1 APC、c-Kit PE-Cy7、CD150 PE、CD48 FITC、GR-1 PE-Cy7、Mac-1 PE-Cy7、AA4.1 PE-Cy7、CD19 APC均購(gòu)自eBioscience公司；DNA濃度測(cè)定儀器為Thermo公司的NANODROP 2000；PCR儀器為ABI公司的2720 Thermal Cycler；流式細(xì)胞分析及分選所用的儀器為BD公司的FACSAriaⅡ；流式細(xì)胞分析軟件為FlowJo 7.6，數(shù)據(jù)分析軟件為GraphPad Prism5，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法為t檢驗(yàn)。

1.2 小鼠繁育及胚胎的處理

雄鼠Rictorf/+;VEC-Cre+由Rictorf/f小鼠與VECCre+小鼠交配所得；雄鼠Rictorf/+;Vav1-Cre+由Rictorf/f小鼠與Vav1-Cre+小鼠交配所得；分別與雌鼠Rictorf/f合籠，第2 d檢查陰道栓，見(jiàn)栓的當(dāng)天中午為E0.5，于E15解剖孕鼠取出胚胎。解剖所得胎肝，置于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，用1 mL射器吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，置于4℃?zhèn)溆?。取相?yīng)的胚胎鼠尾進(jìn)行基因型鑒定。

1.3 小鼠及胚胎基因型的鑒定

將小鼠腳趾或胚胎鼠尾裂解并提取其基因組DNA，測(cè)定濃度，調(diào)節(jié)DNA濃度為100～200 ng/μL。配置 PCR 反應(yīng)體系 25 μL，包括 5×緩沖液 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，F(xiàn)ast Pfu DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 14 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各2 μL。Rictor正義引物為5'-ACTGAATATGT TCATGGTTGTG-3'，反義引物為5'-GAAGTTATTC AGATGGCCCAGC-3'；VEC-Cre正義引物為 5'-GC CTGCATTACCGGTCGATGC-3'，反義引物為5'-CA GGGTGTTATAAGCAATCCC-3'；Vav1-Cre正義引物為5'-AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG-3',反義引物為5'-ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC-3'；內(nèi)參基因正義引物為5'-GAAGTTATTCAGATG GCCCAGC-3'，反義引物為5'-GAAGTTATTCAGAT GGCCCAGC-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，然后以95℃變性20 s、56℃退火20 s、72℃延伸15 s行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物每管加5 μL 6×DNA上樣緩沖液，進(jìn)行EB染色的2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.4 流式分析及分選

野生型（WT），Rictor敲除型（KO）的胎肝細(xì)胞于4℃、310 r/min離心5 min，棄上清，用 100 μL含0.1%BSA的PBS重懸，按流式抗體說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣本加定量的流式抗體進(jìn)行標(biāo)記，4℃反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)移至流式管中，加2 mL PBS洗去非特異結(jié)合的抗體，再用200～300 μL 含0.1%BSA的PBS重懸，過(guò)濾膜，進(jìn)行流式分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型的鑒定

Rictor基因的特異性敲除是利用Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的（圖1A）。鑒定基因型時(shí)，取每只胚胎鼠尾，裂解后利用異丙醇抽提的方法提取基因組DNA，再通過(guò)PCR擴(kuò)增特定條帶，經(jīng)EB染色的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型（圖1B）。其中，VEC-Cre誘導(dǎo)敲除的KO為Rictorf/f;VEC-Cre；Vav1-Cre誘導(dǎo)敲除的KO為Rictorf/f;Vav1-Cre，WT為Rictorf/f或Rictorf/+。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor后對(duì)各系細(xì)胞的影響

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor后E15胎肝中各系細(xì)胞比例的變化。用CD3富集T細(xì)胞，用Gr-1和Mac-1富集粒-單核系（GM）細(xì)胞，用CD19富集B細(xì)胞。結(jié)果表明，用VEC-Cre（圖2A）和Vav1-Cre（圖2B）2種條件敲除Rictor基因后胎肝各系細(xì)胞比例均降低。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor基因后對(duì)B細(xì)胞的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Rictor基因?qū)Τ审w造血系統(tǒng)各系細(xì)胞的影響以B系最為明顯[13]。因此，我們進(jìn)一步用AA4.1和CD19富集胎肝B細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后E15胎肝中B細(xì)胞比例的變化，結(jié)果也表明用2種條件敲除Rictor基因后胎肝B細(xì)胞比例降低（圖3）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Ric?tor基因后對(duì)HSC的影響

圖1 小鼠基因型鑒定

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre（A）和Vav1-Cre（B）敲除Rictor基因后各系細(xì)胞比例的變化

LSK（Lin-Sca-1+c-Kit+）是富集HSC最常用的表面標(biāo)志。造血干細(xì)胞又分為長(zhǎng)期造血干細(xì)胞（LTHSC）和短期造血干細(xì)胞（ST-HSC），其中LT-HSC可以恢復(fù)致死劑量照射后的受體的終身造血能力。LT-HSC常用的富集標(biāo)志為SLAM（Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-）[12]。我們利用LSK和SLAM表型組合分析了VEC-Cre和Vav1-Cre特異敲除Rictor基因后HSC的變化。首先取出E15胎肝，吹打成單個(gè)細(xì)胞并標(biāo)記熒光抗體，鑒定基因型后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析WT組與KO組E15小鼠胚胎胎肝的LSK和SLAM比例。結(jié)果顯示，用2種條件敲除Rictor基因后，KO組胎肝中HSC的比例均明顯降低（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

HSC的自我更新和多向分化特性使之可以在整個(gè)生命過(guò)程中為機(jī)體提供不同階段、所有類型的血細(xì)胞，在這一過(guò)程中，多種信號(hào)通路及其基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，當(dāng)調(diào)節(jié)異常時(shí)則會(huì)導(dǎo)致白血病等血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生。例如在急性髓系白血?。ˋML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)異常，其中包括mTOR和Rictor表達(dá)異常，這說(shuō)明mTOR信號(hào)通路及Rictor的異常與白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)[14]。并且，mTORC2和Rictor對(duì)成體造血有調(diào)節(jié)作用[13]。為了進(jìn)一步研究Rictor在HSC尤其是胚胎造血中的作用，我們利用針對(duì)內(nèi)皮系統(tǒng)（VEC-Cre）和造血系統(tǒng)（Vav1-Cre）的2種條件敲除小鼠，特異性地敲除Rictor基因，在E15胎肝中的造血干細(xì)胞數(shù)量及比例達(dá)到峰值時(shí)，觀察Rictor基因敲除對(duì)造血系統(tǒng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是內(nèi)皮系統(tǒng)還是血液系統(tǒng)敲除Rictor基因后，胎肝中的造血干細(xì)胞及各系細(xì)胞比例均有所降低。這表明Rictor基因在胚胎造血發(fā)育中發(fā)揮促進(jìn)作用，當(dāng)其表達(dá)異常時(shí)，胎肝的造血發(fā)育則受到阻礙。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后B細(xì)胞的變化

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析VEC-Cre和Vav1-Cre敲除Rictor基因后HSC比例的變化

HSC能夠產(chǎn)生所有類型的血細(xì)胞，但Rictor基因敲除后對(duì)不同類型細(xì)胞的影響卻不一樣，在成體造血的研究中敲除Rictor基因，HSC向各系的分化不平衡，向B系分化的減少更明顯[13]。本研究Rictor基因敲除后各系細(xì)胞比例均降低，以B細(xì)胞最為明顯，基本與成體中Rictor基因敲除后對(duì)造血的影響一致。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，同樣是E15的胎肝，VEC組和Vav1組的WT中各系細(xì)胞比例卻不同，Vav1組的WT中各系細(xì)胞比例明顯高于VEC組。這可以從以下2個(gè)方面解釋：第一，雖然都是E15的野生型胎肝，但我們從見(jiàn)栓的當(dāng)天中午記為E0.5，所以E15的野生型胎肝也可能存在早晚不同，不同時(shí)間的胎肝中造血干細(xì)胞向各系分化的情況不同，導(dǎo)致Vav1組的WT中各系細(xì)胞比例明顯高于VEC組；第二，不同實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞分析中電壓等不同也會(huì)造成結(jié)果的差異。VEC組和Vav1組中各組組內(nèi)的WT與KO進(jìn)行比較，2組間比例不同并不影響結(jié)果的判定。

綜上所述，內(nèi)皮和血液系統(tǒng)敲除Rictor基因后影響胎肝造血，在血液系統(tǒng)敲除Rictor基因后對(duì)胎肝中各系細(xì)胞的產(chǎn)生也有一定的影響。表明Rictor基因及由其組成的mTORC2信號(hào)通路調(diào)控HSC發(fā)育。但是，該基因在造血發(fā)育過(guò)程中其他時(shí)間點(diǎn)以及對(duì)其他造血位點(diǎn)的影響還有待進(jìn)一步闡明，其調(diào)控造血的機(jī)制也值得進(jìn)一步探討。

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