親子鑒定中四配子異源嵌合體報道1例

陳 芳，陳 儉，付 穎，黃 瓊

（浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000；浙江大學(xué)司法鑒定中心，浙江 杭州 310000）

1 簡要案情

2013年6月，當(dāng)事人李某帶著女兒來鑒定中心，要求鑒定是否存在親生血緣關(guān)系，在案件受理過程中，當(dāng)事人提出曾經(jīng)去兩家鑒定機構(gòu)做過親子鑒定，且兩家鑒定機構(gòu)鑒定結(jié)論不一致，要求重新鑒定。按照知情同意原則，采集了被鑒定人三份不同的檢材，分別是血樣，口腔拭子及帶毛囊毛發(fā)，并要求當(dāng)事人提供孩子生母血樣。當(dāng)事人李某（以下稱父親）、孩子生母（以下稱母親）及女兒無輸血史，無骨髓移植及放療化療史等，李某女兒外觀正常，女性特征明顯。

2 檢驗方法

2.1 染色體核型檢測

外周血淋巴細胞培養(yǎng)[1]，常規(guī)制備染色體，G顯帶，鏡下計數(shù)及分析核型。

2.2 DNA提取

采用常規(guī)Chelex-100法[2]分別提取父親、母親及女兒血樣、口腔拭子、帶毛囊毛發(fā)檢材DNA，分別采用GoldeneyeTM20A試劑盒（北京基點認知），Identifiler試劑盒（美國AB公司），AGCU21+1試劑盒（無錫中德美聯(lián)）進行39個常染色體STR基因座的分型，采用GoldeneyeTM20Y試劑盒（北京基點認知）進行20個Y-STR基因座的分型，采用Investigator Argus X-12試劑盒（德國QIAGEN）進行12個X-STR基因座的分型，擴增體系和擴增程序按相關(guān)操作手冊進行。

2.3 DNA分型

采用9700型PCR儀（美國AB公司）進行PCR擴增，使用3130型遺傳分析儀（美國AB公司）進行電泳分離，使用 GeneMapper ID v3.2.1 軟件（美國 AB 公司）處理電泳數(shù)據(jù)，實驗過程參照操作手冊和相關(guān)文獻。

3 檢驗結(jié)果

3.1 染色體核型分析

外周血淋巴細胞：核型為46，XX/46，XY兩個細胞系（見圖 1），其中 46，XX（54%），46，XY（46%）。

圖1 李某女兒核型分型圖，顯示有兩個細胞系，分別為46，XX/46，XY

3.2 STR基因分型

在 39個常染色體 STR檢測中（見表 1～2），父親及母親常染色體STR均正常。女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)檢材基因分型一致，在D19S433、D21S11、D18S51、CSF1PO、D8S1179、D2S1338、D22S1045 等 7個基因座出現(xiàn)三等位基因，且在D5S818、D3S1358、D2S441、D1S1677等4個基因座出現(xiàn)等位基因峰高不均衡現(xiàn)象，并且Amelogenin基因座均擴增出等位基因Y，且等位基因X和Y峰高不均衡（見圖2）。

圖2 依次為父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體STR分型圖

D19S433基因座，有3個等位基因12.2/13/14，峰高不均衡，父親的兩個等位基因12.2/14全部遺傳給子代，等位基因13來源于母親；D21S11基因座，有3個等位基因31/32.2/33.2，峰高不均衡，父親的2個等位基因31/33.2全部遺傳給子代，等位基因32.2來源于母親；D18S51基因座，有3個等位基因16/19/21，峰高不均衡，父親的2個等位基因16/19全部遺傳給子代，等位基因21來源于母親；CSF1PO基因座，有3個等位基因10/11/12，峰高不均衡，父親的2個等位基因10/11全部遺傳給子代，等位基因12來源于母親，D8S1179基因座，有3個等位基因10/12/15，峰高不均衡，父親的2個等位基因10/15全部遺傳給子代，等位基因12來源于母親；D2S1338基因座，有3個等位基因17/19/23，峰高不均衡，父親的2個等位基因17/19全部遺傳給子代，等位基因23來源于母親；D22S1045有3個等位基因11/15/16，峰高不均衡，父親的2個等位基因11/16全部遺傳給子代，等位基因15 來源于 母 親 ；D5S818、D3S1358、D2S441、D1S1677等基因座，存在等位基因不均衡的現(xiàn)象，因父親與母親有一個相同的等位基因，父親的等位基因全部遺傳給子代，母親遺傳給子代的等位基因與父親相同，故峰高比接近3∶1。以上11個基因提示女兒在血樣、口腔拭子及毛發(fā)中存在著明顯的嵌合現(xiàn)象，存在著兩個不同的細胞系（46，XX/46，XY），且兩個細胞系所占有的比例不一致。

表1 父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體近著絲粒端STR分型結(jié)果

表2 父親、母親、女兒血樣、口腔拭子、毛發(fā)常染色體末梢STR分型結(jié)果

續(xù)表2

分別對血痕，口腔拭子和毛發(fā)檢材采用GoldeneyeTM20Y試劑盒進行19個Y-STR基因座擴增，女兒血樣、口腔拭子及毛發(fā)檢材均擴增出等位基因，且基因座分型與父親基因座分型一致。

分別對血痕，口腔拭子和毛發(fā)檢材采用Investigator Argus X一12試劑盒進行12個X-STR基因座擴增，女兒血樣、口腔拭子及毛發(fā)X-STR分型結(jié)果除Amelogenin基因座外，其它基因座分型結(jié)果一致，女兒血樣、口腔拭子的Amelogenin基因座等位基因為X/Y.峰高不均衡，而毛發(fā)Amelogenin基因座未見Y等位基因，除DXS10146基因座外，女兒血樣，口腔拭子及毛發(fā)檢材等位基因均能從父親及母親中找到來源，DXS10146基因座女兒等位基因為29/30，父親等位基因為30，母親等位基因為30/32，不符合孟德爾遺傳定律，等位基因29找不到來源，推斷女兒在DXS10146基因座發(fā)生基因突變。

12個X－STR基因座檢測中，女兒血樣Amelogenin基因座檢測出Y等位基因，說明有兩個細胞系存在，而其它基因座峰高比基本均衡，女兒口腔拭子Amelogenin基因座也檢測出Y等位基因，說明有兩個細胞系存在，其他基因座等位基因峰高不均衡，來自父親的等位基因峰高明顯比來自母親的等位基因峰低，口腔拭子中46，XY細胞系所占的比例比血樣中46，XY細胞系所占比例高。女兒毛發(fā)檢材Amelogenin基因座未檢測出Y等位基因，且等位基因峰高均衡，未見明顯嵌合現(xiàn)象存在。

通過對女兒血樣，毛發(fā)常染色體STR、Y-STR及X-STR結(jié)果的分析，以上組織均有2個細胞系（46，XX/46，XY）存在，在39個常染色體STR基因座中，均能清楚的顯示其遺傳方式，其中有11個基因座出現(xiàn)三等為基因，三等位基因中有2個是來源父親的，1個是來源于母親的，且來源于母親的等位基因峰高比來源于父親的等位基因峰高兩倍，所有的39個常染色體STR基因座均只有1條母源性等位基因，沒有1個基因座顯示有2個母源性等位基因。12個X-STR基因座中，等位基因1個來源于父親，1個來源于母親，并且部分基因座峰高比接近2∶1，所有的常染色體基因座沒有出現(xiàn)四等位基因，X染色體也沒有出現(xiàn)三等位基因。

4 分析討論

嵌合體也被叫做奇美拉（chimera），在希臘神話中，奇美拉是獅頭，羊身，蛇尾的吐火怪物，在醫(yī)學(xué)界，它指的是人體中的遺傳物質(zhì)并非只是來自一個細胞系，可能來自于兩個或者以上的細胞系所構(gòu)成的生物體，可自發(fā)產(chǎn)生或人工產(chǎn)生。人類嵌合體是極其罕見的，一般是在血型檢測中發(fā)現(xiàn)有2種紅細胞群體或真兩性畸形來就診而被發(fā)現(xiàn)的。

嵌合體在生物學(xué)上可以分為兩種，同源嵌合體和異源嵌合體。嵌合成分來源于同一受精卵的嵌合體稱為同源嵌合體，自發(fā)或者誘發(fā)導(dǎo)致的基因突變以及染色體畸變均可導(dǎo)致同源嵌合體的產(chǎn)生。由2個不同的受精卵融合而形成的個體為異源嵌合體，異源嵌合體[3]可分為人造異源嵌合體（artificial chimerism）、孿生子異源嵌合體（tiwn chimerism）和四配子異源嵌合體（tetragametic chimerism）。人造異源嵌合體大部分是醫(yī)源性的，是由于外周造血干細胞的輸入、異源骨髓移植或器官移植導(dǎo)致的，也可由其他原因產(chǎn)生。異卵雙生導(dǎo)致的血型嵌合是天然的奇美拉，主要是胎盤融合或者子宮內(nèi)造血干細胞的交換而導(dǎo)致的，異卵雙生的孿生子異源嵌合體細胞嵌合僅限于血細胞中，為兩種合子來源的細胞嵌合，據(jù)統(tǒng)計血型奇美拉8%來自雙胞胎，21%來至于三卵多胞胎[3]。在人類中四配子異源嵌合體是極其罕見的，常常由于兩性畸形患者就診或者ABO檢測時發(fā)現(xiàn)2種紅細胞群體而被發(fā)現(xiàn)。由于兩個合子融合并最終發(fā)育成的一個個體而導(dǎo)致的四配子異源嵌合體，這種四配子異源嵌合個體在遺傳學(xué)上含有兩種獨立的細胞系（如46，XX/46，XY細胞系），在鼠類[4-7]和其他哺乳動物[8]中均發(fā)現(xiàn)這種四配子嵌合體，在人類[9，26，28]同樣也已發(fā)現(xiàn)。 根據(jù)文獻推測有4種機制可以導(dǎo)致四配子異源嵌合體的形成[10]：（1）兩個胚胎的融合；（2）卵細胞和第一極體雙受精作用；（3）次級卵母細胞和第一極體雙受精作用；（4）卵細胞和第二極體雙受精作用。人類四配子異源嵌合體的形成機制在目前的文獻報道已發(fā)現(xiàn)了4種，第一種為兩個胚胎的融合[11-14，26]；第二種為卵細胞和第二極體雙受精作用[15]；第三種為卵細胞經(jīng)過孤雌分裂，形成兩個相同的配子，與兩個精子進行雙受精[16-17，23，28]；第四種為產(chǎn)雄孤雌生殖[20-22]。兩個胚胎融合患者常染色體STR檢測顯示含有父源和母源各兩個不同的等位基因，也就是說四個等位基因分別來源于四個配子，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，體外受精[13-14]和卵胞漿內(nèi)單精子注射等技術(shù)增加了胚胎融合的風(fēng)險[18]。卵細胞和第二極體雙受精應(yīng)顯示在遠離染色體著絲粒的位點上有母源的兩個不同的等位基因[19]，因為染色體要發(fā)生交換。卵細胞孤雌分裂形成兩個相同的配子雙受精，在常染色體STR檢測顯示含有兩個父源的等位基因和一個母源的等位基因，因孤雌分裂形成2個相同的配子，DNA完全相同，故顯示只有1個配子成分，也就是說只顯示一個母源的等位基因。本案例中女兒有兩個細胞群，核型為46，XX/46，XY，STR結(jié)果顯示有父源的2個不同配子成分和母源的1個配子成分，因此推斷為四配子異源嵌合體。這種情況可解釋為來自母親的生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子與來自父親的X精子和Y精子雙受精，然后2個合子融合到1個個體，從而形成有2個細胞系的四配子異源嵌合體（見圖3）。由母親生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子雙受精形成2個合子，經(jīng)融合后發(fā)育成的個體，這種四配子異源嵌合體案例目前報道較少見。

圖3 四配子異源嵌合體形成機制圖解，母親的生殖細胞經(jīng)孤雌分裂形成2個相同的配子與來自父親的X精子和Y精子雙受精，然后2個合子融合到一個個體，從而形成有2個細胞系的四配子異源嵌合體

1953年英國醫(yī)學(xué)雜志（the British Medical Journal）報道了第一例血型嵌合體 “一名女子被發(fā)現(xiàn)血液中含有兩種不同的血型”[24]，1962年Gartler etal.[25]報道了第一例由于雙受精作用而導(dǎo)致的人類嵌合體，而美國母親莉迪婭事件[26]揭開了人類的嵌合體現(xiàn)象。到目前為止，報道的人類嵌合體有50余例[27]，隨著醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，人類嵌合體現(xiàn)象越來越常見，目前常用的檢測嵌合體的方法主要有三種：（1）ABO 血型基因分型法；（2）HLA（人類白細胞抗原）法；（3）STR法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，新的檢測方法也不斷在應(yīng)用，2012年，So Youn Shin等[28]首次采用SNP手段對四配子異源嵌合體進行檢測，新的檢測微嵌合體技術(shù)[29]也在不斷發(fā)展中。在親子鑒定中遇到三等為基因或者性分化異常者（存在兩個細胞系46，XX/46，XY），在染色體核型分析的基礎(chǔ)上，首先要確定是同源嵌合體還是異源嵌合體，采用常染色體STR試劑盒進行檢測，如果所有基因座都只顯示1個父源等位基因和1個母源等位基因，可判定為同源嵌合體，如果某些基因座出現(xiàn)2個母源等位基因和 （或）父源等位基因可判定為異源嵌合體。確定為異源嵌合體之后需要明確嵌合體發(fā)生的機制，首先采用常染色體靠近著絲粒STR基因座進行檢測，如果某些基因座出現(xiàn)2個母源等位基因和2個父源等位基因，說明是由于胚胎融合而形成的嵌合體，如果某些基因座出現(xiàn)1個母源等位基因和2個父源等位基因，這時候需要進一步檢測，采用常染色體末梢STR位點進行檢測，如果所有基因座出現(xiàn)1個母源等位基因，說明是由于母親生殖細胞孤雌分裂而形成的嵌合體，如果某些基因座存在2個母源等位基因，說明是由于卵子和第二極體雙受精形成的嵌合體。

在親子鑒定實踐中，當(dāng)被檢者有2種不同性別的紅細胞群體時則容易被發(fā)現(xiàn)是嵌合體，而當(dāng)被檢者有2種細胞群性別相同或者只在血液中存在1種細胞群的時候就不容易被發(fā)現(xiàn)，值得注意的是，當(dāng)嵌合體者的血液中只存在1種細胞群的時候，容易造成親權(quán)鑒定結(jié)果錯誤。在親子鑒定或個體識別中，如若遇到嵌合體現(xiàn)象，應(yīng)該引起關(guān)注，首先要排除污染因素，可通過反復(fù)實驗，更換不同試劑盒擴增來排除，若仍為嵌合體現(xiàn)象，分析其發(fā)生機制，方可作出定論，以保證鑒定結(jié)果的準確性和科學(xué)性。

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