1株尿素分解菌的分離及其生長特性

陳 杰，李廣悅* ，張振遠(yuǎn)，丁德馨，王永東，胡 南

(1.南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué) 核資源工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

為提高巖土工程的穩(wěn)定性，巖土工程加固技術(shù)被廣泛使用。然而現(xiàn)有的錨固、注漿等物理、化學(xué)方法通常需要昂貴的設(shè)備，且易造成巖土擾動(dòng)和環(huán)境污染［1］。利用微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀(MICP)進(jìn)行巖土加固是一種綠色原位加固新技術(shù)［2-3］。MICP技術(shù)是通過向巖土中注入具有脲酶活性的微生物以及膠結(jié)液(尿素和氯化鈣溶液)，利用微生物產(chǎn)生的脲酶催化尿素水解為銨離子和碳酸根離子，將體系的pH提高，碳酸根離子與鈣離子形成碳酸鈣晶體，從而將巖土原位固化［4］。與傳統(tǒng)的加固方法相比，MICP技術(shù)具有能耗低、擾動(dòng)小、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，是新一代的巖土工程加固技術(shù)，已引起各國學(xué)者的廣泛關(guān)注，并開展了大量的研究［5-8］。具有脲酶活性的尿素分解菌，是MICP技術(shù)中被廣泛使用的細(xì)菌［9-10］。但由于生長環(huán)境的差異，不同地域微生物的生長特性也存在明顯差異，而土著微生物更能適應(yīng)本地域的環(huán)境條件。為獲得MICP技術(shù)所需的土著微生物，本研究從當(dāng)?shù)赝寥乐蟹蛛x了1株尿素分解菌，并研究了其生長特性，為細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)提供了參數(shù)，為微生物膠結(jié)實(shí)驗(yàn)提供了控制條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 用于細(xì)菌分離的土樣采集自實(shí)驗(yàn)室附近的花木種植園。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 選擇性培養(yǎng)基:酵母提取物10，硫酸銨 20，無水乙酸鈉 8.2，尿素 60.6，自然pH值，過濾滅菌;NA-尿素固體培養(yǎng)基:蛋白胨10，牛肉膏3，尿素60.6，氯化鈉 5，瓊脂 15，1.6%溴甲酚紫2 mL/L，調(diào)pH=7。除瓊脂外，其他成分采用過濾滅菌，將瓊脂高壓滅菌，待其冷卻至50℃時(shí)，倒入液體培養(yǎng)基中，并迅速倒入平皿;NH4-YE培養(yǎng)基:酵母提取物20，氯化銨10，過濾滅菌。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 取土樣5 g置于盛有100 mL選擇性培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后的懸液稀釋成 10－2、10－3、10－4三個(gè)濃度梯度，涂布于NA-尿素固體培養(yǎng)基，30℃靜止培養(yǎng)48 h。挑取NA-尿素固體培養(yǎng)基上呈紫色的菌落，用選擇性富集培養(yǎng)液培養(yǎng)后再涂于NA-尿素固體培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后挑取紫色菌落進(jìn)行再次純化，按此方法反復(fù)純化3次。

1.2.2 微生物濃度檢測(cè) 使用蛋白核酸測(cè)定儀(Biophotometer eppendorf Germany)檢測(cè)微生物濃度，所用波長為600 nm，所測(cè)值用OD600表示。

1.2.3 生長特性研究 ①初始pH對(duì)細(xì)菌生長的影響:將NH4-YE培養(yǎng)基pH分別調(diào)至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分裝于250 mL 三角瓶中，每瓶100 mL，接種量1%，30 ℃、200 r/min 分別培養(yǎng) 3、12、15、18、21、24 h，取樣檢測(cè)細(xì)菌濃度;②接種量對(duì)細(xì)菌生長的影響:將NH4-YE培養(yǎng)基pH調(diào)至8.5，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，接種量分別為1%、2%、4%、8%和16%。于30℃、200 r/min 分別培養(yǎng)3、12、15、18、21、24 h，取樣檢測(cè)細(xì)菌濃度;③溫度對(duì)細(xì)菌生長的影響:將NH4-YE培養(yǎng)基pH調(diào)至8.5，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，接種量1%，分別于20、25、30、35 和40 ℃下，200 r/min 培養(yǎng) 3、12、15、18、21、24 h，取樣檢測(cè)細(xì)菌濃度;④搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長的影響:將NH4-YE培養(yǎng)基pH調(diào)至8.5，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，接種量1%，30℃、轉(zhuǎn)速分別為100、150、200 和250 r/min 下培養(yǎng)3、12、15、18、21、24 h，取樣檢測(cè)細(xì)菌濃度。

1.2.4 最適生長條件下細(xì)菌生長曲線 依據(jù)生長特性研究確定的最適生長條件進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，定期取樣檢測(cè)細(xì)菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

培養(yǎng)2 d后NA-尿素固體培養(yǎng)基上開始出現(xiàn)菌落。由于培養(yǎng)基中含有尿素，當(dāng)目標(biāo)菌具有尿素分解能力時(shí)，可將尿素分解產(chǎn)生NH+4，從而使菌落周圍pH升高，使溴甲酚紫顯紫色。純化后細(xì)菌長出的菌落圓形且邊緣整齊，在菌落上滴加酚酞，菌落呈微紅色。根據(jù)平板分離結(jié)果證明，分離的菌株具有尿素分解能力。

2.2 初始pH值對(duì)細(xì)菌生長的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌生長的影響見圖1。當(dāng)pH為6.0時(shí)，細(xì)菌生長受到嚴(yán)重抑制，OD600的最大值僅為0.681，且在12 h后細(xì)菌開始衰亡。在 pH 為 7.0、8.0、9.0、10.0 時(shí)，細(xì)菌均生長較快。在pH為7.0～9.0范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增大，細(xì)菌濃度隨之升高。而pH進(jìn)一步升高到10.0時(shí)，細(xì)菌的生長又受到一定的抑制。相關(guān)研究［11-12］表明堿性條件下(pH=8.0～10.0)，可得到的巴氏芽胞桿菌誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀量較大，其中pH值最適值處于8.3～9.0之間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，在較寬范圍的堿性條件(pH=8.0～10.0)下，分離的尿素分解菌長勢(shì)良好，培養(yǎng)最適pH值為9.0，因此分離的菌株適用于MICP技術(shù)。

2.3 接種量對(duì)細(xì)菌生長的影響

圖1 初始pH值對(duì)細(xì)菌生長的影響Fig.1 Effect of initial pH on the growth of bacteria

接種量對(duì)細(xì)菌生長的影響見圖2。在培養(yǎng)至15 h，接種量對(duì)細(xì)菌的生長無明顯影響，15 h后，接種量為4%時(shí)，細(xì)菌生長最快，而10%時(shí)，細(xì)菌生長最慢。這可能是由于接種量過大，隨菌液加入的代謝產(chǎn)物也增多，代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的生長產(chǎn)生了抑制作用［13］。增大接種量，不但不經(jīng)濟(jì)，而且不能提高細(xì)菌的繁殖速度，對(duì)于分離的尿素分解菌，其最佳接種量為4%。

圖2 接種量對(duì)細(xì)菌生長的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on the growth of bacteria

2.4 溫度對(duì)細(xì)菌生長的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌生長的影響見圖3。溫度對(duì)細(xì)菌的生長有明顯的影響，細(xì)菌在20℃時(shí)生長最為遲緩。在20～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度上升，細(xì)菌生長速度隨之加快。當(dāng)溫度提高到40℃時(shí)，細(xì)菌繁殖速度迅速下降，其繁殖速度比30℃時(shí)還低。結(jié)果表明，分離的尿素分解菌最適溫度為35℃左右，其對(duì)高溫和低溫都較敏感。

圖3 溫度對(duì)細(xì)菌生長的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the growth of bacteria

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長的影響

分離的尿素分解菌為好氧菌，提高搖床轉(zhuǎn)速，可增加培養(yǎng)基中的溶解氧，有利于細(xì)菌的生長。但轉(zhuǎn)速過高會(huì)產(chǎn)生較大的剪切作用抑制細(xì)菌生長，同時(shí)也會(huì)增加能耗。搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長的影響見圖4。隨著轉(zhuǎn)速的提高，細(xì)菌生長繁殖增快，但轉(zhuǎn)速提高至250 r/min后，生長速度有所下降，其最適轉(zhuǎn)速為200 r/min左右。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長的影響Fig.4 Effect of rotation rate on the growth of bacteria

2.6 最適生長條件下細(xì)菌生長曲線

根據(jù)生長特性實(shí)驗(yàn)確定的最適合生長條件:初始pH值9，接種量4%，溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，測(cè)定了細(xì)菌生長曲線如圖5。0～5 h內(nèi)細(xì)菌生長緩慢，為延滯期;5 h后細(xì)菌生長速度急劇增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)期;12 h后曲線趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定期;24 h后，生長呈下降趨勢(shì)進(jìn)入衰亡期。從生長曲線可以看出，細(xì)菌的衰亡期較長，且速度下降較慢，這可能是由于死亡的菌體不能完全自溶，而進(jìn)行OD600值測(cè)量時(shí)無法對(duì)活菌進(jìn)行單獨(dú)測(cè)量而引起的誤差所致。

圖5 最適生長條件下細(xì)菌生長曲線Fig.5 Growth curve under the suitable growth conditions

3 討論

不同環(huán)境的微生物具有不同的生長特性，因而分離土著微生物并將其用于巖土工程的加固更具有實(shí)際意義。本研究采用富集培養(yǎng)和平板分離技術(shù)從土壤中分離出1株土著尿素分解菌，并研究了其生長特性，為MICP技術(shù)的研究提供了所需的菌株。

在進(jìn)行巖土工程的原位加固時(shí)，由于土壤的環(huán)境條件(如溫度、溶氧量等)不可能與微生物最適生長條件完全一致，因而如何使微生物在土壤中具有最大的活性以提高加固效果是MICP技術(shù)面臨的一個(gè)重要課題。

溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一。在一定溫度范圍內(nèi)，微生物的代謝活動(dòng)與生長繁殖隨著溫度的上升而增加，而當(dāng)溫度上升到一定程度，就會(huì)抑制微生物的生長。每一種微生物都有其最適宜生長溫度。由于受季節(jié)、地域等因素的影響，巖土介質(zhì)的溫度存在很大的差異性，因而提高微生物的環(huán)境適應(yīng)性尤為重要。采用馴化、誘變、基因工程等育種手段對(duì)微生物進(jìn)行改良可以提高其對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性，但也可能存在遺傳穩(wěn)定性和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等問題［14］。而土著微生物長期生長在當(dāng)?shù)兀瑢?duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，無疑是首選的菌種［15］。

巖土介質(zhì)的含氧量會(huì)隨著深度的增加而減少，從而影響微生物的生長繁殖。因而，溶解氧的輸送是應(yīng)用MICP技術(shù)進(jìn)行巖土工程原位加固的一個(gè)關(guān)鍵的限制性因素。目前，對(duì)MICP技術(shù)中溶解氧的輸送問題尚無相關(guān)報(bào)道。采用H2O2和釋氧化合物供氧可能是2種有效的供氧方式。采用H2O2供氧，加入方式簡(jiǎn)單，溶解氧濃度高，但H2O2的濃度過高對(duì)微生物有一定的毒性。研究表明［16］，通過控制H2O2的濃度，可以使微生物不受損害，在滿足微生物生長所需的溶解氧的同時(shí)，還可促進(jìn)微生物的代謝。釋氧化合物通過與水反應(yīng)釋放氧氣的同時(shí)，使得體系的pH值升高，有利于碳酸鈣沉淀的生成。

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