替米沙坦通過上調(diào)PPAR－γ促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP－1表達(dá)的實驗研究

尹 鵬，胡 君，儲著凌，霍中華，侯樂偉，呂 盛，欒榮剛，胡國強(qiáng)

（解放軍第四五四醫(yī)院普外燒傷整形外科，江蘇 南京 210002）

結(jié)腸癌（colon cancer）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率逐年增加［1～3］。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征，也是影響治療效果和預(yù)后的主要因素［1～3］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma，PPAR－γ）對于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖過程具有重要的調(diào)節(jié)作用［4，5］。同時發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體1（AT1R）阻斷劑（ARB）如替米沙坦和厄貝沙坦等，能夠有效促進(jìn)PPAR－γ的合成［6］。同時研究證實，PPAR－γ對組織抑制劑－1（TIMP－1）的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗的目的是觀察ARB是否能夠通過上調(diào)PPAR－γ的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP－1的表達(dá)和對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；鼠抗人TIMP－1抗體、鼠抗人PPAR－γ抗體和鼠抗人β－actin抗體購于美國Santa Cruz公司；替米沙坦（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），小牛血清（杭州四季青）；MTT試劑盒（美國Promega公司），超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SW480細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48小時換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 細(xì)胞活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μl約含5×103個細(xì)胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24h，使細(xì)胞同步化?？瞻讓φ战M加入PBS，陽性實驗組加入替米沙坦，終濃度為100μmol／L （100μM），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。使用MTT比色試驗對不同時間點(diǎn) （0、24和72h）的細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行測定，實驗重復(fù)4次。細(xì)胞活性（%）＝ （OD干預(yù)組／OD對照組）×100%［7］。

1.4 細(xì)胞TIMP－1和PPAR－γmRNA表達(dá)檢測 按照RT－PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。以2μg總RNA為模板，用Oligo（dT）18作為引物，按照試劑盒說明書介紹要求合成cDNA第1鏈。TIMP－1正義 5′－GCAACTCCGACCTTGTCATC－3′，反 義 5′－AGCGTAGGTCTTGGTGAAGC－3′；PPAR－γ 正 義5′－TCTCTCCGTAATGGAAGACC－3′， 反 義 5′－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3′；β－actin 正 義：5′－CTCCATCCTGGCCTCGCTGT－3′，反 義：5′－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3′，PCR反應(yīng)體系如下：2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板、PCR Master Mix（2×）25μl、正反引物各2μl，以超純水補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)條件為：96℃5min；91℃30s，56℃60s，73℃60s，循環(huán)35輪，最后74℃延伸10min。PCR產(chǎn)物8μl與5×loading buffer 2μl混勻后，1.2%瓊脂糖凝膠20V／cm電壓進(jìn)行電泳約30min。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)（Biorad）攝影，Quantity One軟件對目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β－actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為TIMP－1和PPAR－γmRNA的相對表達(dá)量。

1.5 Western blot法檢測細(xì)胞中TIMP－1和PPAR－γ蛋白表達(dá) 按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時，分別加入鼠抗人單克隆抗 體 TIMP－1 （1∶500）、PPAR－γ（1∶400）和β－actin（1∶1500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000），用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 MTT法細(xì)胞活性測定結(jié)果分析 干預(yù)時間0、24、72小時時細(xì)胞活性依次為98.0±3.5、62.1±18.6和29.8±11.2，結(jié)果顯示，隨時間變化，替米沙坦組SW480細(xì)胞活性逐漸減低，明顯低于對照組（均P＜0.05），且各時間點(diǎn)間的細(xì)胞活性存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。

2.2 TIMP－1和PPAR－γmRNA 的表達(dá) 在給予替米沙坦干預(yù)后，在0、24和72h時對SW480細(xì)胞TIMP－1和 PPAR－γmRNA 的表達(dá)顯示，TIMP－1和PPAR－γmRNA的表達(dá)呈時間依賴性遞增（均P＜0.05），見表1、圖1。

表1 TIMP－1和PPAR－γmRNA的表達(dá)（n＝4，）Table 1 The mRNA expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

表1 TIMP－1和PPAR－γmRNA的表達(dá)（n＝4，）Table 1 The mRNA expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

注：①與0h比較，P＜0.05；②與24h比較，P＜0.05

干預(yù)時間0h 24h 72h TIMP－1mRNA 0.18±0.02 0.58±0.07① 0.72±0.19①②PPAR－γmRNA 0.21±0.06 0.42±0.12① 0.89±0.21①②

圖1 TIMP－1和PPAR－r mRNA的表達(dá)Figure 1 The expression of TIMP－1and PPAR－r mRNA

2.3 TIMP－1和PPAR－γ蛋白的表達(dá) 在給予替米沙坦干預(yù)后，在0、24和72h時對SW480細(xì)胞TIMP－1和PPAR－γ蛋白表達(dá)顯示，TIMP－1和 PPAR－γ蛋白表達(dá)呈時間依賴性的遞增（均P＜0.05），見表2。

表2 TIMP－1和PPAR－γ蛋白表達(dá)（n＝4，）Table 2 The protein expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

表2 TIMP－1和PPAR－γ蛋白表達(dá)（n＝4，）Table 2 The protein expression of TIMP－1and PPAR－γin SW480cells

注：①與0h比較，P＜0.05；②與24h比較，P＜0.05

干預(yù)時間0h 24h 72h TIMP－1蛋白 0.24±0.03 0.52±0.11① 0.76±0.13①②PPAR－γ蛋白 0.19±0.05 0.39±0.06① 0.81±0.19①②

圖2 TIMP－1和PPAR－r蛋白的表達(dá)Figure 2 The expression of TIMP－1protein

3 討論

目前由于飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，結(jié)腸癌以成為導(dǎo)致人類癌癥死亡的最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高，同時流行病學(xué)調(diào)查顯示結(jié)腸癌的發(fā)病人群有年輕化趨勢［1～3］。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最明顯的特征，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因。目前對于以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移為目標(biāo)的研究方興未艾，是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移到鄰近組織及遠(yuǎn)處器官是一個多步驟的復(fù)雜過程。腫瘤細(xì)胞首先必須具備降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix ECM）及基底膜（basement membrane，BM）的功能，而這個降解功能主要有蛋白水解酶完成?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是蛋白水解酶中重要的一類。近年發(fā)現(xiàn)，MMPs主要是通過對基底膜（BM）和ECM的降解和增強(qiáng)腫瘤血管的生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移。MMPs超家族具有相似的基本結(jié)構(gòu)包括前肽區(qū)域、信號肽區(qū)域、催化活性區(qū)域、類血紅素蛋白結(jié)合區(qū)、ECM 同源序列區(qū)域和鉸鏈區(qū)［8，9］。組織抑制劑（TIMPs）是近年來發(fā)現(xiàn)的抑制MMPs活性的多功能因子家族，是一組低分子量的糖蛋白，主要由成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等合成和分泌。已發(fā)現(xiàn)的TIMPs酶有5種，為組織中MMPs主要的內(nèi)源性抑制因子，能特異地抑制MMPs家族的基質(zhì)降解酶。TIMP－1是TIMPs中的一種，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，并認(rèn)為TIMP－1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化程度、浸潤和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［9，10］。TIMP－1具有IV型膠原酶的作用，對IV型膠原和纖維連接蛋白（FN）有降解作用。TIMP－1的表達(dá)和活化可以受基因轉(zhuǎn)錄、酶原活化和抑制劑等多水平的調(diào)控［9，10］。研究發(fā)現(xiàn)PPAR－γ在TIMP－1的表達(dá)調(diào)控過程中扮演著重要的角色［11］。

過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferators－activated receptor gamma，PPAR－γ）屬于PPAR的亞型之一，可通過蛋白－蛋白相互作用和競爭輔助因子調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）、轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）和活化蛋白－1（AP－1）等多個重要的腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而對多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等過程起調(diào)節(jié)作用［4～8］。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，PPAR－γ在包括肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)上調(diào)PPAR－γ的表達(dá)可以有效的促進(jìn)包括A549細(xì)胞和Hela細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制多種與腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤相關(guān)分子（如 MMPS和 VEGF等）的合成和表達(dá)［4～8］。目前PPAR－γ已成為治療腫瘤的熱點(diǎn)。

多個研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素受體1（AT1R）阻斷劑（ARB）可以有效地上調(diào)PPAR－γ的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)和腫瘤的生長，并認(rèn)為該過程可能與血管緊張素系統(tǒng)（RASS）無關(guān)［6］。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)在給予SW480細(xì)胞替米沙坦100μmol／L干預(yù)后，SW480細(xì)胞活性呈時間依賴性降低。該結(jié)果表明，替米沙坦具有抑制SW480細(xì)胞增殖的作用。進(jìn)一步使用PTPCR和western blot分析發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞TIMP－1和PPAR－γmRNA和蛋白表達(dá)在替米沙坦干預(yù)后呈時間依賴性降低。該結(jié)果表明替米沙坦可以通過促進(jìn)TIMP－1的表達(dá)抑制SW480細(xì)胞的粘附和侵襲能力，并可能與上調(diào)PPAR－γ的表達(dá)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，替米沙坦可能通過上調(diào)SW480細(xì)胞中PPAR－γ的表達(dá)促進(jìn)TIMP－1的合成，并導(dǎo)致腫瘤的生長和侵襲能力的降低。但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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