pCS－CG－DsRed2－vigilin重組載體的構(gòu)建及vigilin重組慢病毒包裝＊

沈文燕，李 冉，覃 揚(yáng)，楊文理，劉秋英，魏 玲，俞小琴

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 成都 610041）

Vigilin（人高密度脂蛋白結(jié)合蛋白）是一個(gè)高度進(jìn)化保守的多功能蛋白質(zhì)，含有14個(gè)KH結(jié)構(gòu)域。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多KH結(jié)構(gòu)域蛋白在RNA的代謝方面起重要作用［1］。Vigilin的同源物Scp 160（酵母多KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白）和DDP1（果蠅著絲粒結(jié)合蛋白）在維持DNA、RNA的結(jié)構(gòu)和功能中均起重要作用。其中DDP1包含15個(gè)KH結(jié)構(gòu)域，它能結(jié)合單鏈核酸進(jìn)而發(fā)揮其作用［2］。DDP1參與維持DNA結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定和臂間異染色質(zhì)的形成［3］。目前已發(fā)現(xiàn)Vigilin在脂代謝以及染色體分離，mRNA代謝，轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定方面起重要作用［4～6］。Vigilin作為一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，研究其在生物體內(nèi)的作用顯得尤為重要。

慢病毒載體是在人免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV－1）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，使用慢病毒包裝系統(tǒng)建立的慢病毒能夠感染分裂細(xì)胞，終末分化細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，并能將目的基因高效的整合到宿主細(xì)胞染色體中，整合基因理論上能在細(xì)胞中永久表達(dá)。隨著慢病毒載體的逐漸改造，目前使用的慢病毒包裝系統(tǒng)包裝的慢病毒具有較高的生物安全性。慢病毒載體作為一種理想的基因轉(zhuǎn)移載體正在被越來越多的神經(jīng)科學(xué)、基因功能研究，基因表達(dá)等領(lǐng)域的科研工作者所接受［7～9］。因此，我們構(gòu)建了pCS－CG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體，包裝的重組病毒能較好的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，為后續(xù)研究在生物學(xué)形態(tài)方面vigilin功能提供了良好的生物材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胚腎細(xì)胞HEK293T，人肝癌細(xì)胞系HepG2均為本實(shí)驗(yàn)室保存。均采用含10%FBS（民海生物）的DMEM（GIBCO）培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 菌種載體及工具酶 大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；慢病毒相關(guān)載體pSPAX2，pMD2.G，pCSCG由德克薩斯州大學(xué)劉建余博士惠贈(zèng)，去除綠色熒光蛋白GFP的重組質(zhì)粒pCS－CG－vigilin為本實(shí)驗(yàn)室楊文理博士構(gòu)建；T4DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司。

1.1.3 轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺PEI購自polysciences公司，Polybrene購自Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司。恒溫水浴箱（金壇市醫(yī)療儀器廠），恒溫?fù)u床（Beckman公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司），操凈工作臺(tái)（蘇 凈），凝膠成像儀 （Bio－Rad公司），ECLIPSE TE2000S熒光倒置顯微鏡（Nikon）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 穿梭質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2的構(gòu)建：用NheⅠ、NotⅠ將DsRed2基因目的片段從pDsRed2－N1上切下，DNA凝膠電泳回收后，用T4連接酶連入穿梭載體pcDNA3.1（－）上，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆用Nhe－Ⅰ、NotⅠ鑒定，鑒定正確后的陽性克隆送北京諾賽基因測(cè)序，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1（－）－DsRed2。重組質(zhì)粒pCS－CG－DsRed2－vigilin的構(gòu)建：將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2和pCS－CG－vigilin分別用KpnⅠ單酶切回收后連接并轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆分別用KpnⅠ和SacⅡ單酶切鑒定，酶切鑒定正確后送測(cè)序，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為 pCS－CG－DsRed2－vigilin，重組的 pCSCG－DsRed2－vigilin部分酶切點(diǎn)圖譜見圖1。

圖1 重組慢病毒載體pCS－CG－DsRed2－vigilin圖譜Figure 1 Map of the recombinant lentiviral vector pCS－CG－DsRed2－vigilin

1.2.2 重組慢病毒包裝 分別提取慢病毒載體pCSCG、重組載體pCS－CG－DsRed2－vigilin 和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G，利用PEI共轉(zhuǎn)染入 HEK293T細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染方法為：將9μgPEI和3μg質(zhì)粒分別溶于DMEM中，其中三種質(zhì)粒的質(zhì)量比為pCS－CGDsRed2－vigilin∶pSPAX2∶pMD2.G＝4∶3∶1，室溫孵育20min后將兩者混勻，室溫孵育25min，將質(zhì)粒與PEI的混合物逐滴緩慢加于6cm培養(yǎng)皿中，6小時(shí)后更換新鮮完全培養(yǎng)基（DMEM＋10%FBS），轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集慢病毒，另加5ml新鮮完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時(shí)后收集病毒，將收集好的病毒用0.45μm的濾器過濾以除去細(xì)胞碎片，分裝，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 pCS－CG－DsRed2－vigilin載體構(gòu)建 首先在構(gòu)建的pcDNA3.1（－）－DsRed2中，挑選單克隆用 NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，挑選的6個(gè)克隆經(jīng)酶切后電泳如圖2所示，其中1、3、5、7、9、11為 NheⅠ、NotⅠ酶切產(chǎn)物，2、4、6、8、10、12為未經(jīng)酶切的相應(yīng)克隆質(zhì)粒。1、3、5、7、9、11均顯示預(yù)期的5.4kb和767bp兩條電泳條帶，送北京諾賽基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，與報(bào)道的pDsRed2—N1中DsRed2的基因序列相同。

圖2 質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2的鑒定Figure 2 Identification of plasmid pcDNA3.1（－）－DsRed2

已成功插入DsRed2目的片段的pcDNA3.1（－）－DsRed2中有兩個(gè) Kpn1的酶切點(diǎn)，pCS－CG－vigilin C末端緊接一個(gè)Kpn1的酶切點(diǎn)，將pcDNA3.1（－）－DsRed2、pCS－CG－vigilin分別用 Kpn1單酶切后回收連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆先用Kpn1酶切鑒定，連接上 DsRed2 的pCS－CG－DsRed2－vigilin應(yīng)有一個(gè)片段大小約800bp的insert切下，見圖3；再將帶有DsRed2insert的質(zhì)粒用SacⅡ單酶切鑒定插入的DsRed2基因的方向是正向還是反向，如果有600bp的插入子切下則DsRed2的連接方向正確，如有1400bp的insert切下則DsRed2連接方向錯(cuò)誤。正確的克隆見圖4。將酶切鑒定正確的克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié) 果 顯 示，DsRed2 已 連 到 pCS－CG－DsRed2－vigilin上，且方向正確。

2.2 重組慢病毒的包裝及鑒定 將重組表達(dá)型載體pCS－CG－DsRed2－vigilin和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24小時(shí)后收集慢病毒，再加5ml新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h收集慢病毒，過濾，分裝。將收集的慢病毒分別感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，將已經(jīng)感染的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后于熒光倒置顯微鏡下觀察紅色熒光，見圖5、6，所示較明顯的紅色熒光，說明慢病毒已成功生產(chǎn)，將同一視野自然光和熒光的圖片對(duì)比發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒可高效的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞。

圖3 pCS－CG－DsRed2－vigilin Kpn1酶切鑒定Figure 3 Identification of plasmid pCS－CG－DsRed2－vigilin by Kpn1

圖4 pCS－CG－DsRed2－vigilin SacⅡ 酶切鑒定Figure 4 Identification of plasmid pCS－CG－DsRed2－vigilin by SacⅡ

圖5 重組慢病毒感染HEK293T和HepG2細(xì)胞48h后DsRed的表達(dá)（×100）Figure 5 DsRed expression in HEK293Tcells and HepG2cells after transducing recombinant lentivirus for 48h（×100）

圖6 重組慢病毒感染HEK293T和HepG2細(xì)胞48h后DsRed的表達(dá)（×200）Figure 6 DsRed expression in HEK293Tcells and HepG2cells after transducing recombinant lentivirus for 48h（×200）

3 討論

本研究中采用慢病毒包裝體系載體pCS－CG和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)成功的包裝出帶紅色報(bào)告基因的慢病毒，該包裝系統(tǒng)中pCS－CG是帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒載體骨架，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列。同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)，pSPAX2能提供gag、pol蛋白，pMD2.G提供Env蛋白。這種分工形式大大降低了恢復(fù)成野生型病毒的可能，具有較大的生物安全性。目前實(shí)驗(yàn)研究常用的病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期的細(xì)胞，且只能容納較短（＜8kb）的DNA片段。腺病毒載體雖可攜帶大片段DNA片段，但其轉(zhuǎn)、感染效率較低，只能短暫表達(dá)目的蛋白。雖然慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，但它能攜帶大片段的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上，且不易產(chǎn)生宿主免疫反應(yīng)［8～12］。故本研究采用慢病毒載體來生產(chǎn)帶有紅色熒光的vigilin慢病毒。

我們的研究將DsRed2從pDsRed2－N1中用NheⅠ、NotⅠ雙酶切切下，連入pcDNA3.1（－）上，再從pcDNA3.1（－）－DsRed2中用Kpn1單酶切切下DsRed2片段插入 pCS－CG－vigilin中，成功構(gòu)建了pCS－CG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體。并將該重組慢病毒載體與慢病毒包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝出帶紅色報(bào)告基因的vigilin慢病毒。用該病毒分別感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，均能觀察到較強(qiáng)的紅色熒光，說明包裝出的慢病毒能高效的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞。這個(gè)過程中我們構(gòu)建了一個(gè)穿梭載體pcDNA3.1（－）－DsRed2，這種方法在沒有合適酶切點(diǎn)的情況下避免了采用PCR來獲取目的片段時(shí)可能發(fā)生的錯(cuò)配等情況，大大提高了構(gòu)建的效率。

4 結(jié)論

Vigilin是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，本研究構(gòu)建了pCSCG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體，并成功地包裝出相應(yīng)的慢病毒，包裝出的vigilin慢病毒為我們后續(xù)研究vigilin在細(xì)胞中的生物學(xué)形態(tài)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Birchler JA，Kavi HH，F(xiàn)ernandez HR.Heterochromatin：RNA points the way［J］.Curr Biol，2004，14（18）：R759–R761.

［2］Huertas D，Cortés A，Casanova J，et al.Drosophila DDP1，a multi－KH－domain protein，contributes to centromeric silencing and chromosome segregation［J］.Curr Biol，2004，14（18）：1611－1620.

［3］Cortés A，Huertas D，F(xiàn)anti L，et al.DDP1，a single－stranded nucleic acid－binding protein of Drosophila，associates with peri－centric heterochromatin and is functionally homologous to the yeast Scp160p，which is involved in the control of cell ploidy［J］.EMBO J，1999，18（13）：3820－3833.

［4］Wang QQ，Zhang Z，Blackwell K，et al.Vigilins binds to promiscuously A－to－I－edited RNAs and are involved in the formation of heterochromatin［J］.Curr Biol，2005；15（4）： 3842391.

［5］Cunningham KS，Dodson RE，Nagel MA，et al.Vigilin binding selectively inhibits cleavage of the vitellogenin mRNA 3’－untranslated region by the mRNA endonuclease polysomalribonuclease 1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（23）：12498－12502.

［6］楊文理，武 靜，謝曉硯，等.人vigilin基因全長編碼區(qū)的分段克隆及鑒定［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，39（6）：877－881.

［7］Follenzi A，Santambrogio L，Annoni A.Immune responses to lentiviral vectors［J］.Curr Gene Ther，2007，7（5）：306－315.

［8］Chumakov SP，Kravchenko JE，Prassolov VS，et al.Efficient down regulation of multiple mRNA targets with a single shRNA－expressing lentiviral vector［J］.Plasmid，2010，63（3）：143－149.

［9］Ramos OS，CarrataláYP，Puerta SG，et al.Dual promoter lentiviral vector generates transgenic mice expressing E2－CSFV glycoprotein in their milk，but impairs early identification of transgenic embryos ［J］.Theriogenology，2011，75（7）：1280－1289.

［10］Keen JE，Hungerford LL，Littledike ET，et al.Effect of ewe ovine lentivirus infection on ewe and lamb productivity［J］.Prev Vet Med，1997，30（2）：155－169.

［11］周亞峰，李紅霞，蔡思達(dá)，等.穿梭質(zhì)粒pCDH1－GFP－HCN4的構(gòu)建及HCN4重組慢病毒的包裝［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，32（3）：354－358.

［12］王婷婷，王淑娟，嚴(yán)景華.hNoc4L基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（11）：1569－1575.