地皮菜細胞的分離純化及形態(tài)發(fā)育研究

趙蘭娟 于海峰

(齊魯工業(yè)大學(xué)，山東濟南 250353)

地皮菜學(xué)名普通念珠藻(Nostoc commune Vauch)，在分類學(xué)上屬藍藻門(Cyanophyta)，藍藻綱(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostoccales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)［1］中的 Nostoccommune Vauch，是念珠藻中的群體型(Colony)。一般地皮菜藻體呈片狀，為肉眼可見的膠狀擴展群體，藻絲由50～170個營養(yǎng)細胞和異形胞組成，在膠鞘內(nèi)無規(guī)則地排列，相互纏繞而成平時所見的原植體。

地皮菜可食用，并有一定的藥用價值，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、粗纖維、總糖礦物質(zhì)、維生素，微量元素等營養(yǎng)成分［2－5］，還有特殊的活性成分藻藍蛋白、胞外多糖等，是人們的席上佳肴和健康飲品，并可入藥，《本草綱目》、《中國藥典》中均有記載，如果科學(xué)合理的開發(fā)地皮菜，則具有廣闊的應(yīng)用前景［6－9］。近年來，由于環(huán)境的污染及過度開采，使得該資源逐漸減少，面臨龐大的市場需求，要想擴大地皮菜的產(chǎn)量，首先必須獲得純凈的優(yōu)質(zhì)藻種。分離地皮菜藻種的方法有多種［10］，本實驗以地皮菜為實驗材料，從原植體處理出發(fā)，研究了在不同處理條件下，對地皮菜進行分離純化的影響，同時進行顯微觀察，為研究地皮菜的形態(tài)發(fā)育提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生地皮菜取自河南桐柏山的沙質(zhì)土壤上。挑選葉片比較厚，色澤比較亮麗呈墨綠色的原植體，除去雜草，用清水洗凈干燥后保存，待下一步實驗使用。BG11培養(yǎng)基和2%瓊脂固化的BG11培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 地皮菜處理條件的篩選

參考常用原植體處理時常用的方法［11－12］的基礎(chǔ)上，選擇H2O2處理、乙醇處理、紫外處理三個因素，首先進行單因素實驗，篩選出最佳的處理方式，然后進行多因素的復(fù)合實驗。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將處理過的地皮菜在超凈工作臺下，用研磨器碾碎，制成藻懸液，BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。將接種的三角瓶和平板置于25℃、1500lx光照下靜置培養(yǎng)。

1.2.3 原植體處理實驗設(shè)計

將清洗干凈的地皮菜，分別利用不同的單因素處理，分別篩選出最佳的單因素條件，H2O2濃度設(shè)置1%、3%、5%、7%、9%5個水平，分別處理30s;乙醇濃度設(shè)置65%、75%、85%、95%4個水平，分別處理40s;在紫外照射強度為800uW/cm2條件下，紫外處理時間設(shè)置 10min、15min、20min、25min、30min5個水平分別處理地皮菜，進行分離地皮菜藻種，依次篩選出最佳的條件。在篩選出的條件下，分別設(shè)置不同的因素水平，確定最佳H2O2處理時間(10s、30s、50s、70s、90s)、乙醇處理時間(20s、40s、60s、80s、100s)、紫外強度 (200uW/cm2、400uW/cm2、600uW/cm2、800uW/cm2、1000uW/cm2)。

確定出最佳的單因素的條件下，分別在不同的H2O2濃度、H2O2處理時間、乙醇濃度、乙醇處理時間、紫外處理時間、紫外強度的條件下，利用不同因素復(fù)合處理，在不同因素共同的作用下，確定原植體的最佳處理條件。

1.2.4 平板培養(yǎng)分離藻種

由于在分離藻種的過程中，雜藻的細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長逐天增加，成為優(yōu)勢群體，其中小球藻和柵藻最為常見，因此，需要不斷地進行分離純化培養(yǎng)。

利用篩選出的最佳條件，將處理的原植體，用勻漿器研磨［13］，進行液體培養(yǎng)數(shù)天后，接著用無菌吸量管吸取培養(yǎng)液1ml，進行梯度稀釋，無菌條件下每個平板接種1ml，涂布棒涂勻，每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)，用封口膜密封置于培養(yǎng)條件為25℃，光照強度為1500lx下靜置培養(yǎng)10～15d，直至在培養(yǎng)基表面長出可見的微群體。

平板培養(yǎng)數(shù)天后，會出現(xiàn)形態(tài)不同的單菌落，鏡檢，挑取念珠狀的菌落轉(zhuǎn)接到BG11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，多次進行固體BG－11培養(yǎng)基培養(yǎng)和液體轉(zhuǎn)接純化得到大量藻絲體。

2 結(jié)果與分析

2.1 地皮菜單因素處理結(jié)果

2.1.1 H2O2濃度處理及作用時間對分離效果的影響

通過H2O2不同濃度的處理，BG11液體培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天，每天鏡檢觀察，并進行拍照。15d后，發(fā)現(xiàn)由幾個細胞組成的藻殖段開始發(fā)育，藻絲不規(guī)則地分布，念珠狀細胞組成的藻絲長短不一，排列形狀各異，藻絲表面覆蓋著大量的膠質(zhì)物。其中1%H2O2處理分離效果明顯(圖1(a))，其次3%。

圖1 單因素處理分離的地皮菜藻種

在1%H2O2的條件下，不同H2O2處理時間對不同藻類的作用效果也用很大的差別，由(圖1(b))可知，其中30s條件下，可分離獲得地皮菜藻種;其次是50s，處理時間過短和過長，原植體解體的程度也不同，細胞生長狀態(tài)各異，念珠狀不明顯。

2.1.2 乙醇濃度處理及作用時間對分離效果的影響

不同濃度的乙醇，除菌效果差別很大，其中75%的滅菌效果較好(如圖1(c))，能夠除去原植體表面的大部分細菌，可以分離出念珠狀發(fā)藻殖段，濃度過低或過高，都不利于原植體的表面滅菌。

經(jīng)過75%乙醇，不同時間處理的地皮菜，除菌效果也有明顯的差異，40s就可除去原植體表面的大部分細菌(圖1(d))，分離獲得念珠狀藻絲體。

2.1.3 紫外處理時間及作用強度對分離效果的影響

利用紫外進行表面滅菌，不同時間處理后，連續(xù)培養(yǎng)，鏡檢觀察，在第4d，經(jīng)過20min的紫外處理的樣品，分離得到念珠狀明顯的藻體(圖(e));經(jīng)過10min處理的樣品，原質(zhì)體解體程度較小，僅出現(xiàn)少量的藻殖段;經(jīng)過30min處理的樣品，處理的效果和10min處理的效果類似。

距離燈管越近，紫外照射強度越大，當(dāng)距離燈管強度是800uW/cm2時，可分離出地皮菜藻種(圖1(f))，分離出的地皮菜生長狀態(tài)較好;當(dāng)照射強度較低時，多種藻類纏結(jié)在一起，分離效果不明顯，當(dāng)照射強度較高時，念珠狀的藻絲體表現(xiàn)出生長抑制的狀態(tài)。

2.2 復(fù)合因素處理原植體對分離效果的影響

通過單因素實驗，篩選出最佳H2O2濃度、H2O2作用時間、乙醇濃度、乙醇作用時間、紫外處理時間、紫外強度，以一個因素為變量，進行多因素復(fù)合實驗，處理原植體，于BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天連續(xù)鏡檢觀察，在不同因素同時處理時，分離純化地皮菜藻種。

表1 地皮菜原植體處理水平表

經(jīng)過多因素復(fù)合處理實驗，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過1%H2O2、H2O2處理時間30s、乙醇濃度75%、乙醇處理時間為 40s、紫外處理時間 10min、紫外強度 800 uW/cm2處理的原植體，經(jīng)過液體BG11培養(yǎng)數(shù)天，鏡檢觀察，可分離獲得生長狀態(tài)良好的地皮菜藻種。隨著培養(yǎng)時間的延長，其他條件下，雜藻的不斷生長，影響了地皮菜藻絲體的生長。

圖2 復(fù)合因素處理分離的地皮菜藻種

2.3 地皮菜的發(fā)育研究

在分離培養(yǎng)的過程中，通過培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)細胞存在不同的繁殖方式及形態(tài)發(fā)育，常見的地皮菜的繁殖方式:

1)二分裂是細胞分裂的最簡單也是最常見的分裂方式(圖3(B、C))，這種繁殖方式對適應(yīng)環(huán)境起到重要的作用，可以使藻絲的長度迅速增加;

2)在藻種分離的過程中，藻殖段是一種常見的短而直的可移動的藻絲，細胞的個體小，形態(tài)上比較短，與營養(yǎng)藻絲容易區(qū)分，藻殖段的分化，是由一系列的調(diào)控機制作用形成的［14－15］;

3)在環(huán)境不利的條件下，營養(yǎng)細胞可以轉(zhuǎn)化發(fā)育形成厚壁孢子，在藻種分離的過程中，不同階段觀察到的厚壁孢子數(shù)量有明顯的差別，條件適宜時，萌發(fā)生長形成新個體;

4)營養(yǎng)細胞在缺氮的條件下，還可以轉(zhuǎn)變形成異形胞(圖3(D))，特殊條件下，也可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子，繁殖發(fā)育成新的藻絲，異形胞有間生和端生兩種存在方式，藻絲可在異形胞處斷裂形成藻殖段，異形胞的主要功能是在惡劣條件下，起到保存物種的作用;

5)在比較潮濕的環(huán)境中，地木耳藻體可以進行出芽繁殖，藻體表面形成許多芽狀小突起，隨著小突起逐漸變大，釋放藻絲體，脫離母體，繼續(xù)發(fā)育成新的個體。

地皮菜的形態(tài)發(fā)育階段:

1)藻殖段階段，從由幾個細胞組成的藻殖段開始發(fā)育，由于細胞具有偽空泡，藻殖移動范圍很大;

2)小群體階段，當(dāng)藻殖段到達一定長度后，藻絲的周圍可逐漸形成群體膠鞘，細胞在膠鞘內(nèi)分裂，使得藻絲在膠鞘內(nèi)發(fā)生彎曲變形，這個階段，藻絲生長最為迅速，并且異性胞開始分化出現(xiàn)，藻絲在異性胞之間斷裂或死亡的營養(yǎng)細胞處斷裂，亦可形成藻殖段;

3)大群體階段，隨著藻絲的強烈扭曲，群體不斷擴大，形成肉眼可見的群體，這個階段群體的內(nèi)部和色素發(fā)生很大變化，細胞處于最敏感的時期，在這個階段開始，地皮菜的形態(tài)因環(huán)境的不同可形成不同的形態(tài)。

圖3 地皮菜的發(fā)育研究

3 結(jié)論

分離藻種的方法很多，本實驗從處理原植體出發(fā)，在不同因素不同條件處理下，無論是念珠狀細胞的生長狀態(tài)還是原植體的解體程度等各方面的因素，分離藻種的效果不同，再進一步的分離涂布和液體轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，可獲得較純的藻種，在分離的過程中，雜藻的污染成為主要的影響因素。

通過對地皮菜的形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)在不同的原植體處理和環(huán)境條件下，地皮菜可形成不同的分裂方式和細胞形態(tài)，為了解地皮菜的發(fā)育生活史提供依據(jù)。

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