• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸性成纖維細(xì)胞生長因子的分離純化及活性分析

    2014-10-22 23:54:01范亞軍倪秀珍
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年17期
    關(guān)鍵詞:豌豆纖維細(xì)胞緩沖液

    范亞軍+倪秀珍

    摘要:以瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)的豌豆(Pisum sativum L.)為試驗(yàn)材料,提取豌豆中可溶性總蛋白質(zhì),利用Western blot方法檢測目的蛋白質(zhì),結(jié)果表明豌豆可成功表達(dá)aFGF;采用肝素親和柱層析法分離目的蛋白aFGF,并用MTT法檢測aFGF的生物學(xué)活性,結(jié)果表明豌豆中表達(dá)的酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性。

    關(guān)鍵詞:豌豆(Pisum sativum L.);酸性成纖維細(xì)胞生長因子;分離;純化;活性

    中圖分類號:Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)17-4211-03

    Separation, Purification and Bioactivity of Acidic

    Fibroblast Growth Factor

    FAN Ya-jun, NI Xiu-zhen

    (Department of Biology, Changchun Normal University, Changchun 130032, China)

    Abstract: The pea(Pisum sativum L.) plants expressing the foreign protein aFGF were used to extract the total soluble proteins. Western blot was performed to identified the aFGF protein. Heparin-affinity chromatography was used to separate and purify the aFGF. The bioactivity of the aFGF purified was analyzed by MTT. The result of western blot confirmed that the exogenous protein aFGF was expressed and purified successfuly from pea plants. The MTT results showed that the pea plants derived aFGF had the mitogentic activity.

    Key words: pea(Pisum sativum L.); aFGF; separation;purification; bioactivity

    酸性成纖維細(xì)胞生長因子(Acidic fibroblast growth factor,aFGF)是一種重要的有絲分裂原,在胚胎發(fā)育期間能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖并參與細(xì)胞的遷移與分化[1,2]。有研究表明,aFGF可以通過促進(jìn)潰瘍底部血管增生而使?jié)兊靡钥焖傩迯?fù),另外在受損的大腦皮質(zhì)中內(nèi)源性的酸性成纖維細(xì)胞生長因子及其受體表達(dá)水平均有提高,這說明aFGF在傷口愈合、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及再生過程中具有重要作用[3,4]?;赼FGF在機(jī)體發(fā)育及多種傷病治療中的功能,選擇高效、安全的生產(chǎn)平臺表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子對基礎(chǔ)研究及醫(yī)療方面均具有重要意義,而利用植物作為生產(chǎn)平臺瞬時表達(dá)藥用蛋白質(zhì)是當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)[5-9],本研究以瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆(Pisum sativum L.)為試驗(yàn)材料,提取植物可溶性總蛋白質(zhì),利用肝素親和柱層析法分離了外源蛋白質(zhì)aFGF,并對目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性進(jìn)行了分析,為研究酸性成纖維細(xì)胞生長因子提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    豌豆種子購買于長春市市場,瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆植株由長春師范大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    肝素瓊脂糖凝膠(Heparin SepharoseTM CL-6B)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司,Microcon YM-10超濾管購自美國Millipore公司,蛋白質(zhì)雜交所用二抗-辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中山生物技術(shù)有限公司,低分子量蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心,化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Super Singnal West Pico Trial Kit購自Pierce公司,IMDM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)品aFGF購自美國Sigma-Aldrich公司。

    蛋白質(zhì)磷酸鹽(PBS)提取緩沖液配制:8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO4、0.27 g KH2PO4、pH 7.4。

    1.2 方法

    1.2.1 豌豆可溶性總蛋白質(zhì)的提取及檢測 稱取瞬時表達(dá)酸性成纖維細(xì)胞生長因子的豌豆植株0.1 g充分研磨,加入100 μL預(yù)冷的蛋白質(zhì)PBS提取緩沖液于冰上充分溶解蛋白質(zhì)2~3 h,4 ℃ 12 000 r/min離心,得到上清液備用。目的蛋白質(zhì)電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理,用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜于4 ℃過夜反應(yīng),次日洗膜后加入aFGF抗體(按體積比1∶500稀釋),室溫下輕輕混合90 min后使用PBST(1 L PBS加入2 mL的Tween 20)洗膜,加入用PBST緩沖液稀釋(1∶5 000)的二抗溶液,室溫輕輕混合反應(yīng)1 h后洗膜并進(jìn)行顯色、壓片處理。

    1.2.2 目的蛋白質(zhì)的分離純化及蛋白質(zhì)雜交檢測 采用肝素親和層析法分離純化目的蛋白質(zhì)。首先用去離子水多次沖洗層析柱柱體,并用結(jié)合緩沖液(10 mmol/L PBS、0.15 mol/L NaCl,pH 7.4)對柱體進(jìn)行平衡,將豌豆植物蛋白質(zhì)與Heparin SepharoseTM CL-6B混合后置于冰上勻漿混合2 h,將混合后的液體緩慢加入柱中靜置30~40 min后,用10倍體積的結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白,配置不同鹽濃度的PBS緩沖液(0.5、0.8、1.0、1.5 mol/L NaCl)進(jìn)一步洗去雜蛋白,收集洗脫液進(jìn)行電泳并對蛋白質(zhì)進(jìn)行雜交檢測。endprint

    1.2.3 目的蛋白質(zhì)的脫鹽處理 將洗脫得到的目的蛋白質(zhì)加入到Microcon YM-10超濾管柱中14 000 r/min離心40 min,并將離心后的Microcon YM-10柱子倒置于新的離心管中加入50 μL PBS緩沖液,1 000 r/min離心10 min得到脫鹽后的目的蛋白質(zhì)。

    1.2.4 MTT法檢測目的蛋白質(zhì)aFGF的促細(xì)胞分裂活性 將培養(yǎng)后的NIH3T3細(xì)胞用胰酶消化,并用不含血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104 個/mL,將稀釋后的細(xì)胞均勻加入96孔板,每孔100 μL置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用蛋白質(zhì)PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品aFGF和植物中表達(dá)純化的樣品(aFGF)稀釋成不同濃度梯度(125、250、375、500、625 ng/mL),并以蛋白質(zhì)PBS緩沖液作為陰性對照,將不同濃度aFGF樣品加入培養(yǎng)后的細(xì)胞中,每個梯度4次重復(fù),加樣后于37 ℃再次培養(yǎng)24 h,次日每孔加入5 mg/mL的外源四甲基偶氮唑鹽(MTT)10 μL,37 ℃培養(yǎng)4~6 h后去掉上清液,加入溶解液二甲基亞砜(DMSO)每孔100 μL,震蕩混勻后于波長570 nm處測定吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的蛋白質(zhì)的提取和鑒定

    根據(jù)植物蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn),在接種后12~14 d提取豌豆植株可溶性總蛋白質(zhì),并對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測,雜交結(jié)果表明目的蛋白質(zhì)酸性成纖維細(xì)胞生長因子在豌豆植株中成功表達(dá),結(jié)果如圖1所示。

    2.2 目的蛋白質(zhì)的分離純化及雜交檢測

    研究表明,肝素與酸性成纖維細(xì)胞生長因子能夠特異性結(jié)合[10]。通過肝素親和柱層析法從豌豆植株總蛋白質(zhì)中分離純化目的蛋白質(zhì)aFGF,通過不同鹽濃度的PBS緩沖液洗脫,最終在含1.5 mol/L NaCl的PBS緩沖液中得到目的蛋白質(zhì),分離結(jié)果如圖2 a所示。通過Western blot方法對所得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測,以標(biāo)準(zhǔn)品aFGF為陽性對照,雜交結(jié)果表明從豌豆植株中成功純化出外源蛋白質(zhì)aFGF,結(jié)果如圖2 b所示。

    2.3 目的蛋白質(zhì)活性分析

    利用MTT法檢測豌豆植株表達(dá)的aFGF的生物學(xué)活性,以aFGF標(biāo)準(zhǔn)品及PBS緩沖液分別作為陽性及陰性對照,結(jié)果表明豌豆植物表達(dá)的aFGF具有明顯的促細(xì)胞分裂活性,在終濃度500 ng/mL時活性最高,結(jié)果如圖3所示。

    3 小結(jié)與討論

    利用植物系統(tǒng)表達(dá)藥用蛋白質(zhì)具有重要的發(fā)展及應(yīng)用前景。由于植物表達(dá)系統(tǒng)相較于動物及微生物表達(dá)系統(tǒng)具有更高的安全性,因此近年來受到廣泛的關(guān)注,而作為良好的生物反應(yīng)器的基本條件是該體系能夠成功表達(dá)外源蛋白質(zhì)并且能夠保證外源蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。本研究以肝素親和層析法分離純化了豌豆植株中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)aFGF,并對其生物活性進(jìn)行了檢測。肝素是一種黏多糖,可以作為親和柱層析中的吸附劑,研究表明酸性成纖維細(xì)胞生長因子是一種可以與肝素特異性親和的蛋白質(zhì),當(dāng)豌豆植株可溶性總蛋白質(zhì)與肝素混合后二者發(fā)生特異性結(jié)合,通過不同鹽離子濃度的緩沖液可以將非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)洗脫掉[11]。本研究在含1.5 mol/L NaCl的PBS緩沖液中得到目的蛋白質(zhì),試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)混合液在親和柱中靜置的時間是影響目的蛋白質(zhì)洗脫的關(guān)鍵條件,一般靜置30 min左右可得到較高濃度的目的蛋白質(zhì)。

    MTT法是檢測細(xì)胞活性常用的一種方法,活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源四甲基偶氮唑鹽(MTT)轉(zhuǎn)化成藍(lán)紫色甲瓚顆粒并沉積在細(xì)胞中,二甲基亞砜(DMSO)可將細(xì)胞中的甲瓚顆粒溶解,其吸光度(OD)值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性,在細(xì)胞中加入aFGF可提高細(xì)胞分裂速度,增加細(xì)胞數(shù)量,利用MTT法可檢測aFGF的促細(xì)胞分裂活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明,豌豆植株中表達(dá)的酸性成纖維細(xì)胞生長因子具有促細(xì)胞分裂活性,豌豆是一種良好的表達(dá)藥用蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)器。

    參考文獻(xiàn):

    [1] GROSE R, DICKSON C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16(2):179-186.

    [2] RAZZQUE M S, LANSKE B. The emerging role of the fibroblast growth factor-23-klotho axis in renal regulation of phosphate homeostasis [J]. J Endocrinol, 2007, 194(1): 1-10.

    [3] FITZPATRICK L R, JAKUBOWSKA A, Martin G E, et al. Acidic fibroblast growth factor accelerates the healing of acetic-acid-induced gastriculcers in rats [J]. Digestion, 1992, 53(1-2): 17-27.

    [4] GUEVAS P, CARCELLER F, MUNOZ-WILLERY L, et al. Intravenous fibroblast growth factor penetrates the blood-brain barrier and protects hippocampal neurons against ischemia reperfusion injury[J]. Surg Neurol, 1998, 49(1): 77-84.

    [5] EGELKROUT E, RAJAN V, HOWARD J A. Overproduction of recombinant proteins in plants[J]. Plant Sci,2012,184(3): 83-101.endprint

    [6] RAMESSAR K, SABALZA M, CAPELL T, et al. Maize plants: An ideal production platform for effective and safe molecular pharming [J]. Plant Sci, 2008, 174(4): 409-419.

    [7] FAN Y J,LI W, WANG J J, et al. Efficient production of human acidic fibroblast growth factor in pea(Pisum sativum L.) plants by agroinfection of germinated seeds[J]. BMC Biotechnology, 2011, 11(45):doi:10.1186/1472-6750-11-45.

    [8] LEUZINGER K, DENT M, HURTADO J, et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins[J]. Jvis EXP,2013,23(77):doi:10. 3791/50521.

    [9] OHADI M, RASOULI R, DARZI-ESLAM E, et al. Expression of shigella flexneri ipaB gene in tobacco[J]. Avicenna J Med Biobechnol, 2013,5(2): 118-124.

    [10] PELLEGRINI L, BURKE D F, MULLOY B. Crystal stucture of fibroblast growth factor receptor ectodomain bound to ligand and heparin [J]. Nature, 2000, 407(6807): 1029-1034.

    [11] JINGYING L, PENGDA M, MEIYING Y, et al. Expression of human acidic fibroblast growth factor in nicotiana benthaminana with a potato-virus-X-based binary vector [J]. Biotechnol Appl Bionchem, 2007, 48(3): 143-147.endprint

    [6] RAMESSAR K, SABALZA M, CAPELL T, et al. Maize plants: An ideal production platform for effective and safe molecular pharming [J]. Plant Sci, 2008, 174(4): 409-419.

    [7] FAN Y J,LI W, WANG J J, et al. Efficient production of human acidic fibroblast growth factor in pea(Pisum sativum L.) plants by agroinfection of germinated seeds[J]. BMC Biotechnology, 2011, 11(45):doi:10.1186/1472-6750-11-45.

    [8] LEUZINGER K, DENT M, HURTADO J, et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins[J]. Jvis EXP,2013,23(77):doi:10. 3791/50521.

    [9] OHADI M, RASOULI R, DARZI-ESLAM E, et al. Expression of shigella flexneri ipaB gene in tobacco[J]. Avicenna J Med Biobechnol, 2013,5(2): 118-124.

    [10] PELLEGRINI L, BURKE D F, MULLOY B. Crystal stucture of fibroblast growth factor receptor ectodomain bound to ligand and heparin [J]. Nature, 2000, 407(6807): 1029-1034.

    [11] JINGYING L, PENGDA M, MEIYING Y, et al. Expression of human acidic fibroblast growth factor in nicotiana benthaminana with a potato-virus-X-based binary vector [J]. Biotechnol Appl Bionchem, 2007, 48(3): 143-147.endprint

    [6] RAMESSAR K, SABALZA M, CAPELL T, et al. Maize plants: An ideal production platform for effective and safe molecular pharming [J]. Plant Sci, 2008, 174(4): 409-419.

    [7] FAN Y J,LI W, WANG J J, et al. Efficient production of human acidic fibroblast growth factor in pea(Pisum sativum L.) plants by agroinfection of germinated seeds[J]. BMC Biotechnology, 2011, 11(45):doi:10.1186/1472-6750-11-45.

    [8] LEUZINGER K, DENT M, HURTADO J, et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins[J]. Jvis EXP,2013,23(77):doi:10. 3791/50521.

    [9] OHADI M, RASOULI R, DARZI-ESLAM E, et al. Expression of shigella flexneri ipaB gene in tobacco[J]. Avicenna J Med Biobechnol, 2013,5(2): 118-124.

    [10] PELLEGRINI L, BURKE D F, MULLOY B. Crystal stucture of fibroblast growth factor receptor ectodomain bound to ligand and heparin [J]. Nature, 2000, 407(6807): 1029-1034.

    [11] JINGYING L, PENGDA M, MEIYING Y, et al. Expression of human acidic fibroblast growth factor in nicotiana benthaminana with a potato-virus-X-based binary vector [J]. Biotechnol Appl Bionchem, 2007, 48(3): 143-147.endprint

    猜你喜歡
    豌豆纖維細(xì)胞緩沖液
    Tiger17促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移
    滇南小耳豬膽道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    豌豆
    大灰狼(2018年5期)2018-06-20 14:49:32
    豌豆笑傳
    豌豆笑傳之拔罐
    胃癌組織中成纖維細(xì)胞生長因子19和成纖維細(xì)胞生長因子受體4的表達(dá)及臨床意義
    豌豆笑傳之吃飯不說話
    兩種制備大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的方法比較
    波多野结衣高清作品| 毛片一级片免费看久久久久 | 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产视频一区二区在线看| 日本与韩国留学比较| 国产精品,欧美在线| 日日撸夜夜添| 啦啦啦韩国在线观看视频| 可以在线观看的亚洲视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人aa在线观看| 久久久色成人| 联通29元200g的流量卡| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 女人被狂操c到高潮| 久久久久久久久中文| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美激情国产日韩精品一区| 十八禁网站免费在线| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲成人久久爱视频| 国产成人a区在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 久久亚洲真实| 精品日产1卡2卡| 91狼人影院| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜激情福利司机影院| 在线播放无遮挡| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产大屁股一区二区在线视频| av天堂中文字幕网| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久久国内视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品无大码| 免费大片18禁| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 看片在线看免费视频| 午夜福利高清视频| 日韩强制内射视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 18+在线观看网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久精品欧美日韩精品| 三级毛片av免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日日啪夜夜撸| 91在线精品国自产拍蜜月| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美日韩国产亚洲二区| 深夜a级毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 老司机福利观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜福利欧美成人| videossex国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线a可以看的网站| avwww免费| 一区福利在线观看| 久久久久久久久久成人| 日韩人妻高清精品专区| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久成人免费电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产中年淑女户外野战色| 成熟少妇高潮喷水视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产伦在线观看视频一区| 99视频精品全部免费 在线| 国产乱人视频| av在线观看视频网站免费| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品国产三级普通话版| 亚洲自偷自拍三级| 99在线人妻在线中文字幕| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲精华国产精华精| 美女 人体艺术 gogo| 国模一区二区三区四区视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 婷婷亚洲欧美| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一本精品99久久精品77| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av成人av| 99热这里只有是精品在线观看| 国产成人一区二区在线| 一区福利在线观看| 国产成人影院久久av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 色哟哟·www| 成人av在线播放网站| 麻豆一二三区av精品| av中文乱码字幕在线| 我要搜黄色片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产亚洲91精品色在线| 午夜爱爱视频在线播放| 国产亚洲精品av在线| 精品人妻视频免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲一区高清亚洲精品| netflix在线观看网站| 永久网站在线| 日韩一区二区视频免费看| 我要搜黄色片| 免费搜索国产男女视频| 乱人视频在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精华一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本三级黄在线观看| 成人综合一区亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产高清视频在线播放一区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 制服丝袜大香蕉在线| 俺也久久电影网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲av.av天堂| 国产精华一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精华国产精华精| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人国产一区最新在线观看| 欧美激情在线99| 一本精品99久久精品77| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 91精品国产九色| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日韩强制内射视频| 日本在线视频免费播放| 亚洲 国产 在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美日韩黄片免| 国国产精品蜜臀av免费| 51国产日韩欧美| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲最大成人手机在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩欧美免费精品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99热这里只有是精品50| 网址你懂的国产日韩在线| av在线观看视频网站免费| 久久久成人免费电影| 波野结衣二区三区在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美区成人在线视频| 美女黄网站色视频| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜老司机福利剧场| 三级毛片av免费| 禁无遮挡网站| 亚洲不卡免费看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人国产麻豆网| 午夜福利在线观看吧| 精品久久久久久久久久久久久| 熟女电影av网| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产探花极品一区二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人影院久久av| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 91狼人影院| 成人一区二区视频在线观看| av.在线天堂| 丰满人妻一区二区三区视频av| av国产免费在线观看| 综合色av麻豆| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美高清成人免费视频www| av天堂中文字幕网| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲精品色激情综合| a在线观看视频网站| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 天堂√8在线中文| 欧美成人a在线观看| 一级av片app| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲成人免费电影在线观看| 深夜a级毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 99久久精品一区二区三区| 在线观看66精品国产| 国产三级在线视频| 久久中文看片网| 一级毛片久久久久久久久女| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av在线老鸭窝| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产高潮美女av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 狠狠狠狠99中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 22中文网久久字幕| 国模一区二区三区四区视频| 国产免费男女视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日本色播在线视频| av女优亚洲男人天堂| 天天一区二区日本电影三级| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品电影一区二区三区| 色吧在线观看| 色av中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久九九精品影院| 成人国产综合亚洲| a级毛片a级免费在线| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩欧美 国产精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美人与善性xxx| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品久久电影中文字幕| 久久人人精品亚洲av| 男插女下体视频免费在线播放| 国产免费男女视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 看片在线看免费视频| 久久99热这里只有精品18| 99热6这里只有精品| 国产熟女欧美一区二区| 我要搜黄色片| 99久久精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 美女 人体艺术 gogo| 国产老妇女一区| 亚洲不卡免费看| 国产男靠女视频免费网站| 最后的刺客免费高清国语| 尾随美女入室| 成人特级av手机在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产 一区精品| av女优亚洲男人天堂| 国语自产精品视频在线第100页| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线播放国产精品三级| 精华霜和精华液先用哪个| 在现免费观看毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美一区二区亚洲| 人人妻人人看人人澡| 91麻豆精品激情在线观看国产| 又爽又黄无遮挡网站| 久久热精品热| 99精品久久久久人妻精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 可以在线观看毛片的网站| 婷婷六月久久综合丁香| 女人被狂操c到高潮| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产精品国产高清国产av| 国国产精品蜜臀av免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜爱爱视频在线播放| av在线蜜桃| 69人妻影院| 联通29元200g的流量卡| 国产精品久久久久久精品电影| 在线免费观看不下载黄p国产 | 嫁个100分男人电影在线观看| 18+在线观看网站| 亚州av有码| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲色图av天堂| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲不卡免费看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲成av人片在线播放无| 黄片wwwwww| 亚洲五月天丁香| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 悠悠久久av| 欧美性感艳星| 亚洲图色成人| 两个人的视频大全免费| 偷拍熟女少妇极品色| 国产 一区 欧美 日韩| 国产三级中文精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲最大成人中文| 日本五十路高清| 亚洲国产欧美人成| av女优亚洲男人天堂| 99久久精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 哪里可以看免费的av片| 成年人黄色毛片网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 两个人的视频大全免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久国内精品自在自线图片| 成人欧美大片| 精品一区二区三区人妻视频| 少妇的逼好多水| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品综合一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 99热6这里只有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 精品一区二区三区视频在线| 尾随美女入室| www日本黄色视频网| 嫁个100分男人电影在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av中文av极速乱 | 日本熟妇午夜| 亚州av有码| 亚洲欧美激情综合另类| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 色哟哟·www| 成人二区视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产亚洲欧美98| 一个人看的www免费观看视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 一个人看视频在线观看www免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美人与善性xxx| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文字幕av在线有码专区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 亚洲无线在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 男人舔奶头视频| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜精品一区二区三区免费看| 22中文网久久字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美区成人在线视频| 黄片wwwwww| 在现免费观看毛片| 伦精品一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| aaaaa片日本免费| 国产熟女欧美一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 性欧美人与动物交配| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线观看美女被高潮喷水网站| 观看免费一级毛片| 国产三级在线视频| 午夜精品在线福利| 天天一区二区日本电影三级| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色av中文字幕| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91狼人影院| 91在线精品国自产拍蜜月| 看十八女毛片水多多多| 日韩欧美精品免费久久| 色哟哟哟哟哟哟| 一进一出抽搐动态| 国产精品福利在线免费观看| 精品日产1卡2卡| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产综合懂色| 九色成人免费人妻av| 国产精品电影一区二区三区| or卡值多少钱| 天天一区二区日本电影三级| 欧美成人一区二区免费高清观看| 熟女电影av网| 在线免费十八禁| 日日啪夜夜撸| 中文字幕免费在线视频6| 国产免费av片在线观看野外av| 国产综合懂色| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美zozozo另类| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 国产极品精品免费视频能看的| 最近在线观看免费完整版| 中文字幕av成人在线电影| 两人在一起打扑克的视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产在视频线在精品| 国产成年人精品一区二区| 日日夜夜操网爽| 亚洲最大成人av| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲中文字幕日韩| 午夜激情福利司机影院| eeuss影院久久| 午夜久久久久精精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费在线观看成人毛片| 精品久久久久久成人av| 美女免费视频网站| 国产69精品久久久久777片| 成人毛片a级毛片在线播放| 成人无遮挡网站| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 不卡一级毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品久久久久久久久av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 一区二区三区高清视频在线| 免费观看的影片在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 成人午夜高清在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 可以在线观看毛片的网站| 国产亚洲91精品色在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久久久久久大av| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美bdsm另类| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 极品教师在线视频| 亚洲自拍偷在线| 美女高潮的动态| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产伦在线观看视频一区| 夜夜爽天天搞| 91久久精品电影网| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲18禁久久av| 午夜视频国产福利| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 人妻夜夜爽99麻豆av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产高潮美女av| 成人性生交大片免费视频hd| 简卡轻食公司| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费人成在线观看视频色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品国产亚洲网站| 嫩草影视91久久| 午夜精品在线福利| 国内精品美女久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 网址你懂的国产日韩在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久免费精品人妻一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美潮喷喷水| 久久久久久大精品| 中文字幕av在线有码专区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 窝窝影院91人妻| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲成av人片在线播放无| 深爱激情五月婷婷| 不卡视频在线观看欧美| 岛国在线免费视频观看| 黄色一级大片看看| 亚洲五月天丁香| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美激情在线99| 亚洲中文字幕日韩| 欧美3d第一页| 天堂动漫精品| 一个人看视频在线观看www免费| 毛片女人毛片| www日本黄色视频网| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美在线一区亚洲| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲美女搞黄在线观看 | 欧美在线一区亚洲| 日韩人妻高清精品专区| 日本在线视频免费播放| 日韩强制内射视频| 免费av不卡在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 热99在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国模一区二区三区四区视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 老女人水多毛片| 偷拍熟女少妇极品色| 成年女人看的毛片在线观看| 99久国产av精品| 九色成人免费人妻av| 白带黄色成豆腐渣| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久久久久大av| 亚洲无线观看免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人一区二区视频在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日日啪夜夜撸| 男女那种视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 动漫黄色视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 日韩精品中文字幕看吧| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久久久久大av| 国产免费男女视频| 国产人妻一区二区三区在| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在线播放无遮挡| 99riav亚洲国产免费| 国产真实伦视频高清在线观看 | 最近中文字幕高清免费大全6 | 毛片女人毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜日韩欧美国产| 俺也久久电影网| 一级a爱片免费观看的视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 97热精品久久久久久| 精品人妻视频免费看| 国产av麻豆久久久久久久| 久久久久国内视频| 美女大奶头视频| 99精品在免费线老司机午夜| 久久午夜福利片| 少妇人妻一区二区三区视频| 窝窝影院91人妻| www.www免费av| www日本黄色视频网| 看黄色毛片网站| 禁无遮挡网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 中文资源天堂在线| 精品一区二区三区视频在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av在线亚洲专区| 成人av在线播放网站| 日日撸夜夜添| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲18禁久久av| 最新在线观看一区二区三区| 床上黄色一级片| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 嫩草影院精品99| 国内精品美女久久久久久| 亚洲第一电影网av|