• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外源基因轉(zhuǎn)化的影響

    2014-10-22 23:53:06李猷尹蕾唐凱悅律鳳霞
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年17期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化率番茄

    李猷+尹蕾+唐凱悅+律鳳霞

    摘要:以番茄葉片為外植體,含有煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的工程農(nóng)桿菌LBA4404為外源基因轉(zhuǎn)化的雙元載體,通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤(pán)法將外源基因轉(zhuǎn)入番茄,轉(zhuǎn)化前將番茄葉片進(jìn)行不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng),研究外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明,最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率均達(dá)到70%以上。

    關(guān)鍵詞:番茄;煙草花葉病毒;預(yù)培養(yǎng)時(shí)間;轉(zhuǎn)化率

    中圖分類號(hào):S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)17-4208-03

    Effects of Pre-culture Time of Explants on the Exogenous Gene

    Transformation in Tomato

    LI You,YIN Lei,TANG Kai-yue,L?譈 Feng-xia

    (Department of Biology, Mudanjiang Normal College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China)

    Abstract: The leaves of tomato were used as explants and the Agrobacterium (LBA4404) was used as binary vector containing tobacco mosaic virus replicase gene(TMV-rep), the pre-culture time before transformation was optimized. The results showed that the pre-culture time had significant effects on transgenic rate. The optimal pre-culture time was 32~48 hours,with transformation rate of more than 70%.

    Key words:tomato;tobacco mosaic virus;pre-culture time; transgenic rate

    番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一,營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美。隨著番茄種植區(qū)域和面積的不斷擴(kuò)大,病蟲(chóng)害成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素,造成的損失可達(dá)50%~100%[1]。病毒病是番茄的主要病害之一,每年造成番茄不同程度減產(chǎn)。危害番茄的病毒主要有煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、黃瓜卷葉病毒(TYL2CV)、苜?;ㄈ~病毒(AIMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)等[2]??梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)雜交或回交等手段,獲得綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良且抗病的番茄品種,但常規(guī)育種手段在提高番茄抗病性方面進(jìn)展速度有限,而以病毒來(lái)源的基因介導(dǎo)抗性所取得的成就較大。目前,番茄抗病毒病基因工程培育出了能穩(wěn)定遺傳的抗病毒植株,除外殼蛋白基因外,在番茄上主要采用衛(wèi)星RNA基因、反義RNA基因等方法獲得抗病毒番茄。通過(guò)RNA干擾技術(shù)獲得的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物符合人們對(duì)生物安全性的高要求,但這種技術(shù)在番茄上的應(yīng)用不多[3-5]。尤其是RNA干擾外源基因載體對(duì)番茄轉(zhuǎn)化時(shí),轉(zhuǎn)化率成為限制轉(zhuǎn)化成功的主要因素之一[3-5]。本試驗(yàn)以含有煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的工程農(nóng)桿菌介導(dǎo),將外源基因向番茄中轉(zhuǎn)化,以番茄葉片為外植體,通過(guò)不同時(shí)間的外植體預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)基因轉(zhuǎn)化,篩選外源基因轉(zhuǎn)化體系的最佳外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[6-11]。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    番茄種子:購(gòu)于牡丹江市種子商店。

    基因雙元載體工程菌:含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿菌LBA4404,黑龍江省煙草科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。誘導(dǎo)愈傷組織及芽分化的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(其中添加0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)。

    1.2 藥劑和儀器

    藥劑:奈乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、卡那霉素(Kan)、羧芐青霉素(cb)、瓊脂粉、0.1%升汞、無(wú)水乙醇等,均為分析純。

    儀器:日立Z-3000型紫外分光光度儀;美國(guó)BECKMAN高速冷凍離心機(jī);水浴鍋;天平;電泳儀;培養(yǎng)箱等。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 無(wú)菌材料的準(zhǔn)備 取番茄種子2 g,放入無(wú)菌三角瓶中,先用75%乙醇進(jìn)行表面消毒,再用消毒水(5%的漂白粉配制)的過(guò)濾液浸泡30 min。用無(wú)菌水沖洗9~10次,將沖洗干凈的種子放在無(wú)菌紙上,將水分吸干,小心放置在1/2MS培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)室光照培養(yǎng)。7~10 d后番茄種子發(fā)芽, 長(zhǎng)出小葉芽,將葉芽剪出傷口,平鋪在MS(含有0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)7~8 d。愈傷組織長(zhǎng)出后,10~15 d轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中,20 d左右可分化出番茄植株,25 d后從培養(yǎng)皿中取出,放在三角瓶中培養(yǎng)待用。

    1.3.2 無(wú)菌番茄葉片預(yù)培養(yǎng)及侵染 將培養(yǎng)好的無(wú)菌番茄幼苗按葉盤(pán)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化前預(yù)培養(yǎng),即將無(wú)菌番茄苗葉片剪成四周有傷口的葉盤(pán),正面朝上擺在有MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h)放入26 ℃培養(yǎng)室內(nèi)光照預(yù)培養(yǎng)。

    工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)番茄具體過(guò)程:

    1)取低溫保存含TMV-rep基因的農(nóng)桿菌LBA4404,在YEB固體培養(yǎng)基[含50 mg/L Kan和50 mg/L利褔平(Rif)]低于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種于20 mL YEB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif)中,28 ℃震蕩(150 r/min)培養(yǎng)2~3 d。endprint

    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 沈福弟,沈進(jìn)高,孫 軍,等.番茄主要病蟲(chóng)害防治技術(shù)[J].上海蔬菜,2009(5):72-73.

    [2] 李 慧.加工番茄主要病蟲(chóng)害的發(fā)生與防治對(duì)策[J].農(nóng)村科技, 2008(4):41.

    [3] 周靜亞,徐忠傳,張保龍,等.AP70抗病基因轉(zhuǎn)化番茄的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(13):5323-5324.

    [4] 王全華,王秀峰.番茄抗病基因工程育種研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,34(4): 600-604.

    [5] 趙 爽,雷建軍,陳國(guó)菊,等.番茄抗病毒基因工程研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究,2007,41(11):83-86.

    [6] 律鳳霞,潘永明,郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(10):1962-1966.

    [7] 律鳳霞,郭兆奎,顏培強(qiáng),等.TMV復(fù)制酶基因靶向的RNA干涉載體構(gòu)建[J].植物研究,2008,28(3):310-314.

    [8] 潘永明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化番茄體系優(yōu)化[J].北方園藝,2010(18):142-144.

    [9] WANG Y H, MOSEBACH C M, KIBBEY A S, et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep,2009,27(4): 454-461.

    [10] EOM H, LEE C G, JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta,2006,223(6):1231-1242.

    [11] LI W Z, CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes: Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta,2004,220(2): 318-330.endprint

    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 沈福弟,沈進(jìn)高,孫 軍,等.番茄主要病蟲(chóng)害防治技術(shù)[J].上海蔬菜,2009(5):72-73.

    [2] 李 慧.加工番茄主要病蟲(chóng)害的發(fā)生與防治對(duì)策[J].農(nóng)村科技, 2008(4):41.

    [3] 周靜亞,徐忠傳,張保龍,等.AP70抗病基因轉(zhuǎn)化番茄的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(13):5323-5324.

    [4] 王全華,王秀峰.番茄抗病基因工程育種研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,34(4): 600-604.

    [5] 趙 爽,雷建軍,陳國(guó)菊,等.番茄抗病毒基因工程研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究,2007,41(11):83-86.

    [6] 律鳳霞,潘永明,郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(10):1962-1966.

    [7] 律鳳霞,郭兆奎,顏培強(qiáng),等.TMV復(fù)制酶基因靶向的RNA干涉載體構(gòu)建[J].植物研究,2008,28(3):310-314.

    [8] 潘永明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化番茄體系優(yōu)化[J].北方園藝,2010(18):142-144.

    [9] WANG Y H, MOSEBACH C M, KIBBEY A S, et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep,2009,27(4): 454-461.

    [10] EOM H, LEE C G, JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta,2006,223(6):1231-1242.

    [11] LI W Z, CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes: Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta,2004,220(2): 318-330.endprint

    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 沈福弟,沈進(jìn)高,孫 軍,等.番茄主要病蟲(chóng)害防治技術(shù)[J].上海蔬菜,2009(5):72-73.

    [2] 李 慧.加工番茄主要病蟲(chóng)害的發(fā)生與防治對(duì)策[J].農(nóng)村科技, 2008(4):41.

    [3] 周靜亞,徐忠傳,張保龍,等.AP70抗病基因轉(zhuǎn)化番茄的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(13):5323-5324.

    [4] 王全華,王秀峰.番茄抗病基因工程育種研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,34(4): 600-604.

    [5] 趙 爽,雷建軍,陳國(guó)菊,等.番茄抗病毒基因工程研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究,2007,41(11):83-86.

    [6] 律鳳霞,潘永明,郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(10):1962-1966.

    [7] 律鳳霞,郭兆奎,顏培強(qiáng),等.TMV復(fù)制酶基因靶向的RNA干涉載體構(gòu)建[J].植物研究,2008,28(3):310-314.

    [8] 潘永明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化番茄體系優(yōu)化[J].北方園藝,2010(18):142-144.

    [9] WANG Y H, MOSEBACH C M, KIBBEY A S, et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep,2009,27(4): 454-461.

    [10] EOM H, LEE C G, JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta,2006,223(6):1231-1242.

    [11] LI W Z, CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes: Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta,2004,220(2): 318-330.endprint

    猜你喜歡
    轉(zhuǎn)化率番茄
    我國(guó)全產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域平均國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化率已達(dá)75%
    番茄炒蛋
    秋茬番茄“疑難雜癥”如何挽救
    番茄果實(shí)“起棱”怎么辦
    冬天的番茄為啥不太好吃
    啟蒙(3-7歲)(2018年2期)2018-03-15 08:03:44
    曲料配比與米渣生醬油蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性
    番茄炒蛋做成功啦
    透視化學(xué)平衡中的轉(zhuǎn)化率
    影響轉(zhuǎn)化率的因素
    微量改性單體與四(偏)氟乙烯等共聚的組成及轉(zhuǎn)化率模擬
    亚洲欧美日韩东京热| 我要看日韩黄色一级片| 婷婷色av中文字幕| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品色激情综合| 亚洲美女视频黄频| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日日啪夜夜爽| 免费在线观看成人毛片| 久久久久国产精品人妻一区二区| a级毛色黄片| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲欧美精品永久| 一区二区三区精品91| 1000部很黄的大片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 看十八女毛片水多多多| 尾随美女入室| 一区二区三区四区激情视频| 国产黄频视频在线观看| 国产永久视频网站| 精品熟女少妇av免费看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产久久久一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品久久久久成人av| 免费观看性生交大片5| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 日本黄大片高清| 亚洲在久久综合| 久久久精品免费免费高清| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 在线免费十八禁| 99久久精品国产国产毛片| 成人无遮挡网站| 成人无遮挡网站| 天天躁日日操中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 超碰av人人做人人爽久久| 多毛熟女@视频| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品福利在线免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本-黄色视频高清免费观看| 女人久久www免费人成看片| 色5月婷婷丁香| 午夜免费男女啪啪视频观看| 18+在线观看网站| 人人妻人人看人人澡| 少妇的逼水好多| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧美日韩东京热| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 免费在线观看成人毛片| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人aa在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品夜色国产| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 成年免费大片在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 另类亚洲欧美激情| 久久这里有精品视频免费| 99久久精品一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91精品一卡2卡3卡4卡| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产在线免费精品| 三级经典国产精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品亚洲一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一区在线观看完整版| 蜜臀久久99精品久久宅男| 婷婷色综合大香蕉| 少妇人妻久久综合中文| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 赤兔流量卡办理| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美+日韩+精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产av码专区亚洲av| 黄色日韩在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久成人免费电影| www.色视频.com| 九色成人免费人妻av| av国产精品久久久久影院| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 高清毛片免费看| h视频一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产有黄有色有爽视频| 欧美精品一区二区大全| 日本色播在线视频| www.色视频.com| 我的女老师完整版在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 熟女av电影| 日本黄色日本黄色录像| 看十八女毛片水多多多| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品久久久久久久电影| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲怡红院男人天堂| 视频区图区小说| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线观看美女被高潮喷水网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 97热精品久久久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美丝袜亚洲另类| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产色爽女视频免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 边亲边吃奶的免费视频| 国产黄频视频在线观看| 亚洲综合色惰| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费大片18禁| videossex国产| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲成人一二三区av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久久久久久成人| 精品国产露脸久久av麻豆| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 又大又黄又爽视频免费| 欧美精品一区二区免费开放| 免费高清在线观看视频在线观看| 中文天堂在线官网| 少妇丰满av| 国产精品欧美亚洲77777| 久久午夜福利片| 亚洲欧美清纯卡通| 久久精品夜色国产| 中文在线观看免费www的网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 成人国产麻豆网| 成人影院久久| 一区二区三区免费毛片| 色视频www国产| 一个人免费看片子| 亚洲最大成人中文| 人妻夜夜爽99麻豆av| 婷婷色综合大香蕉| 男女边吃奶边做爰视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲欧洲日产国产| av国产久精品久网站免费入址| 三级国产精品片| 欧美一级a爱片免费观看看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人无遮挡网站| 热re99久久精品国产66热6| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲国产精品成人久久小说| 97在线人人人人妻| 国产精品99久久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 日韩三级伦理在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| tube8黄色片| 亚洲中文av在线| 亚洲真实伦在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 一区二区三区免费毛片| 免费看日本二区| 18+在线观看网站| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久99热这里只有精品18| 成人漫画全彩无遮挡| 97精品久久久久久久久久精品| av在线老鸭窝| 亚洲无线观看免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 少妇 在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 日日摸夜夜添夜夜爱| 五月天丁香电影| 99国产精品免费福利视频| 亚洲最大成人中文| 日本与韩国留学比较| 在线观看三级黄色| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产69精品久久久久777片| av在线app专区| a级一级毛片免费在线观看| 内射极品少妇av片p| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品一二三| 大陆偷拍与自拍| 久久精品人妻少妇| 视频区图区小说| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲成人手机| 国产精品一区www在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 99热这里只有精品一区| 国产欧美日韩精品一区二区| 内射极品少妇av片p| 男女啪啪激烈高潮av片| 视频区图区小说| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人和女人高潮做爰伦理| 美女视频免费永久观看网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美区成人在线视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美性感艳星| 久久久色成人| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| videos熟女内射| 极品少妇高潮喷水抽搐| 蜜桃在线观看..| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费观看av网站的网址| 男女边摸边吃奶| 国产精品一及| 一级毛片久久久久久久久女| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品一及| 麻豆乱淫一区二区| 岛国毛片在线播放| 搡老乐熟女国产| 国产av国产精品国产| 国产欧美亚洲国产| 岛国毛片在线播放| 欧美bdsm另类| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品三级大全| 亚洲高清免费不卡视频| 久久99热6这里只有精品| 国产日韩欧美在线精品| 波野结衣二区三区在线| 国产成人精品久久久久久| 日本wwww免费看| 偷拍熟女少妇极品色| 卡戴珊不雅视频在线播放| 少妇熟女欧美另类| a级一级毛片免费在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 97超视频在线观看视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久婷婷青草| 欧美xxⅹ黑人| 大码成人一级视频| 国产精品久久久久成人av| 97在线人人人人妻| h日本视频在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人特级av手机在线观看| a级毛色黄片| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲色图av天堂| 哪个播放器可以免费观看大片| 男男h啪啪无遮挡| av黄色大香蕉| 看免费成人av毛片| 成人黄色视频免费在线看| 欧美性感艳星| 免费黄色在线免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av免费观看日本| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品久久久久久久性| 成人综合一区亚洲| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本-黄色视频高清免费观看| 在线观看三级黄色| 国内精品宾馆在线| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 国产成人免费观看mmmm| 最后的刺客免费高清国语| 国产乱人偷精品视频| 国产av码专区亚洲av| 男人舔奶头视频| 高清日韩中文字幕在线| av国产精品久久久久影院| 国产欧美亚洲国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 免费看av在线观看网站| av视频免费观看在线观看| 国产一区二区三区av在线| 最后的刺客免费高清国语| 久久亚洲国产成人精品v| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲三级黄色毛片| 久久99蜜桃精品久久| 国产在视频线精品| 赤兔流量卡办理| 制服丝袜香蕉在线| 成人特级av手机在线观看| 如何舔出高潮| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久久久久人妻| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产乱来视频区| .国产精品久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久青草综合色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久鲁丝午夜福利片| 婷婷色综合大香蕉| 日本一二三区视频观看| 一级爰片在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜视频国产福利| 免费观看a级毛片全部| 嫩草影院新地址| 18禁动态无遮挡网站| 国产探花极品一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品女同一区二区软件| 国产在线一区二区三区精| av.在线天堂| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 最后的刺客免费高清国语| 一个人免费看片子| freevideosex欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 热re99久久精品国产66热6| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黑人高潮一二区| 人妻少妇偷人精品九色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲精品乱久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产视频首页在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 大片免费播放器 马上看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品,欧美精品| 在线观看免费高清a一片| 日韩电影二区| 黄片无遮挡物在线观看| 精品久久久久久久末码| 久久这里有精品视频免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| 卡戴珊不雅视频在线播放| av专区在线播放| 亚洲天堂av无毛| 一级毛片我不卡| 在线观看免费视频网站a站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品自拍成人| 国精品久久久久久国模美| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲国产精品专区欧美| 久久久久性生活片| 亚洲色图av天堂| 国产精品三级大全| 香蕉精品网在线| 少妇高潮的动态图| 有码 亚洲区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 1000部很黄的大片| 免费观看性生交大片5| videos熟女内射| 午夜福利在线在线| 高清不卡的av网站| 久热这里只有精品99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品不卡视频一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品久久久久久久末码| 秋霞伦理黄片| av免费观看日本| 成年人午夜在线观看视频| 国产探花极品一区二区| 日韩大片免费观看网站| 久久久久性生活片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 大码成人一级视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲va在线va天堂va国产| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲真实伦在线观看| 一区二区三区免费毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 熟女人妻精品中文字幕| av天堂中文字幕网| 国产高清国产精品国产三级 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲真实伦在线观看| 少妇熟女欧美另类| 99热网站在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 精品人妻视频免费看| 精品久久久精品久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩制服骚丝袜av| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲第一av免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产视频首页在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲欧美精品永久| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久国产网址| 大香蕉97超碰在线| 高清午夜精品一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品一及| tube8黄色片| av一本久久久久| 熟女av电影| 最近中文字幕高清免费大全6| 成人亚洲欧美一区二区av| 能在线免费看毛片的网站| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品日本国产第一区| 一区二区三区精品91| 国产久久久一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产色婷婷99| 日韩成人av中文字幕在线观看| 色网站视频免费| 精品人妻熟女av久视频| 黄片wwwwww| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品一区二区在线不卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 精品人妻一区二区三区麻豆| 91久久精品国产一区二区三区| 九草在线视频观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一区二区三区精品91| 老熟女久久久| 日韩av免费高清视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲综合精品二区| 午夜日本视频在线| 亚洲图色成人| 国产精品三级大全| 少妇高潮的动态图| 国产人妻一区二区三区在| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧洲日产国产| 色综合色国产| a 毛片基地| 日韩中字成人| 免费人成在线观看视频色| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人一区二区视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 欧美+日韩+精品| 日本一二三区视频观看| 久久99蜜桃精品久久| 欧美3d第一页| 精品一区二区免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一级毛片久久久久久久久女| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久99热6这里只有精品| 欧美日韩视频精品一区| 欧美一级a爱片免费观看看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久婷婷青草| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产有黄有色有爽视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产精品999| 伦理电影免费视频| 91狼人影院| 激情 狠狠 欧美| 蜜桃在线观看..| 国产高清国产精品国产三级 | 哪个播放器可以免费观看大片| 热99国产精品久久久久久7| 岛国毛片在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 久久这里有精品视频免费| 777米奇影视久久| 高清毛片免费看| 在线观看一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 91精品伊人久久大香线蕉| 黄色日韩在线| av国产久精品久网站免费入址| 99视频精品全部免费 在线| 国产高清国产精品国产三级 | av天堂中文字幕网| 有码 亚洲区| 在线观看一区二区三区激情| 777米奇影视久久| 观看免费一级毛片| 99热网站在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久久久久久久成人| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美bdsm另类| 夜夜爽夜夜爽视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久久久国产电影| 伦理电影免费视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 秋霞在线观看毛片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一区二区三区乱码不卡18| 街头女战士在线观看网站| 国产色婷婷99| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 少妇的逼好多水| 亚洲中文av在线| 少妇熟女欧美另类| 少妇丰满av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美3d第一页| 亚洲精品自拍成人| 人妻系列 视频| 一区在线观看完整版| 性色av一级| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲美女视频黄频| 高清毛片免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 视频中文字幕在线观看| 国产永久视频网站| 极品教师在线视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品久久久久久精品古装| xxx大片免费视频| 亚洲成色77777|