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    外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外源基因轉(zhuǎn)化的影響

    2014-10-22 23:53:06李猷尹蕾唐凱悅律鳳霞
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年17期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化率番茄

    李猷+尹蕾+唐凱悅+律鳳霞

    摘要:以番茄葉片為外植體,含有煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的工程農(nóng)桿菌LBA4404為外源基因轉(zhuǎn)化的雙元載體,通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤(pán)法將外源基因轉(zhuǎn)入番茄,轉(zhuǎn)化前將番茄葉片進(jìn)行不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng),研究外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明,最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率均達(dá)到70%以上。

    關(guān)鍵詞:番茄;煙草花葉病毒;預(yù)培養(yǎng)時(shí)間;轉(zhuǎn)化率

    中圖分類號(hào):S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)17-4208-03

    Effects of Pre-culture Time of Explants on the Exogenous Gene

    Transformation in Tomato

    LI You,YIN Lei,TANG Kai-yue,L?譈 Feng-xia

    (Department of Biology, Mudanjiang Normal College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China)

    Abstract: The leaves of tomato were used as explants and the Agrobacterium (LBA4404) was used as binary vector containing tobacco mosaic virus replicase gene(TMV-rep), the pre-culture time before transformation was optimized. The results showed that the pre-culture time had significant effects on transgenic rate. The optimal pre-culture time was 32~48 hours,with transformation rate of more than 70%.

    Key words:tomato;tobacco mosaic virus;pre-culture time; transgenic rate

    番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一,營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美。隨著番茄種植區(qū)域和面積的不斷擴(kuò)大,病蟲(chóng)害成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素,造成的損失可達(dá)50%~100%[1]。病毒病是番茄的主要病害之一,每年造成番茄不同程度減產(chǎn)。危害番茄的病毒主要有煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、黃瓜卷葉病毒(TYL2CV)、苜?;ㄈ~病毒(AIMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)等[2]??梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)雜交或回交等手段,獲得綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良且抗病的番茄品種,但常規(guī)育種手段在提高番茄抗病性方面進(jìn)展速度有限,而以病毒來(lái)源的基因介導(dǎo)抗性所取得的成就較大。目前,番茄抗病毒病基因工程培育出了能穩(wěn)定遺傳的抗病毒植株,除外殼蛋白基因外,在番茄上主要采用衛(wèi)星RNA基因、反義RNA基因等方法獲得抗病毒番茄。通過(guò)RNA干擾技術(shù)獲得的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物符合人們對(duì)生物安全性的高要求,但這種技術(shù)在番茄上的應(yīng)用不多[3-5]。尤其是RNA干擾外源基因載體對(duì)番茄轉(zhuǎn)化時(shí),轉(zhuǎn)化率成為限制轉(zhuǎn)化成功的主要因素之一[3-5]。本試驗(yàn)以含有煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的工程農(nóng)桿菌介導(dǎo),將外源基因向番茄中轉(zhuǎn)化,以番茄葉片為外植體,通過(guò)不同時(shí)間的外植體預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)基因轉(zhuǎn)化,篩選外源基因轉(zhuǎn)化體系的最佳外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[6-11]。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    番茄種子:購(gòu)于牡丹江市種子商店。

    基因雙元載體工程菌:含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿菌LBA4404,黑龍江省煙草科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。誘導(dǎo)愈傷組織及芽分化的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(其中添加0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)。

    1.2 藥劑和儀器

    藥劑:奈乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、卡那霉素(Kan)、羧芐青霉素(cb)、瓊脂粉、0.1%升汞、無(wú)水乙醇等,均為分析純。

    儀器:日立Z-3000型紫外分光光度儀;美國(guó)BECKMAN高速冷凍離心機(jī);水浴鍋;天平;電泳儀;培養(yǎng)箱等。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 無(wú)菌材料的準(zhǔn)備 取番茄種子2 g,放入無(wú)菌三角瓶中,先用75%乙醇進(jìn)行表面消毒,再用消毒水(5%的漂白粉配制)的過(guò)濾液浸泡30 min。用無(wú)菌水沖洗9~10次,將沖洗干凈的種子放在無(wú)菌紙上,將水分吸干,小心放置在1/2MS培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)室光照培養(yǎng)。7~10 d后番茄種子發(fā)芽, 長(zhǎng)出小葉芽,將葉芽剪出傷口,平鋪在MS(含有0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)7~8 d。愈傷組織長(zhǎng)出后,10~15 d轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中,20 d左右可分化出番茄植株,25 d后從培養(yǎng)皿中取出,放在三角瓶中培養(yǎng)待用。

    1.3.2 無(wú)菌番茄葉片預(yù)培養(yǎng)及侵染 將培養(yǎng)好的無(wú)菌番茄幼苗按葉盤(pán)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化前預(yù)培養(yǎng),即將無(wú)菌番茄苗葉片剪成四周有傷口的葉盤(pán),正面朝上擺在有MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h)放入26 ℃培養(yǎng)室內(nèi)光照預(yù)培養(yǎng)。

    工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)番茄具體過(guò)程:

    1)取低溫保存含TMV-rep基因的農(nóng)桿菌LBA4404,在YEB固體培養(yǎng)基[含50 mg/L Kan和50 mg/L利褔平(Rif)]低于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種于20 mL YEB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif)中,28 ℃震蕩(150 r/min)培養(yǎng)2~3 d。endprint

    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 沈福弟,沈進(jìn)高,孫 軍,等.番茄主要病蟲(chóng)害防治技術(shù)[J].上海蔬菜,2009(5):72-73.

    [2] 李 慧.加工番茄主要病蟲(chóng)害的發(fā)生與防治對(duì)策[J].農(nóng)村科技, 2008(4):41.

    [3] 周靜亞,徐忠傳,張保龍,等.AP70抗病基因轉(zhuǎn)化番茄的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(13):5323-5324.

    [4] 王全華,王秀峰.番茄抗病基因工程育種研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,34(4): 600-604.

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    [6] 律鳳霞,潘永明,郭兆奎.外源RNA干涉基因在煙草中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)[J].西北植物學(xué)報(bào),2009,29(10):1962-1966.

    [7] 律鳳霞,郭兆奎,顏培強(qiáng),等.TMV復(fù)制酶基因靶向的RNA干涉載體構(gòu)建[J].植物研究,2008,28(3):310-314.

    [8] 潘永明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化番茄體系優(yōu)化[J].北方園藝,2010(18):142-144.

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    [11] LI W Z, CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes: Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta,2004,220(2): 318-330.endprint

    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

    參考文獻(xiàn):

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    [5] 趙 爽,雷建軍,陳國(guó)菊,等.番茄抗病毒基因工程研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究,2007,41(11):83-86.

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    2)菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3~0.7時(shí),取25~30 mL倒入無(wú)菌離心管中,于4 ℃下5 000 r/min離心5 min,去掉上清液,用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái),倒入三角瓶中,27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    3)將搖床中的菌液取出,倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,輕微搖勻,浸泡5~8 min。倒出菌液,將葉片夾出在吸水紙(無(wú)菌紙)上吸干表面的水分,放在MS液體培養(yǎng)基(含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA)浸濕的無(wú)菌紙上,正面向上,再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層,用MS液體共培養(yǎng)基封口,放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

    4)培養(yǎng)3 d后,將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb),傷口與培養(yǎng)基充分接觸,27 ℃下光照培養(yǎng)。

    5)培養(yǎng)10~15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù),30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb)繼續(xù)觀察葉芽的變化,記錄葉芽黃化情況,根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

    轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

    含煙草花葉病毒外殼蛋白(TMV-rep)基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中,添加了抗卡那霉素基因,轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性,故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

    從圖1可以看出,侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉片明顯膨大,葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L,以抑菌為主;而卡那霉素的濃度只有50 mg/L,以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,且數(shù)量較多。

    由圖2可知,番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后,葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化,因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度,為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用;卡那霉素的濃度增加到100 mg/L,增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少,葉片愈傷細(xì)胞黃化,達(dá)到了篩選目的。

    由圖3可知,2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽,同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象,是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果??筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

    2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

    從表1可以看出,預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加,但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32~48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加,其轉(zhuǎn)化率均大于70%,差異均達(dá)極顯著水平;當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后,轉(zhuǎn)化率大幅度下降,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0,說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合,這時(shí)菌液浸泡葉芽,工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

    3 小結(jié)

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32~48 h,番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32~48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作,此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷,細(xì)胞完整吸附效果好,能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

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