外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外源基因轉(zhuǎn)化的影響

李猷+尹蕾+唐凱悅+律鳳霞

摘要：以番茄葉片為外植體，含有煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的工程農(nóng)桿菌LBA4404為外源基因轉(zhuǎn)化的雙元載體，通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤(pán)法將外源基因轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)化前將番茄葉片進(jìn)行不同時(shí)間預(yù)培養(yǎng)，研究外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32～48 h，番茄外植體轉(zhuǎn)化率均達(dá)到70%以上。

關(guān)鍵詞：番茄；煙草花葉病毒；預(yù)培養(yǎng)時(shí)間；轉(zhuǎn)化率

中圖分類號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）17-4208-03

Effects of Pre-culture Time of Explants on the Exogenous Gene

Transformation in Tomato

LI You，YIN Lei，TANG Kai-yue，L？譈 Feng-xia

（Department of Biology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China）

Abstract： The leaves of tomato were used as explants and the Agrobacterium （LBA4404） was used as binary vector containing tobacco mosaic virus replicase gene（TMV-rep）， the pre-culture time before transformation was optimized. The results showed that the pre-culture time had significant effects on transgenic rate. The optimal pre-culture time was 32～48 hours，with transformation rate of more than 70%.

Key words：tomato；tobacco mosaic virus；pre-culture time； transgenic rate

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美。隨著番茄種植區(qū)域和面積的不斷擴(kuò)大，病蟲(chóng)害成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，造成的損失可達(dá)50%～100%[1]。病毒病是番茄的主要病害之一，每年造成番茄不同程度減產(chǎn)。危害番茄的病毒主要有煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、黃瓜卷葉病毒（TYL2CV）、苜?；ㄈ~病毒（AIMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）等[2]?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)雜交或回交等手段，獲得綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良且抗病的番茄品種，但常規(guī)育種手段在提高番茄抗病性方面進(jìn)展速度有限，而以病毒來(lái)源的基因介導(dǎo)抗性所取得的成就較大。目前，番茄抗病毒病基因工程培育出了能穩(wěn)定遺傳的抗病毒植株，除外殼蛋白基因外，在番茄上主要采用衛(wèi)星RNA基因、反義RNA基因等方法獲得抗病毒番茄。通過(guò)RNA干擾技術(shù)獲得的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物符合人們對(duì)生物安全性的高要求，但這種技術(shù)在番茄上的應(yīng)用不多[3-5]。尤其是RNA干擾外源基因載體對(duì)番茄轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化率成為限制轉(zhuǎn)化成功的主要因素之一[3-5]。本試驗(yàn)以含有煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的工程農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將外源基因向番茄中轉(zhuǎn)化，以番茄葉片為外植體，通過(guò)不同時(shí)間的外植體預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)基因轉(zhuǎn)化，篩選外源基因轉(zhuǎn)化體系的最佳外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[6-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄種子：購(gòu)于牡丹江市種子商店。

基因雙元載體工程菌：含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農(nóng)桿菌LBA4404，黑龍江省煙草科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。誘導(dǎo)愈傷組織及芽分化的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（其中添加0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）。

1.2 藥劑和儀器

藥劑：奈乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、卡那霉素（Kan）、羧芐青霉素（cb）、瓊脂粉、0.1%升汞、無(wú)水乙醇等，均為分析純。

儀器：日立Z-3000型紫外分光光度儀；美國(guó)BECKMAN高速冷凍離心機(jī)；水浴鍋；天平；電泳儀；培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)菌材料的準(zhǔn)備 取番茄種子2 g，放入無(wú)菌三角瓶中，先用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，再用消毒水（5%的漂白粉配制）的過(guò)濾液浸泡30 min。用無(wú)菌水沖洗9～10次，將沖洗干凈的種子放在無(wú)菌紙上，將水分吸干，小心放置在1/2MS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)室光照培養(yǎng)。7～10 d后番茄種子發(fā)芽， 長(zhǎng)出小葉芽，將葉芽剪出傷口，平鋪在MS（含有0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)7～8 d。愈傷組織長(zhǎng)出后，10～15 d轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，20 d左右可分化出番茄植株，25 d后從培養(yǎng)皿中取出，放在三角瓶中培養(yǎng)待用。

1.3.2 無(wú)菌番茄葉片預(yù)培養(yǎng)及侵染 將培養(yǎng)好的無(wú)菌番茄幼苗按葉盤(pán)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化前預(yù)培養(yǎng)，即將無(wú)菌番茄苗葉片剪成四周有傷口的葉盤(pán)，正面朝上擺在有MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h）放入26 ℃培養(yǎng)室內(nèi)光照預(yù)培養(yǎng)。

工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)番茄具體過(guò)程：

1）取低溫保存含TMV-rep基因的農(nóng)桿菌LBA4404，在YEB固體培養(yǎng)基[含50 mg/L Kan和50 mg/L利褔平（Rif）]低于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種于20 mL YEB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28 ℃震蕩（150 r/min）培養(yǎng)2～3 d。endprint

2）菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3～0.7時(shí)，取25～30 mL倒入無(wú)菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái)，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無(wú)菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養(yǎng)基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無(wú)菌紙上，正面向上，再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養(yǎng)基封口，放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

4）培養(yǎng)3 d后，將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養(yǎng)基充分接觸，27 ℃下光照培養(yǎng)。

5）培養(yǎng)10～15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù)，30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續(xù)觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中，添加了抗卡那霉素基因，轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性，故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且數(shù)量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化，因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少，葉片愈傷細(xì)胞黃化，達(dá)到了篩選目的。

由圖3可知，2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽，同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果?？筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可以看出，預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加，但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32～48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加，其轉(zhuǎn)化率均大于70%，差異均達(dá)極顯著水平；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后，轉(zhuǎn)化率大幅度下降，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0，說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合，這時(shí)菌液浸泡葉芽，工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中，不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32～48 h，番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32～48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作，此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷，細(xì)胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

參考文獻(xiàn)：

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2）菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3～0.7時(shí)，取25～30 mL倒入無(wú)菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái)，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無(wú)菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養(yǎng)基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無(wú)菌紙上，正面向上，再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養(yǎng)基封口，放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

4）培養(yǎng)3 d后，將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養(yǎng)基充分接觸，27 ℃下光照培養(yǎng)。

5）培養(yǎng)10～15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù)，30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續(xù)觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中，添加了抗卡那霉素基因，轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性，故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且數(shù)量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化，因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少，葉片愈傷細(xì)胞黃化，達(dá)到了篩選目的。

由圖3可知，2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽，同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果?？筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可以看出，預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加，但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32～48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加，其轉(zhuǎn)化率均大于70%，差異均達(dá)極顯著水平；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后，轉(zhuǎn)化率大幅度下降，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0，說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合，這時(shí)菌液浸泡葉芽，工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中，不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32～48 h，番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32～48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作，此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷，細(xì)胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

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[8] 潘永明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化番茄體系優(yōu)化[J].北方園藝，2010（18）：142-144.

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2）菌液生長(zhǎng)到OD600 nm為0.3～0.7時(shí)，取25～30 mL倒入無(wú)菌離心管中，于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，用MS液體培養(yǎng)基將附在離心管壁上的菌液懸浮下來(lái)，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3）將搖床中的菌液取出，倒入事先放有不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄葉片的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，輕微搖勻，浸泡5～8 min。倒出菌液，將葉片夾出在吸水紙（無(wú)菌紙）上吸干表面的水分，放在MS液體培養(yǎng)基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸濕的無(wú)菌紙上，正面向上，再用無(wú)菌紙表面覆蓋一層，用MS液體共培養(yǎng)基封口，放入22 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

4）培養(yǎng)3 d后，將材料分別轉(zhuǎn)至1號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），傷口與培養(yǎng)基充分接觸，27 ℃下光照培養(yǎng)。

5）培養(yǎng)10～15 d統(tǒng)計(jì)分化芽數(shù)，30 d左右轉(zhuǎn)至2號(hào)篩選培養(yǎng)基（MS固體培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）繼續(xù)觀察葉芽的變化，記錄葉芽黃化情況，根據(jù)黃化結(jié)果計(jì)算不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間番茄外植體的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=未黃化的葉芽數(shù)/葉芽總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄愈傷組織培養(yǎng)

含煙草花葉病毒外殼蛋白（TMV-rep）基因的農(nóng)桿工程菌LBA4404在構(gòu)建過(guò)程中，添加了抗卡那霉素基因，轉(zhuǎn)化的番茄細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)基中卡那霉素的抗性，故篩選培養(yǎng)基以卡那霉素濃度為選擇壓力。

從圖1可以看出，侵染后經(jīng)暗培養(yǎng)的番茄葉片轉(zhuǎn)入1號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉片明顯膨大，葉邊緣傷口處形成大量愈傷組織。1號(hào)篩選培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度較高為500 mg/L，以抑菌為主；而卡那霉素的濃度只有50 mg/L，以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞為輔。所以葉緣傷口處愈傷組織包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且數(shù)量較多。

由圖2可知，番茄愈傷組織轉(zhuǎn)入2號(hào)篩選培養(yǎng)基后，葉緣的愈傷組織出現(xiàn)小部分黃化，因?yàn)?號(hào)篩選培養(yǎng)基在1號(hào)培養(yǎng)基抑菌效果的基礎(chǔ)上降低了羧芐青霉素的濃度，為250 mg/L。減輕羧芐青霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用；卡那霉素的濃度增加到100 mg/L，增加了對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選壓力。少量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較高的卡那霉素濃度下生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞葉綠素減少，葉片愈傷細(xì)胞黃化，達(dá)到了篩選目的。

由圖3可知，2號(hào)培養(yǎng)基篩選后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受卡那霉素濃度增加的影響，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)正常的綠色分化芽，同時(shí)還有少量已經(jīng)分化的芽在后期表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化后受培養(yǎng)基中高濃度卡那霉素的持續(xù)抑制產(chǎn)生的結(jié)果?？筛鶕?jù)分化芽的黃化數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

2.2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可以看出，預(yù)培養(yǎng)8 h的番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比有所增加，但增加幅度不大。預(yù)培養(yǎng)32～48 h番茄外植體轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比明顯增加，其轉(zhuǎn)化率均大于70%，差異均達(dá)極顯著水平；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后，轉(zhuǎn)化率大幅度下降，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到56 h時(shí)轉(zhuǎn)化率為0，說(shuō)明此時(shí)番茄葉芽傷口可能已經(jīng)愈合，這時(shí)菌液浸泡葉芽，工程菌細(xì)胞質(zhì)粒中的T-DNA已不能向番茄細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中，不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的番茄外植體經(jīng)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，達(dá)到41.67%。在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，最適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為32～48 h，番茄外植體轉(zhuǎn)化率大幅度提高。番茄外植體經(jīng)32～48 h的預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)基因操作，此時(shí)工程菌細(xì)胞對(duì)葉芽邊緣的細(xì)胞傷口多數(shù)形成初愈傷，細(xì)胞完整吸附效果好，能明顯提高T-DNA區(qū)攜帶的外源目的基因向植物基因組轉(zhuǎn)化的成功率。

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