超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定減肥類保健食品中非法添加的25種藥物

王靜文，黃湘鷺，曹 進(jìn)*，王鋼力*，張慶生，丁麗霞

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國(guó)藥學(xué)會(huì)，北京 100022）

近年來(lái)，隨著生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)減肥類保健品的需求也越來(lái)越大。然而，由于我國(guó)保健食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展起步較晚，企業(yè)素質(zhì)參差不齊，市場(chǎng)監(jiān)督管理體系尚待完善，保健食品因非法添加化學(xué)藥物而遭到查處的情況屢有報(bào)道。作為食品，在保健食品中添加藥物的行為不僅違反了《中華人民共和國(guó)食品安全法》，而且對(duì)消費(fèi)者的身體健康帶來(lái)了安全隱患。當(dāng)前，保健食品中呈現(xiàn)出的非法化學(xué)藥物添加有如下一些狀態(tài):(1)添加物的來(lái)源不明，可能添加化學(xué)藥物包括處方藥、現(xiàn)有藥物的結(jié)構(gòu)類似物、已下市藥物、尚未獲得批準(zhǔn)的新型藥物或先導(dǎo)化合物等［1-4］；(2)非法添加藥物的劑量隨意［1］；(3)多種藥物添加和多“劑量”水平的添加，由于有部分藥物添加處于較低濃度水平，因此，即使檢測(cè)到，也可能被認(rèn)為是污染，降低了應(yīng)受處罰的程度，存在一定的隱蔽性［3］；(4)非法添加藥物的兼容性不明確，保健食品中非法添加的藥物與保健食品配方之間均可能存在相互作用，同時(shí)添加的藥物也可能與消費(fèi)者正在服用的藥物之間存在相互作用［3］。這些都對(duì)消費(fèi)者的健康存在威脅。

目前用于減肥類保健食品非法添加的篩查方法主 要 有 HPLC 法［4，5］、HPLC-MS 法［6-10］、GC-MS法［11］、薄層色譜法［12］等，但大部分方法都只針對(duì)少數(shù)幾種化合物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)多種非法添加藥物的方法報(bào)道較少。本研究依據(jù)全國(guó)保健食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn)［3-8］，選擇了25種有減肥作用的化學(xué)藥物作為研究對(duì)象(這些化學(xué)藥物屬于:a.食欲抑制劑(安非他酮、苯佐卡因)；b.能量消耗劑(茶堿、咖啡因)；c.抗抑郁劑(氟西汀、氫溴酸西酞普蘭)；d.利尿劑(呋塞米、氫氯噻嗪、螺內(nèi)酯、布美他尼等)；e.胃腸道脂肪抑制劑(瑞莫那班)；f.瀉藥(酚酞、大黃素)；g.降糖類(苯乙雙胍))，建立了超高效液相色譜(UPLC)分析方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)17種減肥類保健食品(包括片劑、膠囊、袋泡茶、減肥咖啡等不同制劑的保健食品)的檢測(cè)，證明本研究建立的方法可有效地應(yīng)用于減肥類保健品中非法添加化學(xué)成分的快速篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

ACQUITY超高效液相色譜儀，配有二元溶劑管理器、樣品管理器、柱溫箱、光電二極管陣列檢測(cè)器、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；CF16RXⅡ離心機(jī)(日本Hitachi公司)；SAS漩渦混合器(英國(guó)Stuart公司)；KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

茶堿、咖啡因、氫氯噻嗪、螺內(nèi)酯、吲達(dá)帕胺、布美他尼、呋塞米、鹽酸苯乙雙胍、酚酞、大黃素、芐氟噻嗪、鹽酸安非他酮、苯丙酸諾龍、苯佐卡因、托拉塞米、氫溴酸西酞普蘭、克倫特羅、氯噻酮(純度均≥98.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙酰唑胺、依尼他酸、三氨蝶啶、氫氟噻嗪、美托拉宗(純度均≥99.0%，USP)；瑞莫那班、唑尼沙胺(純度均≥99.0%，日本Toronto Research Chemicals公司)。甲醇和乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過(guò)濾的去離子水。

17種減肥類保健食品:包括減肥膠囊、減肥咖啡、減肥茶以及減肥片，來(lái)源于市場(chǎng)抽檢樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱:Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相:A.乙腈，B.10 mmol/L 乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序:0～1 min，10%A；1～6 min，10%A～18%A；6～9 min，18%A～28%A；9～12 min，28%A；12～14 min，28%A～35%A；14～20 min，35%A～40%A；20～21 min，40%A ～50%A；21～23 min，50%A ～90%A；23～25 min，90%A；25～25.01 min，90%A ～100%A；25.01～26 min，100%A；26～26.01 min，100%A～10%A；在10%A下平衡2 min，等待下次進(jìn)樣。流速:0.3 mL/min；柱溫:40℃；樣品室溫度:20℃；進(jìn)樣量:2 μL；二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)波長(zhǎng):200～400 nm，各化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)見(jiàn)表1。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容(其中三氨蝶啶用80%的甲醇水溶液定容)，配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-4℃(瑞莫那班于-18℃)冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，以初始流動(dòng)相為稀釋液配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 供試樣品的制備

稱取供試品適量(約相當(dāng)于1次用量)，研細(xì)，置于50 mL離心管中，加入甲醇40 mL，混勻，渦旋1 min，于25℃、100 W 條件下超聲15 min，于5000 r/min下離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供測(cè)定。

表1 25種化學(xué)藥物的保留時(shí)間、對(duì)稱因子、分離度、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限Table 1 Retention times，symmetry factors，resolutions(Rs)，linear equations，linear ranges，correlation coefficients(R2)，LOQs and LODs of the 25 drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

為了減少操作步驟及獲得盡可能高的提取效率，本文優(yōu)化了超聲提取方式。分別考察了不同提取溶劑(甲醇、乙腈、水)和不同提取時(shí)間(10、15、20、25、30 min)等條件下的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑、超聲提取15 min的提取效率最高，待測(cè)定成分提取完全。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

待分離的 25 種化合物中，文獻(xiàn)［4-8，13-18］均采用C18反相色譜柱進(jìn)行分離，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)UPLC系統(tǒng)中常用的C18色譜柱Waters BEH C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)和 Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示兩種色譜柱均存在難分離物質(zhì)對(duì)，均需要對(duì)液相色譜條件進(jìn)一步改善，但使用Waters HSS T3柱時(shí)化合物的理論塔板數(shù)普遍高于使用Waters BEH C18柱時(shí)，峰形較尖銳，Waters HSS T3的填料是以高純硅膠作為載體，機(jī)械強(qiáng)度較高，可以耐受高壓，適合于UPLC的使用，其碳載量為11%，小于BEH C18的17%，有利于極性較大的化合物分析，故選用Waters HSS T3進(jìn)行進(jìn)一步的色譜條件優(yōu)化。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

由于待分析的化合物種類較多，極性差別較大，梯度洗脫更有利于分離。文獻(xiàn)［4-8，13-18］中流動(dòng)相條件差別較大，如以0.1 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈(pH 3.0±0.1)為流動(dòng)相測(cè)定氫氯噻嗪含量［13］，以甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相測(cè)定唑尼沙胺含量［14］，以己烷磺酸鈉檸檬酸溶液-乙腈為流動(dòng)相測(cè)定酚酞含量［15］；有的一種化合物有多種流動(dòng)相條件［13，16］，也有些化合物沒(méi)有可參考的液相色譜條件。鑒于以上情況，本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)乙腈-水二元流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)分離效果較差，美托拉宗/西酞普蘭、芐氟噻嗪/依尼他酸等化合物的峰重合，乙酰唑胺、氫氯噻嗪、酚酞等化合物峰形較差，出現(xiàn)雙頭峰、拖尾峰等現(xiàn)象，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH使其偏酸性時(shí)峰形得到改善(推測(cè)中性條件下氫氯噻嗪、乙酰唑胺等化合物發(fā)生電離，同時(shí)以分子與離子兩種形式存在，出現(xiàn)二次分配，使得色譜峰分叉)，這與大多數(shù)文獻(xiàn)中使用偏酸性流動(dòng)相條件相符。進(jìn)一步考察0.15%三氟乙酸(pH 1.8)、10 mmol/L乙酸銨(含 0.1%甲酸，pH 3.3)、10 mmol/L乙酸銨(乙酸調(diào)pH 4)、10 mmol/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào)pH 5)這4種流動(dòng)相條件對(duì)25種化合物的分離情況，結(jié)果表明:當(dāng)pH≥4時(shí)，部分化合物仍出現(xiàn)雙頭峰；當(dāng)pH=1.8時(shí)，大黃素出現(xiàn)雙峰，大黃素屬于蒽醌類化合物，在酸性條件下易被還原，生成蒽酚及其互變異構(gòu)體蒽酮；在pH=3.3條件下，25種化合物得到較好的分離，同時(shí)乙酸銨為揮發(fā)性緩沖鹽，便于后續(xù)研究中實(shí)現(xiàn)液相色譜到液相色譜-質(zhì)譜方法的轉(zhuǎn)變。

2.2.3 柱溫的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，色譜柱的柱溫對(duì)上述難分離物質(zhì)對(duì)唑尼沙胺/克倫特羅和芐氟噻嗪/依尼他酸這兩對(duì)色譜峰之間的分離度有顯著的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同柱溫條件(30、35、40、45℃)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在40℃時(shí)，兩難分離物質(zhì)對(duì)的分離效果最佳，同時(shí)其他物質(zhì)保持良好的分離狀態(tài)。

2.2.4 色譜峰的定性

本文主要根據(jù)對(duì)照品的保留時(shí)間以及相應(yīng)峰位的紫外掃描圖對(duì)25種化學(xué)藥物色譜峰定性。25種化學(xué)藥物的保留時(shí)間見(jiàn)表1，254 nm波長(zhǎng)下的液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 254 nm下25種化學(xué)藥物的UPLC譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of the 25 drugs at 254 nm

2.3 線性關(guān)系、定量限與檢出限

吸取一定量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相稀釋，配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；按1.2節(jié)的條件進(jìn)樣分析，以峰面積Y對(duì)對(duì)照品的質(zhì)量濃度X(mg/L)進(jìn)行回歸分析，按照S/N=10計(jì)算定量限(LOQ)，按照S/N=3計(jì)算檢出限(LOD)，25種化學(xué)藥物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限見(jiàn)表1。

2.4 方法的回收率和精密度

在經(jīng)測(cè)定不含有25種化學(xué)藥物的空白樣品(蘋果醋減肥膠囊)中進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)。在空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。所得到的平均加標(biāo)回收率范圍為70.7%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于5.03%(見(jiàn)表2)。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)17種減肥類保健食品進(jìn)行了分析測(cè)定，根據(jù)歐盟委員會(huì)非強(qiáng)制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定，通過(guò)比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間及色譜峰3個(gè)峰位點(diǎn)的紫外吸收特征掃描光譜圖定性，結(jié)果如下:3種樣品中檢測(cè)出酚酞，含量分別為8.54、0.509、3.87 mg/g；1種樣品中檢測(cè)出大黃素，含量為0.0648 mg/L(該樣品標(biāo)簽中不含有大黃素類組分)，未超出中華人民共和國(guó)藥典(一部)中規(guī)定的用量［18］。

酚酞屬于聯(lián)苯甲烷衍生物類瀉藥，根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2006004和食藥監(jiān)辦許［2010］114號(hào)文件，酚酞為減肥類保健食品中的違禁添加物；大黃素屬于蒽醌類衍生物類瀉藥，盡管蒽醌類衍生物可用于保健食品中，但使用量應(yīng)有所控制。長(zhǎng)期服用這兩種藥物會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，服用酚酞會(huì)誘發(fā)頑固性便秘、腸炎皮疹、大出血等；服用蒽醌類瀉藥會(huì)導(dǎo)致大腸黑便病，增加肝毒性，甚至有致畸和致癌等作用［19］。

表2 空白樣品中25種化學(xué)藥物的添加回收率及精密度(n=6)Table 2 Recoveries of the 25 drugs spiked in a blank matrix(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了使用同一種色譜條件同時(shí)測(cè)定減肥類保健食品中可能添加的25種減肥化學(xué)藥物含量的UPLC方法，在26 min內(nèi)即完成了對(duì)各化合物的分析測(cè)定。與傳統(tǒng)液相色譜方法相比，在保證分離度的情況下，實(shí)現(xiàn)了快速有效的高通量分析，檢測(cè)的化合物種類較為全面，可為監(jiān)測(cè)保健食品非法添加藥物提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。所采用的液相色譜條件相對(duì)簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)液相色譜法到液相色譜-質(zhì)譜法的轉(zhuǎn)換，可以進(jìn)行不同方法間的相互驗(yàn)證。同時(shí)，完成一次樣品分析流動(dòng)相的消耗量?jī)H為7.8 mL，既降低了成本，又減少了廢液排放，具有重要的環(huán)保意義。

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