基于QuEChERS提取的快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒谷基輔助食品中的9種真菌毒素

胡文彥，許 磊，楊 軍，凌 睿

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210000）

真菌毒素(mycotoxin)也稱霉菌毒素，是霉菌等真菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒的次生代謝產(chǎn)物，可廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品。目前發(fā)現(xiàn)大約300～400種有毒的真菌次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)多樣，物理化學(xué)性質(zhì)也千變?nèi)f化［1］。在這些代謝物中，黃曲霉毒素類(AFs)、赭曲霉毒素類(OTs)、伏馬毒素類(FBs)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮以及T-2毒素對經(jīng)濟及人們的健康危害尤為巨大［2］。超過一定攝入量后會損壞人的肝腎功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾?。?］。

嬰幼兒時期是人生長發(fā)育的關(guān)鍵時期。嬰幼兒谷基輔助食品作為6個月以上嬰兒食物重要的組成部分，安全問題不容忽視。嬰幼兒谷基輔助食品含有至少25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上的谷物原料，如果企業(yè)對原料質(zhì)量控制不夠嚴(yán)格，就有可能導(dǎo)致最終產(chǎn)品被真菌毒素污染，威脅嬰幼兒的身體健康。

食品中真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)［4］、薄層色譜法 (TLC)［5］、氣相色譜法(GC)［6］及液相色譜法(LC)［7］等。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)在檢測毒素方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)［8-10］。采用選擇離子監(jiān)測技術(shù)，可大大提高檢測的靈敏度和特異性，因此可以采用比傳統(tǒng)方法更為簡便的前處理技術(shù)，且不需要做柱后衍生化，是同時檢測多種毒素的理想方法。本實驗室采用基于QuEChERS原理的快速提取方法，結(jié)合快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了嬰幼兒輔助谷基食品中多種真菌毒素的快速測定方法。該方法簡便快速，可操作性強，免去繁瑣的SPE凈化步驟，只需一步提取濃縮就可以準(zhǔn)確篩查嬰幼兒谷基輔助食品中的多種真菌毒素。采用建立的方法對市面上銷售的部分嬰幼兒谷基類食品進(jìn)行了篩查，獲得了較為翔實的數(shù)據(jù)，為企業(yè)及食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1200-RRLC-6460 QQQ MS/MS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)，MasshunterB06.00質(zhì)譜工作站(美國Agilent公司)；3-18K冷凍離心機(美國Sigma公司)；十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；24位氮吹儀(美國Organomation公司)。

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素 B2(aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素 G1(aflatoxin G1，AFG1)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFG2)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)、T-2毒素(T-2 toxin，T2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Enzo Biochem公司。

乙腈、甲醇(色譜純，美國ROE公司)；無水硫酸鎂(使用前在450℃烘烤2 h，冷卻后備用)、氯化鈉、冰乙酸、乙酸銨(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(純度≥98.0%，德國CNW公司)；試驗用水為經(jīng)Milli-Q(0.22 μm過濾膜)凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司)過濾的超純水。

樣品:購自南京本地超市和網(wǎng)絡(luò)購物平臺，涉及9個品牌，41個批次。其中餅干2批，面條3批，其余均為配方米粉。

1.2 樣品提取

稱取2 g均質(zhì)后的試樣(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中；加入含1%(v/v)乙酸的乙腈/水(85∶15，v/v)提取液20 mL，超聲提取 10 min后，再加入2 g無水硫酸鎂和0.5 g氯化鈉；渦旋振蕩2 min，以8000 r/min離心10 min，取上層溶液于50℃下氮吹至干，快速加入55%(v/v)乙腈水溶液1 mL，混勻后過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

按照上述方法測試后的樣品，如果未檢測到9種真菌毒素將作為空白樣品用于回收率試驗和制備基質(zhì)校正溶液。在進(jìn)行加標(biāo)試驗時，取適量稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白樣品中，充分混合后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEA、T2、DON、FB1 標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用空白樣品提取液將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制成適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器條件

色譜柱為Agilent XDB C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；流動相A為2 mmol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)，流動相B為乙腈；梯度洗脫條件為A在2 min內(nèi)由45%降至5%，保持3 min后在0.1 min內(nèi)升至45%，保持2.4 min；流速0.25 mL/min；總運行時間7.5 min。

質(zhì)譜條件:毛細(xì)管電壓4000 V；干燥氣溫度320℃；干燥氣流速9.0 L/min；霧化氣壓力0.276 MPa(40 psi)；其余參數(shù)通過儀器自動調(diào)諧至最優(yōu)。電離模式:ESI(+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；MRM參數(shù)見表1。

表1 9種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of the nine mycotoxins

2 結(jié)果與討論

2.1 提取過程的優(yōu)化

建立多種不同物理化學(xué)性質(zhì)真菌毒素的同時檢測方法難度很大，特別是嬰幼兒谷基輔助食品作為一種嬰幼兒食用的特殊膳食食品一般都添加了大量的營養(yǎng)素和輔料，選擇一種合適的前處理方法非常重要。QuEChERS(quick，easy，cheap，rugged，safe)提取方法最早主要用于農(nóng)殘測試［11］，由于其具備簡便、快速等優(yōu)點，近年來逐漸廣泛運用于各種檢測領(lǐng)域，其中也包括真菌毒素的分析［12-14］。在QuEChERS提取方法中，加入無水硫酸鎂和氯化鈉能產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，降低基質(zhì)中親水性成分的溶解度，從而提高了提取效率。同時，鹽析效應(yīng)降低了提取液中的水分含量，使得后續(xù)的去溶劑步驟更加快速，節(jié)約了實驗時間。傳統(tǒng)的QuEChERS方法中，除了加入混合鹽，通常還要加入C18、乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)等吸附劑來吸附色素或油脂。而在嬰幼兒谷基食物中這類雜質(zhì)較少，且前期實驗表明加入吸附劑會造成部分目標(biāo)物的損失。本文對影響提取效果的這些因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。

首先是提取溶劑的選擇。依次考察了甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-水混合溶液、乙腈-水混合溶液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)水溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%～85%時，提取效率最高，這和已有報道［15］基本一致。體系中有機相含量高有利于縮短氮吹步驟所耗的時間。

此外，多數(shù)真菌毒素是偏酸性的化合物，理論上在堿性溶劑中的提取效率較高，但是其在堿性溶劑中穩(wěn)定性變差［16］。調(diào)節(jié)提取試劑的pH值為3、6、9，按照1.2節(jié)的方法對加標(biāo)的空白樣品進(jìn)行提取，比較pH值對提取效率的影響。從圖1可以看出，當(dāng)提取溶劑的pH值為3時各目標(biāo)物的提取效率最高，pH值對DON、ZEA、OTA 3種化合物的提取率影響最大。因此采用含1%(v/v)乙酸的乙腈/水(85∶15，v/v)(pH 3)作為提取溶劑，能夠兼顧絕大多數(shù)目標(biāo)物的提取效果。

圖1 提取溶劑的pH值對空白加標(biāo)樣品中真菌毒素提取效率的影響(n=3)Fig.1 Effect of pH value of solvent on the extraction recoveries of mycotoxins spiked in blank samples(n=3)

在提取方式上，考察了機械振蕩、超聲提取和勻漿提取3種常用的提取方法。結(jié)果表明，超聲提取10 min時效率較高，且操作簡便。

由于嬰幼兒米粉中干擾物質(zhì)較多，因此嘗試通過增加SPE凈化步驟來優(yōu)化提取過程。考慮到待測物的化學(xué)性質(zhì)，選擇實驗室常用的C18和HLB(親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物)填料對提取效率進(jìn)行考察。將加標(biāo)的空白米粉按照1.2節(jié)規(guī)定的方法提取，將上層溶液于50℃下氮氣吹干后，加入2 mL水溶解殘渣，分別用上述兩種材料的SPE柱進(jìn)行凈化。由圖2可以看出，SPE凈化后的回收率均低于只用溶劑提取的回收率，特別是極性較大的脫氧雪腐鐮刀烯醇經(jīng)過SPE凈化后損失較多，回收率偏低。

圖2 SPE凈化過程對真菌毒素回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of the SPE clean-up step on the recoveries of the mycotoxins(n=3)

進(jìn)而比較了采用HLB填料的SPE柱凈化前后待測液的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)，以考察SPE凈化步驟的必要性?；|(zhì)效應(yīng)通過對每個待測物的基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)進(jìn)行評價。具體計算公式為ME=Rm/Rs×100%，其中Rm為目標(biāo)化合物在空白加標(biāo)樣品基質(zhì)溶液中的響應(yīng)值，Rs為目標(biāo)化合物在初始流動相溶液中的響應(yīng)值。我們通過以上方式對SPE凈化前后的兩種基質(zhì)溶液進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖3。SPE凈化前后的溶液均產(chǎn)生一定程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，SPE凈化后的溶液比未凈化的基質(zhì)抑制程度相當(dāng)或稍小，但不甚明顯，特別是黃曲霉毒素G1、G2、伏馬毒素B1及赭曲霉毒素A凈化前后溶液的基質(zhì)效應(yīng)幾乎相同。從提取效率和基質(zhì)效應(yīng)兩方面的實驗結(jié)果看，SPE凈化并不能進(jìn)一步改善檢測結(jié)果，且增加成本，因此最終選擇不經(jīng)SPE凈化的較為簡單的樣品前處理方法。

圖3 SPE凈化過程對毒素基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=3)Fig.3 Effect of SPE clean-up step on matrix effect of mycotoxins(n=3)

2.2 儀器條件的優(yōu)化

在對流動相進(jìn)行優(yōu)化時，首先比較了甲醇-水和乙腈-水兩種體系，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)化合物在乙腈-水體系中的響應(yīng)較高，特別是AFG1、AFG2、T2等3種毒素區(qū)別顯著。我們同時發(fā)現(xiàn)在水相中加入乙酸銨后，各物質(zhì)的響應(yīng)值都有一定程度的提升，特別是T-2毒素加氨根的峰強度顯著增加，離子化效率明顯提高。而加入0.1%(v/v)的甲酸可提高待測物在正離子電噴霧離子源中的離子化效率，提高靈敏度。進(jìn)一步考察了不同乙酸銨濃度對目標(biāo)化合物離子化程度的影響，結(jié)果表明適當(dāng)降低乙酸銨的濃度可以提高目標(biāo)化合物的離子化效率，當(dāng)乙酸銨濃度為2 mmoL/L時，目標(biāo)化合物響應(yīng)值明顯增大。因此，最終選用2 mmoL/L乙酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)和乙腈作為流動相。由于分析物較多，基質(zhì)比較復(fù)雜，因此采用梯度洗脫進(jìn)行分析，不僅能縮短出峰時間，還能有效地去除色譜柱中殘留的雜質(zhì)。

在優(yōu)化質(zhì)譜采集離子等參數(shù)的過程中，同時考察了9種毒素在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)所有目標(biāo)物都在正離子模式下響應(yīng)較好。表1中列出了所有目標(biāo)物的質(zhì)譜采集離子信息。除T2毒素的母離子為［M+NH4］+外，絕大多數(shù)化合物在選定的分析條件下都產(chǎn)生［M+H］+母離子，在MRM分析中我們選擇離子豐度最高的子離子作為定量離子，選擇豐度次高的子離子作為定性離子，盡量不選擇質(zhì)荷比在100以下的離子，以免流動相中的低分子量雜質(zhì)對檢測造成影響。

在色譜柱的選擇上，我們考察了C18反相填料的3根不同型號的色譜柱，分別是Thermo Hypersil GOLD(100 mm ×2.1 mm，5 μm)、Agilent Proshell 120 EC-C18(50 mm ×4.6 mm，2.7 μm)以及 Agilent XDB C18(50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)。從色譜行為看，Agilent XDB C18更加適合于分析這9種真菌毒素，該柱內(nèi)徑和填料粒徑均較小，能夠獲得良好的分離度。最終選擇的優(yōu)化條件見1.4節(jié)，在此條件下，除了伏馬毒素和玉米赤霉烯酮保留時間較為接近外，其他化合物均能得到基線分離(見圖4)。

2.3 校正曲線

圖4 空白米粉加標(biāo)樣品(加標(biāo)量約為40 μg/kg)經(jīng)RRLC-MS/MS分析的色譜圖Fig.4 RRLC-MS/MS chromatogram obtained from a blank ground rice spiked at about 40 μg/kg

使用ESI離子源做分析時，要消除基質(zhì)效應(yīng)除了采用合適的前處理方法外，使用內(nèi)標(biāo)物或基質(zhì)外標(biāo)法校正［17］是目前液相色譜-質(zhì)譜分析的主流手段。對于本次分析來說，要想獲取所有目標(biāo)物的同位素內(nèi)標(biāo)難度很大，即使能夠獲取，檢測成本也會大幅提升。由于所分析各物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)差異較大，也很難找到一種或幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物。而對于嬰幼兒米粉來說，空白的基質(zhì)溶液相對比較容易獲取。因此，綜合上述原因，我們最終采用了基質(zhì)空白加標(biāo)的方法進(jìn)行目標(biāo)物的分析，取得了良好的效果。

具體做法為:將經(jīng)過測試不含待測物的空白樣品按照本方法規(guī)定的條件進(jìn)行處理，用獲取的空白基質(zhì)溶液溶解不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品，獲得系列濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液。將此溶液上機測試，利用安捷倫Masshunter工作站進(jìn)行積分，以質(zhì)量濃度(X，μg/L)對峰面積(Y)繪制校正曲線，回歸方程見表2。

2.4 方法學(xué)驗證

通過計算各目標(biāo)物在空白基質(zhì)中信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的含量來獲得檢出限(LOD)，而定量限(LOQ)則為10倍信噪比對應(yīng)的含量。通過在空白樣品中分別添加3個不同水平的待測目標(biāo)物，平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。9種真菌毒素的LOD為0.1～15.8 μg/kg，LOQ為0.3～47.5 μg/kg，完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)對真菌毒素限量檢測要求［18］。各待測物在實際測試中可能涉及的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在約1倍、2倍及10倍定量限的添加水平下加標(biāo)回收率結(jié)果令人滿意，各添加濃度的回收率為77.6%～109.6%，RSD在2.5% ～15.7%之間。

表2 方法的靈敏度、線性關(guān)系及回收率(n=6)Table 2 Sensitivities，linearships and recoveries of the developed method(n=6)

2.5 實際樣品測試

采用建立的方法隨機測定了國內(nèi)市場41批嬰幼兒谷基食品中的9種真菌毒素的殘留量。結(jié)果8個樣品中檢出不同濃度水平的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，含量從 21.13 μg/kg 至 184.22 μg/kg 不等，均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量要求［18］；共2個樣品中檢出玉米赤霉烯酮，含量分別為35.32 μg/kg及78.55 μg/kg，后者已經(jīng)超出國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量，屬于不合格產(chǎn)品；除此以外的其余毒素均未檢出。由于DON和ZEA熱穩(wěn)定性較好，不易分解，即使經(jīng)過加熱等生產(chǎn)加工過程仍有可能殘留于最終產(chǎn)品中。質(zhì)量監(jiān)督部門應(yīng)及時對市場上銷售的各種嬰幼兒谷基輔助食品產(chǎn)品進(jìn)行篩查，指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)從源頭上控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保障嬰幼兒的身體健康。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于QuEChERS原理的前處理技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定嬰幼兒谷基輔助食品中黃曲霉毒素B1等9種真菌毒素的方法。在前處理條件考察過程中，優(yōu)化了提取溶劑、提取方式等關(guān)鍵因素；通過比較SPE凈化前后目標(biāo)物的提取效率及基質(zhì)效應(yīng)，驗證了QuEChERS提取方案的有效性。通過優(yōu)化液相色譜與質(zhì)譜的采集參數(shù)，得到了最佳的儀器檢測條件。方法學(xué)考察及實際樣品檢測證明，該方法具有簡便、快速、經(jīng)濟、準(zhǔn)確、實用性強等優(yōu)點，可作為嬰幼兒谷基輔助食品中真菌毒素的快速檢測方案推廣應(yīng)用。

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