基于擬靶向液相色譜-質譜聯(lián)用的胃癌患者血清代謝組分析

楊太忠，羅 萍，李艷麗，華 瑞，尹沛源*，許國旺

（1.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023）

胃癌(gastric cancer，GC)是全球最普遍和致命的癌癥之一，每年確診的新發(fā)病例大約有100萬人，是癌癥相關死亡的第二大病因［1］。由于早期胃癌通常無癥狀，由此帶來的診斷滯后是目前癌癥患者高死亡率的一個主要原因。迄今為止，侵入性的內窺鏡檢查仍然是胃癌診斷最可靠和準確的方法。盡管內鏡篩查胃癌在日本廣泛實施，但是在其他絕大部分國家，這種侵入性的檢查方法的可行性和經濟性仍受到質疑［2］。就這一點而言，目前臨床上缺乏一種簡單而可靠的用于胃癌診斷的血清標志物［3］來實現對這一致命癌癥的無創(chuàng)篩檢。

代謝組學(metabolomics)是目前癌癥早期診斷和預后判斷的相關分子標志物發(fā)現和篩選［4-6］的一種高效的技術手段。在代謝組學研究中，代謝組分析常采用靶向分析［7］及非靶向分析［8］的策略，而非靶向分析是其中的主流，尤其適用于代謝標志物發(fā)現的相關研究［9］。飛行時間(time of flight，TOF)質譜因其掃描速度快，分辨率高，是非靶向代謝組分析最常用的儀器之一?；赥OF的非靶向方法［10］具有分析通量高、數據信息豐富等優(yōu)點，但其在數據的穩(wěn)定性、重復性以及定量的線性范圍等方面仍存在一定的缺陷。以三重四極桿(triple-quadrupole，TQ)質譜多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)技術為代表的靶向分析［11］方法雖然能夠彌補非靶向方法的上述不足，但是其自身也存在著同時分析的靶標數目有限、建立方法依賴于標準品等不足，對于生物樣本代謝組信息的覆蓋仍有局限，并不適用于大規(guī)模的代謝輪廓分析。

考慮到非靶向及靶向分析方法的特征及優(yōu)勢，本實驗室提出了“擬靶向”的概念［12］。擬靶向技術方案的核心思想是將非靶向分析的高通量、無偏向的代謝物信息獲取和靶向方法的高特異性檢測和準確定量相結合［13］，從而實現對待測樣本中已知及未知的多個代謝物離子靶標進行同時檢測。該方法在保證對代謝組信息覆蓋及檢測靈敏度的同時，顯著提高了數據的線性范圍以及重復性等指標，保證了后續(xù)的基于代謝組數據的標志物發(fā)現及驗證?；谶@一概念，我們先后建立了基于氣相色譜-質譜聯(lián)用、液相色譜-質譜聯(lián)用的擬靶向方法，并應用于血清肝癌標志物的篩選［13］、植物代謝組學等研究中［12，14］。

為了發(fā)現胃癌的早期診斷標志物，基于上述擬靶向分析策略，本研究采用超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)分析了20例胃癌患者與40例正常人群的血清代謝譜，通過代謝組數據分析獲得胃癌患者系統(tǒng)代謝特征，研究胃癌患者的代謝分型，以期發(fā)現胃癌診斷的潛在代謝標志物。

1 實驗部分

1.1 臨床樣本采集

本實驗所采集的血液樣本均具有病人的知情同意書，并得到吉林大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，其中胃癌患者均來自于吉林大學白求恩第一醫(yī)院的接診病人，不患有糖尿病、甲狀腺功能亢進癥等代謝性疾??；胃癌的腫瘤分級(tumor node metastasis，TNM)根據美國癌癥聯(lián)合委員會以及國際抗癌聯(lián)盟的標準。正常對照組為吉林大學白求恩第一醫(yī)院臨床體檢樣本，樣本信息與胃癌患者的年齡、性別等因素相匹配。所有樣本年齡、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino transferase，AST)信息見表1。其中按腫瘤TNM分期統(tǒng)計，Ⅰ期有0人，Ⅱ期有10人，Ⅲ期有8人，無法評級(not determined，ND)的有2人。所有采樣對象采樣前一天避免劇烈運動，避免飲用酒、咖啡、濃茶，清晨空腹使用真空無菌采血管按臨床常規(guī)方法采血，獲得的血清樣本1 h內即保存于-80℃冰箱中。血清樣本的運輸全程使用干冰保證冷鏈完整。

表1 胃癌及對照樣本的臨床信息Table 1 Clinical information of gastric cancers and healthy controls

1.2 儀器與試劑

采用Agilent 1290液相色譜儀(美國Agilent公司)聯(lián)合QTRAP 5500質譜(美國AB Sciex公司)系統(tǒng)進行擬靶向分析。正離子模式分析使用的色譜柱是ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，負離子模式分析使用的色譜柱是ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)(美國Agilent公司)。

乙腈(色譜純，美國Merck公司)，甲酸、碳酸氫銨(色譜純)、肉堿(carnitine)-D3、肉堿 C2∶0-D3、肉堿 C10∶0-D3、肉堿 C16∶0-D3、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)38∶0、溶 血 磷 脂 酰 膽 堿(LysoPC)19∶0、脂肪酸(free fatty acid，FFA)18∶0-D3、色氨酸(tryptophan，Trp)-D5、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)-D5、纈氨酸(valine，Val)-D8、膽酸(cholic acid，CA)-D5、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)-D4，亮氨酸(leucine，Leu)-D3(美國Sigma-Aldrich公司)；去離子水經Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)純化后使用。

1.3 樣品預處理

配制同位素內標的乙腈溶液，內標物的質量濃度:肉堿 C10∶0-D3 為0.1 μg/mL；肉堿 C16∶0-D3 為0.15 μg/mL；肉堿-D3 為 0.18 μg/mL；肉堿 C2∶0-D3 為 0.15 μg/mL；LPC-19∶0 為 0.75 μg/mL；PC(38∶0)為 0.625 μg/mL；CA-D5 為 0.25 μg/mL；CDCA-D4 為 1.25 μg/mL；FFA 18∶0-D3 為 2.5 μg/mL；Phe-D5 為 3.61 μg/mL；Trp-D5 為 4.25 μg/mL；VAL-D8 為 3 μg/mL；Leu-D3 為 0.267 μg/mL。

血清樣本的預處理:分別吸取待測血清80 μL，加入320 μL 乙腈，渦旋30 s，室溫下靜置15 min，在4 ℃、14000×g條件下離心10 min，取150 μL 的上清液凍干，最后用 50 μL 水/乙腈(3∶1，v/v)復溶，取上清用于TQ-MRM靶向分析。為保證代謝輪廓分析的數據質量，質量控制(quality control，QC)樣本穿插在實驗分析過程中。本次實驗QC樣本來自于本實驗室備用的健康人混合血清，預處理方法同上。在待測樣本進行LC-MS分析前，QC樣本先連續(xù)進樣5次，開始分析程序后，每隔5個測試樣本插入一個QC樣本，樣本分析結束后連續(xù)分析QC樣本5次。

1.4 基于UPLC/Triple Q MRM MS的靶向分析

1.4.1 正離子模式的UPLC-MS條件

UPLC條件:流動相A為含甲酸0.1%(v/v)的水，B相為含甲酸0.1%(v/v)的乙腈；梯度洗脫程序:初始為10%B，3 min時上升到40%B，15 min時再上升到100%B并維持5 min，20.1 min時回到10%B，平衡3 min；流速為0.35 mL/min；柱溫為50℃，進樣量為 5 μL。

MS條件:氣簾氣壓力為0.241 MPa，Gas 1壓力為0.276 MPa，Gas 2壓力為0.276 MPa，電噴霧離子源(ESI)溫度為550℃，噴霧電壓為5500 V。監(jiān)測模式為多反應監(jiān)測(MRM)。待檢測的離子對及相關檢測電壓碰撞能信息按照文獻［13］所述擬靶向策略獲取。

1.4.2 負離子模式的UPLC-MS條件

UPLC條件:流動相A為5 mmol/L碳酸氫銨的水溶液，B相為5 mmol/L碳酸氫銨的甲醇溶液；梯度洗脫程序:初始為2%B，3 min時上升到40%B，12 min時再上升到100%B并維持4 min，16.1 min時回到10%B，平衡4 min；流速為0.35 mL/min；柱溫為50℃；進樣量為5 μL。

MS條件:氣簾氣壓力為0.241 MPa，Gas 1壓力為0.276 MPa，Gas 2壓力為0.276 MPa，ESI離子源溫度為450℃，噴霧電壓為-4500 V。待檢測的離子對及相關檢測電壓碰撞能信息按照文獻［13］所述擬靶向策略獲取。

1.5 數據處理及統(tǒng)計分析

采集到的原始數據使用Analyst中的Quantitation軟件(美國AB Sciex公司)進行峰識別和匹配，并導出峰表。導出的數據經過內標校正后，利用SIMCA-P 11.0軟件(瑞典Umetrics AB公司)對數據進行多變量分析，數據經過Pareto variance(Par變換)后，將正常組和胃癌組構建主成分分析(PCA)和PCA-偏最小二乘法(PLS-DA)模型，觀察實驗的穩(wěn)定性和樣品分型，響應置換檢驗用來判斷模型是否存在過擬合現象；使用 SPSS 18.0軟件(美國SPSS公司)進行非參數檢驗，判斷離子在正常組和胃癌組之間是否有顯著性差異。聯(lián)合變量重要性因子值(variable importance in the projection，VIP)＞1和p-檢驗(p＜0.05)篩選差異離子。

2 結果與討論

2.1 代謝組數據分析

本研究所采用的擬靶向分析方法的建立過程參考文獻［13］?；跀M靶向分析方法對20例胃癌患者及40例健康對照者的血清代謝物進行了分析。典型的正、負離子模式的UPLC/Triple Q MS的MRM提取離子熱圖如圖1所示。正離子模式可以檢測373個代謝物離子，負離子模式可以檢測247個代謝物離子。

圖1 典型的ESI正、負離子模式下UPLC/Triple Q MRM MS的提取離子熱圖Fig.1 Typical heat maps of extracted ions by UPLC/Triple Q MRM MS in ESI positive-ion mode and ESI negative-ion mode

我們對該方法的穩(wěn)定性進行了考察。整個實驗過程中，QC樣本中所測得的代謝物整體表現穩(wěn)定。在正離子模式下84.6%的離子的峰面積的RSD＜30%，占總峰面積的 94.4%；在負離子模式下90.4%的離子的峰面積的RSD＜30%，占總峰面積的99.2%。結果表明該方法測定的代謝組數據穩(wěn)定可靠，完全滿足后續(xù)代謝組分析的要求。

2.2 差異離子的發(fā)現

實驗得到的正離子模式下的373個變量經過Par變換后，建立了PCA模型。由得分圖(圖2a和c)可見所有QC緊密聚集，也說明了該方法的重復性良好。同時，胃癌患者和正常對照組樣本的區(qū)別明顯。為了進一步尋找對分類貢獻大的變量，建立了PLS-DA模型。由PLS-DA得分圖(圖2b和d)可見正常組和胃癌組得到了很好的分離，同時響應置換檢驗(permutation test)參數:R2截距=0.076，Q2截距=-0.16，說明該模型沒有過擬合。

圖2 胃癌和健康對照組的PCA和PLS-DA得分圖Fig.2 Score plots of PCA and PLS-DA of gastric cancers and healthy controls

PLS-DA模型中149個變量的VIP＞1，對于胃癌患者及健康組分類貢獻明顯。經進一步對變量進行非參數檢驗，發(fā)現有140個變量在兩組間存在顯著性差異(p＜0.05)。其中41個代謝物的結構參考我們前期發(fā)表文章中已鑒定的結果［15-17］得到了鑒定。鑒定采用我們報道的基本策略［18］，針對未知代謝物，在確定其分子離子峰的基礎上，采用高分辨質譜測定其精確相對分子質量，分析其元素組成并參考二級質譜等信息，在網絡數據庫中查詢可能的鑒定結果，最后以標準品對結果進行確證。負離子模式數據也經過上述處理步驟，從247個離子中最終發(fā)現87個離子在兩組間存在顯著差異，其中16個代謝物得到了鑒定。上述經結構鑒定的差異代謝物中，胃癌患者組相對于對照組的變化倍率大于1.5倍的44個差異代謝物見表2。

2.3 差異離子的變化趨勢及生理意義

如表2所示，在所篩選出的差異離子中，磷脂類及鞘脂類代謝物(包括溶血磷脂酰乙醇胺(LPE 18∶2、LPE 18∶1)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)(LPC 22∶5、LPC 20∶2、LPC 16∶1、LPC 15∶0、LPC 12∶0、LPC 14∶0、LPC 18∶2、LPC 20∶3、LPC 18∶1、LPC 20∶4、LPC 16∶0)和鞘脂類代謝物(SM d18∶1/15∶0、SM d18∶1、SM d18∶1/18∶1))在胃癌患者中的水平明顯低于正常人。LPC在許多惡性腫瘤中會顯著降低，趙素敏等［19］在液相色譜-質譜用于卵巢腫瘤的磷脂輪廓的代謝組學分析中發(fā)現LPC在卵巢癌患者外周血清中顯著降低；Dong等［20］發(fā)現在肺癌患者血清中LPC的含量也明顯降低。一方面，在自分泌運動因子(ATX)或溶血磷脂酶D(lyso-PLD)作用下，LPC會轉變成溶血磷脂酸(LPA)［21］。而LPA可以促進細胞增殖，被普遍認為與癌癥的發(fā)生有關［22］。作為細胞膜的基本組成成分，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，過快的細胞增殖速度帶來的磷脂消耗也是導致血清 磷脂水平下降的主要原因。

表2 正、負離子模式UPLC-MS發(fā)現的胃癌患者組和對照組的已知差異變量Table 2 Known difference variables detected by UPLC-MS in positive and negative ion modes from gastric cancers and healthy controls

此外，研究結果表明，長鏈肉堿(carnitine C18∶1)在胃癌患者血清中下降，而短鏈肉堿(carnitine C6∶0、carnitine-OH、carnitine C6∶0)在胃癌患者中水平顯著升高。?；鈮A是脂肪酸β-氧化過程的重要參與者，其血清濃度變化反映了參與脂肪酸β-氧化過程的酶活力的改變［23］。

除了上述兩大類主要的代謝差異之外，胃癌患者與健康對照組之間也存在著其他的代謝差異，包括甲氫睪酮(mesterolone)、膽堿(choline)、精氨酸(arginine)、天門冬氨酸(L-aspartic acid)等代謝物都發(fā)生了顯著的變化，提示了胃癌患者體內在激素代謝、膽堿代謝以及氨基酸代謝等通路上均有代謝紊亂的狀況。

2.4 重要差異離子的驗證

表2列出的差異代謝物中，升高最顯著的代謝物為二氫膽固醇(dihydrocholesterol)，它的變化倍率達到了8.05倍，降低最明顯的代謝物(LPC 22∶5)的變化倍率也達到了3.23倍，這些代謝物具有成為潛在胃癌代謝標志物的潛力。如圖3a和b所示，在發(fā)現組中，兩組代謝物在胃癌及對照組間均存在顯著差異(p＜0.001)，其中二氫膽固醇能夠將正常人及胃癌患者進行很好(100%)的區(qū)分(cutoff:0.25)，而LPC 22∶5也能夠達到97.5%的特異性以及85%的靈敏度(cutoff:0.5)。為了進一步對上述代謝標志物進行驗證，我們又以相同的方法測定了另外一組同樣來自吉林大學第一醫(yī)院的胃癌患者(20例)以及對照組(39例)血清中二氫膽固醇以及LPC 22∶5，結果如圖3c和d。在驗證組中，這兩種代謝物仍然在兩組患者間存在顯著性差異(p＜0.001)，但是兩種潛在代謝標志物對胃癌患者與對照組的區(qū)分能力存在明顯不同。二氫膽固醇仍然能夠將正常人及胃癌患者進行很好(100%)的區(qū)分(cutoff:0.25)，而LPC 22∶5在確保靈敏度與發(fā)現組相同(85%)的情況下，其特異性下降到了70%(cutoff:1.8)。綜合以上結果，二氫膽固醇能夠作為一種更好的胃癌診斷的潛在代謝標志物。考慮到目前驗證組的樣本規(guī)模較小，后續(xù)仍需要擴大樣本量進行驗證。同時，其他消化道惡性腫瘤以及胃腸道的慢性炎癥等疾病對該代謝物的影響以及對診斷結果的干擾也需詳細考察。

圖3 血清中的胃癌潛在代謝標志物Fig.3 Serum potential biomarkers for gastric cancers

3 結論

本研究基于液相色譜-質譜聯(lián)用的擬靶向代謝組學方法，分析了胃癌患者與正常人血清的代謝組特征以及兩組人群間的代謝組差異。發(fā)現了胃癌患者包括磷脂、氨基酸、游離脂肪酸、肉堿等代謝物的代謝紊亂狀態(tài)，其中二氫膽固醇在發(fā)現組及驗證組中均能夠對胃癌與健康對照組進行很好的區(qū)分，具有成為潛在胃癌診斷標志物的可能。

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