櫻桃菌根真菌分離培養(yǎng)條件及有效性

劉輝+王志莉+徐迎迎+楊守軍

摘要：采用PDA培養(yǎng)基、PDA-抗生素培養(yǎng)基以及MMN培養(yǎng)基，通過切片法從一年生櫻桃（Prunus pseudocerasus）根中分離菌根真菌，用打孔法分離得到純化菌株，并對菌株的生理生化特征進行系統(tǒng)鑒定。結(jié)果表明，切片分離時的表面消毒條件和方法以及分離培養(yǎng)基的選用均直接影響菌根真菌的分離純化結(jié)果及菌根真菌的多樣性。該菌利用HgCl處理6 min，接種在改良MMN培養(yǎng)基中分離效果最好，該菌的最適pH 7，最適溫度為25 ℃，最適P濃度KH2PO4和K2HPO4分別為0.50 g/L和1.00 g/L，最適C源為可溶性淀粉，最適N源為尿素。將該菌加入到生長基質(zhì)中能將煉苗期的櫻桃苗的成活率由73%提高到86%。

關(guān)鍵詞：櫻桃（Prunus pseudocerasus）；菌根真菌；分離；培養(yǎng)條件；有效性

中圖分類號：O939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4025-04

Culture Conditions and Validity of Isolated Cherry

（Prunus pseudocerasus） Mycorrhizal Fungi

LIU Hui， WANG Zhi-li， XU Ying-ying， YANG Shou-jun

（Polytechnic Institute，China Agricultural University（Yantai）， Yantai 264670， Shandong， China）

Abstract： The process of isolating micorrhizal fungi from cherry root by sectioning was evaluated and the isolated fungi were identified. The isolated fungi were cultivated in the PDA medium， PDA-antibiotic medium and MMN medium and subsequently purified by punch method. The results showed that disinfection conditions and methods of slice surface and medium selection affected directly the purification and diversity of the fungi isolated. The best isolation was on the modified MMN medium as isolated fungi were sterilized by HgCl for 6 minutes. The isolated fungi could better growth at 25 ℃， pH 7.0， KH2PO4 0.50 g/L and K2HPO4 1.00 g/L. Soluble starch and urea were the best sources of carbon and nitride. Survival rate of cherry seedlings increased from 73 % to 86% after adding the isolated fungi into substrate.

Key words： cherry（Prunus pseudocerasus）； mycorrhizal fungi； isolation；culture conditions；validity

菌根（AM）是真菌菌絲與植物的根部緊密結(jié)合形成的一種特殊結(jié)構(gòu)，與植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌[1-3]。在菌根共生體中，大量延伸到土壤中的根外菌絲擴大了根系的吸收面積，并可通過菌絲從土壤中吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)元素（尤其是P和N）傳遞給植物；另一方面，菌根真菌可以通過根內(nèi)菌絲從宿主植物體內(nèi)獲得其生長繁殖所需的碳水化合物和一些生長物質(zhì)，從而形成一種營養(yǎng)上的互利共生關(guān)系[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃（Prunus pseudocerasus）根系的侵染率為56.11%[6]，但目前國內(nèi)對櫻桃菌根共生體系建立方面的研究較少。本研究從一年生的櫻桃根系中分離菌根真菌，并對該菌進行培養(yǎng)鑒定，最后將該菌與煉苗期的櫻桃建立共生體系，為今后相關(guān)菌劑的生產(chǎn)和共生體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株 試驗材料為一年生的櫻桃幼苗和組培櫻桃苗，分別由中國農(nóng)業(yè)大學煙臺校區(qū)試驗基地及組培實驗室提供。苗木均為長勢良好、均勻一致的植株。

1.1.2 分離培養(yǎng)菌根真菌所用的培養(yǎng)基

1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，無水CaCl2 0.02 g，ZnSO4 0.002 7 g，F(xiàn)eSO4 0.027 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

2）PDA-抗生素培養(yǎng)基[7]：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，酒石酸銨少量，微量元素溶液3 mL（每1 000 mL微量元素混合液含有H3BO3 8.45 g，MnSO4 5.00 g，CuSO4·5H2O 0.63 g，F(xiàn)eSO4 6.00 g，ZnSO4 2.27 g，（NH4）2MoO4 0.27 g）。

3）MMN培養(yǎng)基[8]：CaCl2 0.05 g，NaCl 0.025 g， KH2PO4 0.5 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，F(xiàn)eCl3（1%溶液）1.2 mL，麥芽粉3 g，葡萄糖10 g，VB1 0.1 g，牛肉膏蛋白胨15 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 菌根真菌的分離和純化培養(yǎng) 分離方法參照郭順星等[9]的關(guān)于菌根真菌的分離方法，略作改進。取櫻桃根根尖8～10 cm，清水洗凈，用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3次，濾紙吸干。再用0.1%的HgCl溶液分別處理2、4、6、8 min，無菌水沖洗3次，濾紙吸干。用滅菌解剖刀在培養(yǎng)皿中將根橫切成1 cm長條，將長條分別置于PDA、PDA-抗生素、MMN培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿采用五點法放五根長條，每個處理梯度5次重復。在恒溫25 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察比較不同處理時間和培養(yǎng)基感染情況及菌根真菌的出菌情況，并將未感染部分轉(zhuǎn)至最佳培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 最適溫度的測定 采用打孔法，在距離菌心相同半徑打1 cm的菌餅，放入最優(yōu)培養(yǎng)基中，每個梯度3次重復，將培養(yǎng)基分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 最適pH的測定 將最優(yōu)培養(yǎng)基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl調(diào)節(jié)pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（pH為2、3的培養(yǎng)基將瓊脂量提高1倍，使其凝固），采用打孔法，在距離菌心相同半徑打1 cm的菌餅，放入不同pH的培養(yǎng)基中，每個梯度3次重復，在恒溫25 ℃培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 最適P濃度的測定 將最優(yōu)培養(yǎng)基的KH2PO4和K2HPO4調(diào)節(jié)至（0.25，0.5）、（0.5，1）、（0.75，1.5）、（1，2）、（1.25，2.5） g/L，保持pH為最優(yōu)值，采用打孔法，在距離菌心相同半徑打1 cm的菌餅，放入不同P濃度的培養(yǎng)基中，每個梯度3次重復，在恒溫25 ℃培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 最適C源的測定 將最優(yōu)培養(yǎng)基的C源分別利用20 g/L的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖替代，采用打孔法，在距離菌心相同半徑打1 cm的菌餅，放入不同C源的培養(yǎng)基中，每個梯度3次重復，在恒溫25 ℃培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 最適N源的測定 將最優(yōu)培養(yǎng)基的N源分別利用15.75 g/L蛋白胨、15.75 g/L牛肉膏、2.36 g/L尿素、 4.21 g/L NH4Cl、 7.95 g/L KNO3替代（保證N含量一致），采用打孔法， 在距離菌心相同半徑打1 cm的菌餅，放入不同N源的培養(yǎng)基中， 每個梯度3次重復，在恒溫25 ℃培養(yǎng)4 d， 采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.7 有效性檢測 將最優(yōu)培養(yǎng)基中的菌根放入麩皮培養(yǎng)基進行菌根真菌活化。培養(yǎng)7 d后，將麩皮培養(yǎng)基低溫烘干后，均勻加入100棵處于煉苗期的櫻桃苗的培養(yǎng)土中，同時取100棵長勢相同的櫻桃苗作對照。培養(yǎng)45 d后，測算成活率和根系侵染率，侵染率采用臺盼藍染色法和格線交叉法測定[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Mirosoft Excel 2007進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理時間和培養(yǎng)基種類的影響

從圖1可以看出，在處理時間一致的情況下，MMN培養(yǎng)基感染雜菌量顯著少于PDA、PDA-抗生素培養(yǎng)基；同一種培養(yǎng)基隨處理時間的延長感染雜菌量逐漸減少，其中處理時間4、6、8 min感染雜菌的減少量不顯著，MMN培養(yǎng)基處理時間6、8 min感染雜菌量相同。從圖2可以看出，在處理時間一致的情況下，MMN培養(yǎng)基長菌量顯著高于PDA、PDA-抗生素培養(yǎng)基，其中當處理時間為4、6 min時長菌量較多。綜合圖1、圖2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當MMN培養(yǎng)基在處理時間為6 min時，既能有效抑制雜菌的生長，又能使長菌量達到較高水平。

2.2 不同溫度對菌落直徑的影響

從圖3可以看出，當溫度為5 ℃時，菌根真菌菌落停止生長。隨著溫度升高，菌根真菌的菌落直徑逐漸增大，當溫度升高到25 ℃時，菌落直徑達到最大，為原來的4.71倍。當溫度繼續(xù)升高時，菌落直徑開始逐漸減小。數(shù)據(jù)表明，溫度對菌根真菌生長影響顯著。

2.3 培養(yǎng)基pH對菌根真菌生長的影響

由圖4可以看出，當pH 2時，菌根真菌停止生長。隨著pH的增大，菌根真菌的生長速度逐漸提高，當pH達到7時，菌落直徑最大，為4.98 cm。當pH繼續(xù)增大時，菌落直徑開始緩慢減小。當pH為5～10時，菌落直徑變化不明顯，表明pH對菌根真菌的生長影響在一定范圍內(nèi)不顯著。

2.4 培養(yǎng)基P濃度對菌根真菌生長的影響

圖5表明，在不同濃度P條件下，菌落直徑存在一定差異，但總體差異不大。當KH2PO4和K2HPO4分別為0.50 g/L和1.00 g/L時，菌落直徑最大。

2.5 培養(yǎng)基C源對菌根真菌生長的影響

由圖6可以看出，在不同C源條件下，菌落直徑存在顯著差異，其中當C源為葡萄糖時，菌落直徑最??；當C源為可溶性淀粉時，菌落直徑最大，比C源為葡萄糖時的菌落直徑大0.43 cm。數(shù)據(jù)表明，不同C源對菌根真菌菌落直徑的影響存在差異。

2.6 培養(yǎng)基N源對菌根真菌生長的影響

從表1可以看出，在不同N源條件下，菌落直徑差異較為明顯。當尿素為N源時菌落直徑達到最大，當氯化銨為N源時，菌落直徑最小。數(shù)據(jù)表明，不同的N源對菌落直徑產(chǎn)生不同的影響。

2.7 菌根共生體系建立

通過對櫻桃苗根系侵染率及植株成活率進行檢測，結(jié)果表明，施加菌根真菌的根系侵染率為27.1%，對照組為0；施加菌根真菌的植株成活率為86%，高于對照組的73%。分析結(jié)果可知，該菌根真菌經(jīng)過分離培養(yǎng)仍具有一定的有效性，可以顯著提高植株的成活率。

3 討論

通過用PDA培養(yǎng)基、PDA-抗生素培養(yǎng)基、MMN培養(yǎng)基分離該菌發(fā)現(xiàn)，三者對該菌的分離具有明顯差異。其中，MMN培養(yǎng)基可以有效減少雜菌的感染量，而PDA培養(yǎng)基和PDA-抗生素培養(yǎng)基雜菌感染量均較高，并且MMN培養(yǎng)基能夠明顯促進該菌的生長，具體作用機理有待進一步研究。HgCl處理時間對根系感染具有明顯的抑制作用，其在6 min內(nèi)能明顯減少雜菌感染量，當超過6 min時，這一作用不太明顯。與此同時，處理時間也影響該菌的生長，在處理時間較短時，由于雜菌較多會直接影響到該菌的生長，隨著處理時間的延長，雜菌感染量減少，促進該菌生長，但過長的處理時間可能會殺死根系內(nèi)部的真菌孢子，導致該菌生長減緩。

溫度是影響菌根真菌生長的重要因素。一般而言，菌根真菌對溫度反應靈敏，20～28 ℃條件下是多數(shù)菌根真菌的最適生長溫度，而最高耐受溫度為35 ℃[11]。該菌的最適溫度是25 ℃，但是在35 ℃時仍能生長。通常情況下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接種可以形成菌根[12]。但本研究表明，該菌的最適pH 7，而且在pH 5～10時，pH對該菌生長的影響不明顯，這在一定程度上說明菌根真菌的培養(yǎng)與菌根共生體系建立所需要的酸堿環(huán)境不一致。P濃度對菌根的形成具有顯著的影響，試驗證明，當每千克土壤的磷酸二氫鈣含量超過6 g時，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范圍內(nèi)，P濃度對該菌的生長影響不明顯。大多數(shù)研究表明，不同種類的菌根真菌對C源的利用較為廣泛，既可以利用單糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等長效C源。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌在以可溶性淀粉為C源的培養(yǎng)基中生長最快，其次是蔗糖。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌對N源的種類要求不高，但以尿素最佳。

本研究通過對該菌有效性進行檢測發(fā)現(xiàn)，施加該菌可以提高煉苗期櫻桃苗的成活率，因此該菌可以制成菌劑應用于煉苗期櫻桃苗，對于其他植物的影響有待進一步研究。同時，該菌的侵染率并未達到對櫻桃植株侵染率的最大值，相關(guān)原因有待研究。

參考文獻：

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[13] MOSSE B. Plant growth responses to vesicular-arbuscular mycorrhiza. IV. In soil given additional phosphate[J]. New Phytol，1973，72：127-136.

2.7 菌根共生體系建立

通過對櫻桃苗根系侵染率及植株成活率進行檢測，結(jié)果表明，施加菌根真菌的根系侵染率為27.1%，對照組為0；施加菌根真菌的植株成活率為86%，高于對照組的73%。分析結(jié)果可知，該菌根真菌經(jīng)過分離培養(yǎng)仍具有一定的有效性，可以顯著提高植株的成活率。

3 討論

通過用PDA培養(yǎng)基、PDA-抗生素培養(yǎng)基、MMN培養(yǎng)基分離該菌發(fā)現(xiàn)，三者對該菌的分離具有明顯差異。其中，MMN培養(yǎng)基可以有效減少雜菌的感染量，而PDA培養(yǎng)基和PDA-抗生素培養(yǎng)基雜菌感染量均較高，并且MMN培養(yǎng)基能夠明顯促進該菌的生長，具體作用機理有待進一步研究。HgCl處理時間對根系感染具有明顯的抑制作用，其在6 min內(nèi)能明顯減少雜菌感染量，當超過6 min時，這一作用不太明顯。與此同時，處理時間也影響該菌的生長，在處理時間較短時，由于雜菌較多會直接影響到該菌的生長，隨著處理時間的延長，雜菌感染量減少，促進該菌生長，但過長的處理時間可能會殺死根系內(nèi)部的真菌孢子，導致該菌生長減緩。

溫度是影響菌根真菌生長的重要因素。一般而言，菌根真菌對溫度反應靈敏，20～28 ℃條件下是多數(shù)菌根真菌的最適生長溫度，而最高耐受溫度為35 ℃[11]。該菌的最適溫度是25 ℃，但是在35 ℃時仍能生長。通常情況下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接種可以形成菌根[12]。但本研究表明，該菌的最適pH 7，而且在pH 5～10時，pH對該菌生長的影響不明顯，這在一定程度上說明菌根真菌的培養(yǎng)與菌根共生體系建立所需要的酸堿環(huán)境不一致。P濃度對菌根的形成具有顯著的影響，試驗證明，當每千克土壤的磷酸二氫鈣含量超過6 g時，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范圍內(nèi)，P濃度對該菌的生長影響不明顯。大多數(shù)研究表明，不同種類的菌根真菌對C源的利用較為廣泛，既可以利用單糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等長效C源。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌在以可溶性淀粉為C源的培養(yǎng)基中生長最快，其次是蔗糖。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌對N源的種類要求不高，但以尿素最佳。

本研究通過對該菌有效性進行檢測發(fā)現(xiàn)，施加該菌可以提高煉苗期櫻桃苗的成活率，因此該菌可以制成菌劑應用于煉苗期櫻桃苗，對于其他植物的影響有待進一步研究。同時，該菌的侵染率并未達到對櫻桃植株侵染率的最大值，相關(guān)原因有待研究。

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2.7 菌根共生體系建立

通過對櫻桃苗根系侵染率及植株成活率進行檢測，結(jié)果表明，施加菌根真菌的根系侵染率為27.1%，對照組為0；施加菌根真菌的植株成活率為86%，高于對照組的73%。分析結(jié)果可知，該菌根真菌經(jīng)過分離培養(yǎng)仍具有一定的有效性，可以顯著提高植株的成活率。

3 討論

通過用PDA培養(yǎng)基、PDA-抗生素培養(yǎng)基、MMN培養(yǎng)基分離該菌發(fā)現(xiàn)，三者對該菌的分離具有明顯差異。其中，MMN培養(yǎng)基可以有效減少雜菌的感染量，而PDA培養(yǎng)基和PDA-抗生素培養(yǎng)基雜菌感染量均較高，并且MMN培養(yǎng)基能夠明顯促進該菌的生長，具體作用機理有待進一步研究。HgCl處理時間對根系感染具有明顯的抑制作用，其在6 min內(nèi)能明顯減少雜菌感染量，當超過6 min時，這一作用不太明顯。與此同時，處理時間也影響該菌的生長，在處理時間較短時，由于雜菌較多會直接影響到該菌的生長，隨著處理時間的延長，雜菌感染量減少，促進該菌生長，但過長的處理時間可能會殺死根系內(nèi)部的真菌孢子，導致該菌生長減緩。

溫度是影響菌根真菌生長的重要因素。一般而言，菌根真菌對溫度反應靈敏，20～28 ℃條件下是多數(shù)菌根真菌的最適生長溫度，而最高耐受溫度為35 ℃[11]。該菌的最適溫度是25 ℃，但是在35 ℃時仍能生長。通常情況下，菌根真菌喜酸性，在酸性土壤中中接種可以形成菌根[12]。但本研究表明，該菌的最適pH 7，而且在pH 5～10時，pH對該菌生長的影響不明顯，這在一定程度上說明菌根真菌的培養(yǎng)與菌根共生體系建立所需要的酸堿環(huán)境不一致。P濃度對菌根的形成具有顯著的影響，試驗證明，當每千克土壤的磷酸二氫鈣含量超過6 g時，菌根不能形成[13]。本研究表明，在上述范圍內(nèi)，P濃度對該菌的生長影響不明顯。大多數(shù)研究表明，不同種類的菌根真菌對C源的利用較為廣泛，既可以利用單糖、低聚糖等速效C源，也可以利用淀粉等長效C源。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌在以可溶性淀粉為C源的培養(yǎng)基中生長最快，其次是蔗糖。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌對N源的種類要求不高，但以尿素最佳。

本研究通過對該菌有效性進行檢測發(fā)現(xiàn)，施加該菌可以提高煉苗期櫻桃苗的成活率，因此該菌可以制成菌劑應用于煉苗期櫻桃苗，對于其他植物的影響有待進一步研究。同時，該菌的侵染率并未達到對櫻桃植株侵染率的最大值，相關(guān)原因有待研究。

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