聚丙烯酰胺凝膠電泳操作注意事項研究

吳建忠 王玉蘋 許源媛 劉巖 趙茜

摘要 [目的] 得到清晰的特異性條帶，更好地分析SRAP標記產物。[方法]對聚丙烯酰胺電泳的上樣量、電壓條件進行了梯度試驗，同時就灌膠方式、銀染時間、顯影劑調配等各步驟的操作進行了詳細地探討。[結果] 上樣量7 μl、電壓1 000 V最合適，能得到 DNA條帶清晰、特異性條帶區(qū)分效果明顯的條帶。 [結論] 為后續(xù)電泳操作及分析過程奠定技術基礎。

關鍵詞 亞麻;聚丙烯酰胺凝膠電泳;銀染

中圖分類號 S563.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11636-02

Considerations for Study in Polyacrylamide Gel Electrophoresis Process

WU Jian-zhong1， WANG Yu-ping2， XU Yuan-yuan2 et al

（1. Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin， Heilongjiang 150086;2. College of Life Sciences of Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract [Objective] The aim was to get clear specific bands， in order to better analyze SRAP markers. [Method] Sample amount and voltage condition of polyacrylamide electrophoresis were tested.at the same time， glue， silver dyeing time， the developer deployment and so on were made a detail discussion on the operation of the flash. [Result] 7 μl of sample amount， 1 000 V of voltage was the most appropriate， and could get clear DNA banding and specificity belt to distinguish the effect of belts. [Conclusion] The study laid a solid technical foundation for convenient operation and subsequent analyses process.

Key words Flax; Polyacrylamide gel electrophoresis; Silver staining

基金項目 哈爾濱市科技創(chuàng)新工程青年基金項目（2013RFQYJ010）;黑龍江省農科創(chuàng)新青年基金項目（2012QN009）;國家農業(yè)部科技支撐計劃基金項目（2013BAD01B03）。

作者簡介 吳建忠（1983- ），男，內蒙古烏蘭察布人，助理研究員，在讀博士，從事作物遺傳育種方面的研究。

收稿日期 2014-10-20

聚丙烯酰胺凝膠電泳是由Raymond和Weintraub于1959年利用人工合成的凝膠作為支持介質創(chuàng)建的一種電泳方式，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代[1]。聚丙烯酰胺凝膠電泳在生物化學和分子生物學中對蛋白質、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，被人們稱為是對生物大分子進行分析鑒定的最后、最準確的手段，即“Last Check”。 聚丙烯酰胺凝膠具有可分離不同分子量的生物大分子、靈敏度高、化學惰性好、重復性好、透明度好等優(yōu)點，目前尚無更好地支持介質能夠取代它[2]，但其不足之處在于操作過程繁瑣[3]。SRAP標記在亞麻基因型分析中使用普遍，該標記方法能產生大量特異性條帶[4]，為了得到清晰的特異性條帶，更好地分析SRAP標記產物，必須注意操縱過程中的每一個細節(jié)。筆者在亞麻SRAP標記分析中，對聚丙烯酰胺電泳的上樣量、電壓條件進行了梯度試驗，同時就灌膠方式、銀染時間、顯影劑調配等各步驟的操作作了詳細地探討，為SRAP標記后續(xù)亞麻基因型分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

供試植物材料均由黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所提供，采用改良過的 CTAB 法提取亞麻全基因組 DNA[5]，紫外分光光度計測定DNA濃度分析純度后，置于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學試劑。

丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、硫酸銨、尿素、硼酸、TRIS-base、EDTA、TEMED、75%乙醇、親和硅烷、玻璃硅烷、硝酸銀、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、甲醛、去離子水，其他用試劑純。

1.2 方法

采用已經建立并優(yōu)化的SRAP標記技術體系進行亞麻PCR擴增點樣基因型分析[6-7]。

對面板和背板分別擦板后，采用適量6%PAGE溶液灌膠，制作膠板。點樣前先80 W預熱30 min，60 W進行正式電泳80 min。用質量濃度0.3%的硝酸銀溶液銀染8 min，取出后用去離子水沖洗3遍，每次1 min;再置于顯影液（由2%NaOH、0.06%NaHCO3、4.4%HCHO混合而成的）中，時間約為5 min，以DNA條帶清晰可辨為準，取出后用去離子水漂洗3遍，每次3 min，瀝干，在觀察燈下人工讀帶、記錄，并照相留底。

2 結果與分析

2.1 上樣量梯度分析

上樣量分別為4、7、10 μl，檢測不同上樣量對電泳結果產生的影響。結果見圖1。

圖1 上樣量影響

由圖1可知，不同上樣量對電泳結果產生影響。上樣量4 μl時，DNA條帶顏色淡，易缺帶，影響讀帶;上樣量7 μl時，DNA條帶清晰，顏色深，易讀帶;上樣量10 μl時，DNA條帶清晰度、顏色深淺與上樣量為7 μl時基本一致。因此上樣量為7 μl最合適，用最少的上樣量得到最清晰的電泳結果以避免浪費樣品。

點樣孔內充滿緩沖液，若上樣量為4 μl，樣品體積相對點樣孔內緩沖液的體積小，點樣時樣品受到緩沖液的阻力大，易被擋在點樣孔外，樣品不易進入點樣孔或者全部被緩沖液擋在點樣孔外，結果出現(xiàn)DNA條帶顏色淺或者缺帶現(xiàn)象;若上樣量為10 μl，樣品進入點樣孔時所受阻力相對較小，易進入點樣孔。由于阻力依然存在，一部分樣品被留在點樣孔外，污染緩沖液，這部分樣品還易落入相鄰點樣孔內，造成竄樣，影響讀帶;若上樣量為7 μl，樣品可以全部進入點樣孔，不會被留在點樣孔外。

2.2 電壓梯度分析

設置電壓分別為600、800和1 000 V，檢測不同電壓值對電泳結果的產生影響，不同電壓條件下的電泳圖譜見圖2。

圖2 電壓梯度分析

由圖2可知，3種電壓條件下所得到的電泳結果基本一致，DNA條帶直，顏色深，清晰可辨。雖然3種電壓對電泳圖譜影響不明顯，但DNA條帶電泳至同一位置所耗時不同。DNA條帶電泳至玻璃板的3/4處，電壓1 000 V需要1.5 h，電壓800 V需要2.5 h，而電壓600 V則需要3 h以上。為了縮短試驗時間，選擇電壓1 000 V最合適。

3 討論

在聚丙烯酰胺凝膠電泳操作過程中，電泳結果受到諸多因素的影響。正確的灌膠方式可以避免氣泡的產生，若膠內有氣泡，會使DNA帶彎曲，影響成像美觀。當氣泡位于點樣孔內，DNA所受到的阻力小，其電泳速度比其他DNA快，導致DNA帶彎曲。氣泡位置及大小不同，DNA帶彎曲程度也不同：氣泡位于DNA電泳路徑內，氣泡越大，氣泡長度與路徑長度的比值越大，DNA彎帶曲程度越大。氣泡越小，氣泡長度與路徑長度的比值越小，DNA帶彎曲程度越小;氣泡位于DNA電泳路徑外，DNA在其電泳路徑內所受阻力基本相同，DNA帶不彎曲，可視為無影響。點樣孔內的氣泡，灌膠時易產生，插入梳子時也易帶入。如果整個聚丙烯酰胺凝膠薄厚不均或點樣孔處的膠發(fā)生下移，會導致整條DNA帶不再一條水平線上。這是由于膠液下移導致的，只需灌膠后，調整玻璃板與水平臺即可。

若DNA條帶顏色淺或DNA條帶顏色與背景色差別小，會影響讀帶。銀染和顯影過程中一些細節(jié)需要注意。銀染液由5 g硝酸銀、1 500 ml去離子水調配而成。用搖床搖15～30 min后即可使用。若時間少于15 min，硝酸銀沒有完全溶解，銀染效果不好。銀染時間為8 min左右，少于8 min，銀染不徹底，DNA條帶顏色淺;多于15 min，銀離子富集在膠內，顯影時面板會全部變黑，無法讀帶。顯影液由0.9 g無水碳酸鈉、30 g氫氧化鈉、6 ml甲醛、1 500 ml去離子水配置而成。甲醛現(xiàn)用現(xiàn)加，加入甲醛后，在搖床上搖2 min后即可使用。如果甲醛沒有搖勻，顯影時局部高濃度的甲醛迅速還原銀離子，局部面板變黑，DNA條帶和背景顏色一樣深，無法讀帶。若提前加入甲醛，甲醛在空氣中易揮發(fā)，實際操作時溶液中甲醛濃度不夠，影響顯影效果。若加入甲醛較晚，依然由于甲醛濃度分布不均引起局部膠面迅速變黑，無法讀帶。若不加甲醛，由于缺少還原銀離子的還原劑，DNA條帶不會顯現(xiàn)出來。甲醛是具有特殊刺激性氣味的液體，對人體有強烈的致癌和促癌作用，在嗅覺、過敏，肝、肺、免疫功能等方面也有影響，顯影過程必須在通風櫥內進行，使空氣中的甲醛及時排到室外，減少對人體的危害[8]。面板染色不均勻，與銀染液和顯影液的使用次數(shù)有關，由于重復使用，銀染液中銀離子濃度降低，銀染液內殘留膠塊和DNA染色劑，影響銀染效果。為了避免染色不均，銀染液和顯影液一般在使用3次后重新配制。

若膠面脫落或損壞，導致數(shù)據(jù)缺失，原因有2個：一是親和硅烷和玻璃硅烷擦得不均勻，導致面板與背板不易分開，若用力撬開，膠面可能脫離面板，粘到背板上，也可能從膠中間分開，粘到2個板上。若膠粘到背板上，由于膠面缺失，不僅損失部分數(shù)據(jù)，也影響成像美觀;若膠粘到2個板上，在面板上的膠由于表面凹凸不平，銀染時就會由于銀離子大量進入而導致顏色變深，顯影時不僅會迅速變黑，而且影響其周圍1 cm范圍內的膠也變黑，無法讀帶，所損失的數(shù)據(jù)范圍比粘掉的膠面面積大;二是顯影后，去離子水沖洗不徹底。顯影液中含有氫氧化鈉，若膠內殘留氫氧化鈉，膠面易脫落。因此，為使膠面完整，在擦板時，親和硅烷和玻璃硅烷可以均擦2遍，顯影后，漂洗時間一定要長，防止氫氧化鈉殘留，腐蝕膠面[9]。

若同一水平線上的DNA條帶，形狀顏色都一致，只有一條DNA條帶長度是其他DNA條帶長度的50%，很難判斷這半條帶的準確性，因為很有可能是竄樣造成的，需要進一步判斷。為防止竄樣，點樣時，不同樣品要更換槍頭。由于用不同引物擴增DNA，所以PCR產物中DNA濃度不同，若樣品內DNA濃度高，會產生一條顏色淺、凝膠狀的雜帶，DNA在這里凝聚導致條帶無法分開，影響讀帶，上樣量為7 μl可有效防止雜帶的產生。

若凝膠時間長，會增加試驗耗時。配膠時，10%AP與TEMED用量越多，膠凝固速度越快。在50 ml PAGE溶液中分別加750 μl和75 μl的AP、TEMED，凝膠時間僅需5 min;若分別加入450 μl和45 μl的AP、TEMED，凝膠時間需要30 min以上，因此，可以根據(jù)用時調整兩者用量。

4 結論

聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高，能分辨分子量較小的DNA片段，但其操作步驟多，用時長，因此每個操作細節(jié)都會影響最終成像結果。只有注意每個操作步驟，才能使DNA條帶清晰、特異性條帶區(qū)分效果明顯，從而得到準確的試驗結果，為研究DNA分子標記分析提供基礎數(shù)據(jù)。

參考文獻

[1] RAYMOND S，WEINTRAUB L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis[J].Science，1959，130（3377）：711.

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[3] 李虹業(yè)，范樹國，劉玉樂，等.改良聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DNA[J].細胞生物學雜志，1999，21（4）：201-203.

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[5] 吳建忠.亞麻全基因組 DNA 的提取及分析[J].黑龍江農業(yè)科學，2011（7）：18-19.

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[9] 陳香玲，李楊瑞，楊麗濤，等.cDNA-SCOT基因差異表達兩種電泳方法的比較研究[J].生物技術通報，2010（10）：93-95.