人工合成抗菌肽對(duì)口腔細(xì)菌抗菌性能的初步研究

劉奕　費(fèi)偉　王麗娜　等

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)人工合成抗菌肽（十肽）對(duì)口腔常見(jiàn)感染性疾病主要致病菌的抑菌活性。方法 采用瓊脂擴(kuò)散法及液體稀釋法體外評(píng)價(jià)十肽對(duì)變異鏈球菌、表兄鏈球菌、嗜酸乳桿菌、血鏈球菌、格氏鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、伴放線嗜血桿菌及白色假絲酵母菌的抑菌性能，并測(cè)定十肽對(duì)變異鏈球菌的時(shí)間-殺菌曲線。結(jié)果 十肽對(duì)所選實(shí)驗(yàn)菌株均表現(xiàn)出不同的抑菌性能，對(duì)主要致齲菌的最小抑菌濃度MIC值為62.5～125 μg·mL-1，而對(duì)主要牙周致病菌的MIC值為250～1 000 μg·mL-1，其中，十肽對(duì)齲病主要致病菌變異鏈球菌有較強(qiáng)抑菌作用。時(shí)間-殺菌曲線結(jié)果顯示，十肽作用20 min后開(kāi)始?xì)⒕?0 min之后可完全殺滅細(xì)菌，且在24 h之內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)論 新型人工合成抗菌肽十肽對(duì)口腔常見(jiàn)感染性疾病主要致病菌具有抑菌性能，其中對(duì)致齲變異鏈球菌的抑菌效果最為明顯。

[關(guān)鍵詞] 十肽； 抗菌性能； 口腔感染性疾病

[中圖分類號(hào)] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.017

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素作用下，發(fā)生在牙體硬組織的慢性、進(jìn)行性破壞的疾病，齲病及其繼發(fā)疾病給人類造成很大的危害，被世界衛(wèi)生組織列為人類重點(diǎn)防治的非傳染性疾病。變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是與齲病發(fā)生密切相關(guān)的主要致病菌，也是牙菌斑生物膜中重要的定植菌。十肽（decapeptide）是從多肽庫(kù)中篩選出來(lái)的一種人工合成的新型抗菌肽，具有較強(qiáng)的抗微生物活性，且作用過(guò)程中不產(chǎn)生耐藥性。十肽氨基酸序列為KKVVFKVKFK-NH2，其具有的單一氨基酸序列是其主要部分[1]。本研究旨在研究十肽抑制口腔感染性疾病主要致病菌生長(zhǎng)的能力，體外評(píng)價(jià)十肽的抑菌防齲性能，為進(jìn)一步探索十肽抑制細(xì)菌，防止早期菌斑形成的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 十肽的合成

依據(jù)十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法體外合成十肽并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（成都誠(chéng)諾新技術(shù)有限公司合成并鑒定）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板（Sigma公司，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），ProtoCOL SR 全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x（Synbiosis公司，英國(guó)），CrystalSpecTM比濁儀（Becton Dickinson公司，美國(guó)），針孔式濾膜過(guò)濾器（孔徑：0.2 μm，無(wú)錫賽維商貿(mào)公司），厭氧培養(yǎng)箱DY-2（浙江義烏冷凍機(jī)總廠），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），高壓蒸汽滅菌機(jī)（Sanyo公司，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌ATCC 25175、表兄鏈球菌6715、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、血鏈球菌ATCC 10556、格氏鏈球菌ATCC 10558、黏性放線菌ATCC 19246、內(nèi)氏放線菌ATCC 12140、牙齦卟啉單胞菌381、中間普雷沃菌ATCC 25611、具核梭桿菌10953、伴放線放線桿菌29523、白色假絲酵母菌ATCC 10691均由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)

變異鏈球菌、表兄鏈球菌、格氏鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌采用TPY培養(yǎng)基培養(yǎng)；嗜酸乳桿菌采用Rogosa培養(yǎng)基培養(yǎng)；牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、伴放線放線桿菌采用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)；白色假絲酵母菌采用BA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 十肽實(shí)驗(yàn)液的配制 將人工合成的十肽重懸于無(wú)菌雙蒸水，終濃度為4 g·L-1，針孔式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 菌懸液的配制 實(shí)驗(yàn)菌種凍干株接種于相應(yīng)

固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，于80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24～48 h，白色假絲酵母菌于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃需氧培養(yǎng)24 h。檢查菌落的生長(zhǎng)形態(tài)，鏡檢無(wú)污染，涂片檢查證實(shí)為純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基中在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)增菌，CrystalSpecTM比濁儀測(cè)定菌懸液濃度，磷酸緩沖液（PBS）配制濃度為1×108 CFU·mL-1和2×106 CFU·mL-1的細(xì)菌菌懸液備用。

1.5.3 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組（0.1%氯己定）、陰性對(duì)照組（PBS緩沖液）、實(shí)驗(yàn)組（4 g·L-1的十肽實(shí)驗(yàn)液）。采用瓊脂擴(kuò)散的方法，制備含菌的培養(yǎng)基，微量加樣槍吸取濃度為1×108 CFU·mL-1的菌懸液各200 μL加入20 mL培養(yǎng)基中，充分混勻，鋪板（培養(yǎng)皿直徑90 mm），使細(xì)菌菌懸液最終濃度為1×106 CFU·mL-1，平均劃分3個(gè)加樣區(qū)，打孔器均勻制備加樣孔（直徑約3 mm），分別加入0.1%的氯己定、PBS緩沖液及4 g·L-1的十肽實(shí)驗(yàn)液各5 μL，培養(yǎng)24～48 h，ProtoCOL SR全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌環(huán)直徑大小，每種細(xì)菌設(shè)置6個(gè)平行對(duì)照組。

1.5.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentra-tion，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組（含0.1%氯己定的菌懸液培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（含PBS的菌懸液培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組（含不同濃度的十肽菌懸液培養(yǎng)基）。以上各組均設(shè)置3個(gè)平行組。使用液體稀釋法對(duì)MIC和MBC進(jìn)行測(cè)定，將濃度為4 g·L-1的十肽實(shí)驗(yàn)液按對(duì)倍稀釋溶于液體培養(yǎng)基中，使其終濃度為2 g·L-1、 1 g·L-1、500 μg·mL-1、250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.3 μg·mL-1、15.6 μg·mL-1。濃度為2×106 CFU·mL-1菌懸液與各組藥液按比例1∶1各100 μL，分別接種于無(wú)菌96孔板中，使菌懸液的終濃度為1×106 CFU·mL-1，置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)24～48 h。在黑色背景下，凡肉眼觀察微孔內(nèi)液體清亮無(wú)渾濁或沉淀生長(zhǎng)的最低藥物濃度為十肽的MIC。用無(wú)菌接種環(huán)分別挑取肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的微孔板中的培養(yǎng)物20 μL，劃線接種于固體培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)少于5～6個(gè)的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）值[2-3]。所有菌種的MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 十肽對(duì)變異鏈球菌時(shí)間-殺菌曲線的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組（含0.1%氯己定的TPY液體培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（TPY液體培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組（含MBC濃度的十肽的TPY液體培養(yǎng)基）。將200 μL的變異鏈球菌菌懸液分別加入實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組中，菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基的比例為

1︰9，變異鏈球菌的終濃度為1×106 CFU·mL-1，37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、10、20、30 min，及1、2、4、8、24 h提取菌液。PBS緩沖液梯度稀釋（0、10、100、1 000倍）后取50 μL菌懸液接種于TPY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落形成單位數(shù)（CFU·mL-1）的對(duì)數(shù)值（log）為縱坐標(biāo)，繪制時(shí)間-殺菌曲線?；罹?jì)數(shù)減少99.9%即差異>3 log CFU·mL-1者視為有殺菌作用，活菌計(jì)數(shù)下降1～3 log CFU·mL-1者視為有抑菌作用[2，4]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)抑菌環(huán)直徑行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 十肽的合成分析結(jié)果

質(zhì)譜分析十肽相對(duì)分子質(zhì)量為1 249.958，與理論相對(duì)分子質(zhì)量的1 249.7基本一致，誤差小于2‰。高效液相色譜分析十肽純度為98.22%。

3 討論

抗菌肽是一類對(duì)抗外界病原體感染的肽類活性物質(zhì)，它們多為12～50個(gè)氨基酸組成的短肽[5]?？咕淖钪匾⒆钜岁P(guān)注的生物學(xué)活性是其高效廣譜的抗微生物活性，其抗菌作用具有以下特點(diǎn)：抗菌譜廣，對(duì)革蘭陽(yáng)性、陰性菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用；殺菌快速；不易產(chǎn)生耐藥性，已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用?？咕牡臍⒕绞蕉喾N多樣，主要作用機(jī)制包括：細(xì)胞膜攻擊作用、線粒體攻擊作用、對(duì)染色體的破壞作用、干擾細(xì)菌代謝或直接作用于胞漿成分、促進(jìn)調(diào)亡相關(guān)蛋白及配體的表達(dá)、影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[6-7]。但是，人們對(duì)其確切的殺菌機(jī)制尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。

在多肽菌庫(kù)中，新型抗菌肽十肽被證明有較強(qiáng)的抗菌作用。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)十肽的濃度增加到1 g·L-1的高濃度時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致人牙齦成纖維細(xì)胞死亡且仍能使細(xì)胞膜保持較完整的結(jié)構(gòu)。研究進(jìn)一步證明十肽的作用只針對(duì)原核生物界，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并無(wú)毒性[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)十肽對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌、恥垢分支桿菌、白喉?xiàng)U菌、弗氏志賀菌等都有較強(qiáng)的抑菌殺菌作用，并且主要是通過(guò)改變細(xì)菌生物膜上的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在利用雙重的流動(dòng)細(xì)胞系統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建人工合成的生物膜中，十肽作用后能使成熟的生物膜斷裂，以有效地阻滯早期牙菌斑生物膜的形成，提示在傳統(tǒng)的牙膏中加入十肽可能會(huì)通過(guò)阻斷牙菌斑的形成從而抑制齲病的發(fā)生。在以往對(duì)十肽作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，由于十肽具有陽(yáng)離子殘基及親水性的特性，認(rèn)為它的抗菌機(jī)制可能是：十肽的雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)上的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜上負(fù)電荷之間通過(guò)靜電吸引而結(jié)合并聚集在質(zhì)膜上，打亂了質(zhì)膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)原有的排列秩序，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)紊亂，最后殺滅細(xì)菌。但是其確切的抑菌機(jī)制尚不清楚[4，10-12]。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法體外合成十肽。此法的基本過(guò)程是：將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以這個(gè)氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC作偶聯(lián)劑）形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過(guò)程，即可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹(shù)脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。該法節(jié)省了分離純化的時(shí)間，反應(yīng)效率高，產(chǎn)物純度高。十肽合成后，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)其純度。以往研究表明抗菌肽的純度大于80%即可以發(fā)揮抑菌作用。本次實(shí)驗(yàn)合成十肽的純度高于98%，既保證了十肽本身的抑菌性能，又基本排除了雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，保證了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性。

本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)國(guó)立臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）推薦的藥物敏感試驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散法觀測(cè)十肽對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株抑菌環(huán)大小，實(shí)驗(yàn)中使用全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌環(huán)直徑大小，在一定程度上避免了人工測(cè)量引起的誤差，具有一定的實(shí)用性。為了進(jìn)一步測(cè)試實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)十肽的敏感性，本實(shí)驗(yàn)使用了敏感的液體稀釋法觀測(cè)十肽的抑菌性能，方法易于掌握，結(jié)果重復(fù)性好。結(jié)果表明：十肽對(duì)口腔常見(jiàn)致齲菌的MIC為62.5～500 μg·mL-1，該結(jié)果與Concan-non等[13]的研究有一定的區(qū)別。這可能與所選用的菌懸液濃度及所選菌種不同有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選用的實(shí)驗(yàn)菌株均為四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株，實(shí)驗(yàn)中并未選擇臨床菌株，旨在對(duì)十肽對(duì)口腔細(xì)菌的抗菌性能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，篩選出抑菌效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。此外，本實(shí)驗(yàn)還評(píng)價(jià)了十肽對(duì)牙周病主要致病菌的影響，研究結(jié)果表明十肽對(duì)革蘭陰性專性厭氧菌也表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，但其抑菌性弱于主要致齲菌，造成十肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的不同抑菌性能的機(jī)制目前尚不清楚。但是以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于十肽具有陽(yáng)離子殘基及親水性，它的抗菌機(jī)制可能主要包括靜電學(xué)說(shuō)、氫鍵或與細(xì)菌生物膜表面的膜受體的疏水性作用，進(jìn)而破壞細(xì)菌生物膜，因此，本課題組將對(duì)這種抑菌機(jī)制的差異及十肽對(duì)口腔主要致齲菌生物膜生長(zhǎng)的影響進(jìn)行深入的研究。時(shí)間-殺菌曲線是一項(xiàng)評(píng)價(jià)抗菌藥抗菌活性的實(shí)驗(yàn)，用這種方法可以評(píng)價(jià)抗菌藥物抗菌效力的強(qiáng)弱，為臨床擇藥提供依據(jù)。通過(guò)觀察十肽對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的時(shí)間-殺菌曲線發(fā)現(xiàn)，十肽作用20 min后開(kāi)始?xì)⒕?0 min之后可完全殺滅細(xì)菌，且在24 h之內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。研究證明十肽能在較短時(shí)間內(nèi)殺滅變異鏈球菌，并提示十肽可能具有抗生素后效應(yīng)（即指細(xì)菌與抗生素或抗菌藥物，經(jīng)短時(shí)間接觸，將殘留抗生素清除后，細(xì)菌生長(zhǎng)仍受抑制的生物現(xiàn)象）。由此研究結(jié)果推測(cè)，將來(lái)臨床應(yīng)用中將十肽用于口內(nèi)局部用藥，通過(guò)短時(shí)間的藥物接觸后能持續(xù)抑制口腔變異鏈球菌生長(zhǎng)，可能初步達(dá)到防齲目的。

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（本文編輯 杜冰）