電解蝕刻法處理的鈦及鈦合金表面的對(duì)比研究

王世振　孟維艷　矯國(guó)田　等

[摘要] 目的 通過(guò)成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，初步探討鈦及鈦合金微-納米三維形貌對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 采用電解蝕刻法在純鈦及鈦合金表面構(gòu)建出不同尺寸的微-納米三維形貌，并觀察其三維結(jié)構(gòu)表面對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。結(jié)果 在成骨細(xì)胞的黏附和增殖方面，純鈦組和鈦合金組表面均高于純鈦機(jī)械拋光組。純鈦組表面細(xì)胞胞體飽滿，伸出大量偽足，并可見(jiàn)大量功能顆粒。ALP活性顯著高于鈦合金和純鈦機(jī)械拋光組表面。結(jié)論 通過(guò)電解蝕刻法在純鈦和鈦合金表面可形成不同直徑和深度的碗形巢樣及納米結(jié)構(gòu)；兩個(gè)表面即30～50 μm和5～8 μm的表面和光滑表面相比，都明顯促進(jìn)了細(xì)胞的附著；30～50 μm的純鈦表面更有利于促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。

[關(guān)鍵詞] 純鈦； 鈦合金； 種植體； 成骨細(xì)胞； 生物學(xué)行為； 電解蝕刻

[中圖分類號(hào)] R 783.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.016

純鈦及鈦合金以其良好的機(jī)械性能和生物相容性，可與骨組織形成骨結(jié)合，作為人工種植體被廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域。研究[1]證實(shí)鈦及鈦合金種植體表面特性影響骨整合率，尤其表面形貌影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為及功能狀態(tài)。目前對(duì)種植體表面形貌的研究主要集中在微米形貌和納米形貌兩個(gè)方面。研究[2]認(rèn)為微米形貌能增強(qiáng)機(jī)械固位，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成和礦化，改變蛋白的構(gòu)象，促進(jìn)成骨細(xì)胞的定向、黏附、增殖，提高骨整合率。但Meirelles等[3]認(rèn)為僅有納米形貌是不足以保證骨整合的，微米形貌對(duì)骨整合也非常重要。因此兼具有微納米三維結(jié)構(gòu)的種植體表面成為未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)及研究的熱點(diǎn)。本研究采用電解蝕刻法（electrolytic etching，EE）在純鈦及鈦合金表面構(gòu)建出微-納米三維形貌，研究成骨細(xì)胞在兩種金屬表面的不同生物學(xué)行為，初步探討了純鈦及鈦合金微納米三維結(jié)構(gòu)表面對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、乙二胺四乙酸鈉（ethylenediamine tetraace-tic acid，EDTA）（Merke公司，西德），ALP檢測(cè)試劑盒（南京建成生物生物工程研究所），圓柱形的純鈦及鈦合金試件（沈陽(yáng)中航鈦業(yè)公司）。JSM-

6700場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、HHW21.420電解儀及電解槽（自制）、Allegra X-12臺(tái)式離心機(jī)、UV-260紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Beckman公司，美國(guó)）。

1.2 純鈦及鈦合金粗化表面的構(gòu)建

采用EE法處理圓柱形的純鈦和鈦合金試件（直徑為4 mm×10 mm）底面，以鈦為陽(yáng)極，鉑片為陰極，酸為電解液，在一定時(shí)間和電流作用下對(duì)金屬表面進(jìn)行蝕刻，獲得兼具有微-納米三維形貌的表面。在距電解蝕刻處理面約2 mm處切割，形成直徑為4 mm×2 mm試件。試件的一面為電解蝕刻面，另一面是切割形成的表面。實(shí)驗(yàn)分為純鈦組（EE1）、鈦合金組（EE2）、純鈦機(jī)械拋光組（M組）。將上述3組試件用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水分別超聲清洗10 min，干燥塑封，高壓鍋滅菌消毒，備用。

1.3 兩種表面的成骨細(xì)胞生物學(xué)行為

1.3.1 MG-63細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃，5%CO2和100%飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、60 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的DMEM全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細(xì)胞。在玻璃培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶后離心，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞凍存液（含70%培養(yǎng)液、20%胎牛血清和10%二甲基亞砜混勻。置于4 ℃條件下40 min，-20 ℃條件下2 h，然后置于-70 ℃過(guò)夜，最后置于液氮中，長(zhǎng)期保存。

1.3.2 兩種不同表面的MG-63細(xì)胞增殖能力 將經(jīng)過(guò)EE法處理的純鈦及鈦合金試件經(jīng)過(guò)高溫、高壓消毒后，放入到已消毒的96孔培養(yǎng)板中，每孔放置1個(gè)試驗(yàn)件，以正常組為對(duì)照。用0.25%胰蛋白酶將對(duì)數(shù)期的MG-63細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板。每孔0.1 mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6復(fù)孔。分別于第1、3、5、7天取出一塊板后每孔加入10 μL MTT（5 g·L-1）溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出原培養(yǎng)液后每孔加入二甲基亞砜150 μL，室溫下振蕩器振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)為490 nm，按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（An-A0）/A0，An為某時(shí)間點(diǎn)的A值，A0為1 d時(shí)A值（設(shè)為基礎(chǔ)值）。

1.3.3 不同表面對(duì)MG-63細(xì)胞貼壁率的影響 將3組試件放到24孔培養(yǎng)板中，每孔放置10個(gè)試件，設(shè)3復(fù)孔。將0.25%胰酶消化后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每孔放入懸液1 mL，細(xì)胞濃度為每孔1×105個(gè)，以正常組為對(duì)照。細(xì)胞接種后分別在1、2、6、12、24 h終止培養(yǎng)，0.01 mol·L-1的PBS輕輕沖洗試件3次后，轉(zhuǎn)入另一個(gè)24孔培養(yǎng)板中，每孔加0.3 mL 0.25%胰酶消化3 min，加0.7 mL含10%胎牛血清的DMEM終止消化，輕輕吹打?qū)嶒?yàn)件，制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色，顯微鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，按照公式計(jì)算細(xì)胞貼壁率，細(xì)胞貼壁率=（貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×（培養(yǎng)孔底面積/鈦試驗(yàn)件表面積）×100%。

1.3.4 不同表面對(duì)MG-63細(xì)胞形態(tài)的影響 將3組試件放入到已消毒的96孔培養(yǎng)板中，每孔放置1個(gè)試件，設(shè)6復(fù)孔，以正常組為對(duì)照。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞以0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，每孔加入0.l mL，接種后在第1、3、5天終止培養(yǎng)，0.01 mol·L-1的PBS輕輕沖洗3次；2.5%戊二醛固定過(guò)夜后，0.1 mol·L-1 PBS沖洗3次，每次15 min；1%鋨酸固定60 min，0.1 mol·L-1 PBS沖洗3次，每次15 min；分別以50%、70%、80%、90%、100%乙醇依次脫水各15 min；100%乙酸異戊酯處理15 min，干燥；經(jīng)黏臺(tái)，噴金后SEM觀察。

1.3.5 不同表面對(duì)ALP活性的影響 將3組試件放入到已消毒的24孔培養(yǎng)板中，每孔放置10個(gè)試驗(yàn)件，設(shè)3復(fù)孔，以正常組為對(duì)照。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞以0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，每孔加入

l mL，細(xì)胞接種后分別在第1、3、5、7天終止培養(yǎng)。用超聲破裂細(xì)胞，每次10 s，共3次，冰上操作，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管內(nèi)，此時(shí)的ALP為細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清內(nèi)ALP。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

3 討論

種植體表面特性可驅(qū)動(dòng)成骨細(xì)胞活性[4]，特別是表面微觀幾何形貌影響種植體和成骨細(xì)胞相互作用，并因此引導(dǎo)隨后的細(xì)胞反應(yīng)。體外研究[5]證實(shí)，鈦表面形貌影響細(xì)胞和生物材料相互作用如細(xì)胞的附著、增殖和分化。細(xì)胞的附著和黏附與整合素受體有關(guān)，整合素受體（穿膜蛋白）其亞單位（β1-整合素）是成骨細(xì)胞重要的黏附分子，在細(xì)胞附著和伸展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[6]。當(dāng)整合素和成骨細(xì)胞合成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白）結(jié)合，形成黏著斑，把細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白粘接在一起，使細(xì)胞黏附于材料表面[7]。整合素與基質(zhì)蛋白的粘接激活了信號(hào)傳遞系統(tǒng)，將表面形貌信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)直到細(xì)胞核。此信號(hào)能調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、遷移、增殖、分化及基因表達(dá)[8]。細(xì)胞黏附后，整合素活化不僅影響信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，還影響細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)排列，從而影響細(xì)胞的形態(tài)和伸展。與整合素連接的肌動(dòng)蛋白在表面信號(hào)的驅(qū)動(dòng)下重新分布、排列，驅(qū)使細(xì)胞漿前移使細(xì)胞伸展、形態(tài)改變[9]。不同的表面整合素亞單位反應(yīng)及表達(dá)方式不同，局部動(dòng)力不同，因而細(xì)胞形狀、伸展和轉(zhuǎn)錄分子的表達(dá)不同。本研究中，3種表面在最初的1～2 h，EE2組試件表面的黏附率高于EE1組和M組，M組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在隨后的6～12 h，EE1組略高于EE2組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組都明顯地高于M組。說(shuō)明粗糙的表面比光滑表面更有利于細(xì)胞的黏附。在這里微米凹尺寸的大小對(duì)于細(xì)胞的附著沒(méi)有明顯的影響。從細(xì)胞的增殖結(jié)果可見(jiàn)，純鈦表面的細(xì)胞增殖高于鈦合金表面，尤其在第7天出現(xiàn)顯著的差異。兩者表面的細(xì)胞增殖又明顯高于機(jī)械表面，說(shuō)明30～50 μm的碗型微米凹比5～8 μm直徑的碗型凹，更有利于細(xì)胞的增殖。兩個(gè)表面的碗型凹內(nèi)都具有納米結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。但30～50 μm的凹促進(jìn)作用更為明顯，可能與其暴露更多的納米結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，這種碗型巢可使纖維蛋白血凝塊在種植體表面穩(wěn)定沉積，并使脆弱的細(xì)胞外基質(zhì)支架固定，從而形成穩(wěn)定的微環(huán)境，有利于細(xì)胞沿著纖維蛋白支架向種植體表面遷移和生長(zhǎng)，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。此外，從細(xì)胞形態(tài)變化可見(jiàn)，30～50 μm凹的純鈦表面上的細(xì)胞胞體巨大、飽滿，偽足粗壯，牢牢附著在碗型凹側(cè)壁和邊緣，伸展充分，表面具有大量的分泌顆粒和線粒體一樣的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明30～50 μm的充滿納米結(jié)構(gòu)的“納米巢”，可使細(xì)胞處在最佳的活性和功能狀態(tài)。

ALP是參與骨形成的重要物質(zhì)，是成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物。純鈦表面的ALP活性明顯高于鈦合金表面和機(jī)械表面，這與細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)密切相關(guān)，說(shuō)明30～50 μm碗型凹的粗糙表面更能刺激成骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)其分化。

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（本文編輯 杜冰）