大孔吸附樹(shù)脂HP20分離肉桂原花青素的研究

姜倩 張加研 秦永劍 劉祖廣

摘要 [目的]研究HP-20大孔吸附樹(shù)脂分離肉桂原花青素。[方法]采用HP-20大孔吸附樹(shù)脂分離肉桂原花青素，將1 g原花青素原料溶解在少量60%乙醇中，制得的濃溶液勻速加入吸附柱中，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇對(duì)吸附在樹(shù)脂上的肉桂原花青素進(jìn)行梯度洗脫，并分析各部分質(zhì)量、純度以及聚合度。[結(jié)果]各部分樣品分別標(biāo)記為F20、F40、F60、F80、F100，五部分的質(zhì)量分別為0.24、0.19、0.17、0.27、0.02 g；五部分中，純度最高的為F40部分，純度為82.65%，純度最低的為F100部分，純度為65.11%；洗脫過(guò)程中原花青素回收率達(dá)89%；分析各濃度的乙醇洗脫液中原花青素平均聚合度發(fā)現(xiàn)，10%～40%乙醇洗脫液中主要為低聚體，而40%～100%乙醇洗脫液中主要為高聚體。[結(jié)論]該研究為下一步肉桂原花青素高聚體的降解后的分離提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 原花青素；大孔吸附樹(shù)脂HP-20；分離；聚合度

中圖分類(lèi)號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10919-03

Study on the Separation of Cinnamon Proanthocyanidins by Macroporous Resin HP-20

JIANG Qian1，ZHANG Jiayan1*，QIN Yongjian1 et al （College of Material Engineering，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective] The research aimed to study study the separation of proanthocyanidins by macroporous resin HP-20.[Method]The starting material 1 g of procyanidin was dissolved in a small amount of 60% ethanol，the concentrated solution was added to adsorption column in a constant speed.Ethanol concentration of 20%，40%，60%，80%，100% was selected respectively in gradient eluting by macroporous resin HP-20，and the quality，purity，and polymerization degree of all parts of the samples were analyzed.[Result]Each parts of the samples were labeled F20、F40、F60、F80、F100，the quality of five parts was 0.24 ，0.19，0.17，0.27 and 0.02 g separately.In the five parts，the highest purity was F40，and its purity is 82.65%，the lowest purity was F100，its purity was 65.11%.The recovery rate of Proanthocyandins elution was 89%.Analysis of the average polymerization degree of proanthocyanidins in the concentrations of ethanol eluate found that the 10%-40% ethanol eluate contained mainly OPC，40%-100% ethanol eluate contained mainly PPC.[Conclusion] The study provides the theoretical basis for the next study for separation of polymeric proanthocyanidins from cinnamon.

Key words Proanthocyanidins；Macroporous resin HP-20；Separation；Polymerization degree

肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹(shù)皮^[1]，肉桂具有解痙止痛、解熱、擴(kuò)張血管、抗菌、抗腫瘤及促進(jìn)免疫等藥理作用^[2]。肉桂原產(chǎn)于斯里蘭卡，該地產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的70%，中國(guó)、東南亞以及世界許多熱帶地區(qū)均有栽種。我國(guó)肉桂的生產(chǎn)總量占世界的38.1%，主要分布于廣西、云南、福建、海南等省份^[3]，而廣西、廣東兩省肉桂產(chǎn)量占我國(guó)肉桂產(chǎn)量的95%以上^[4]。原花青素按照聚合度的大小，通常將二～四聚體稱(chēng)為低聚原花青素（OPC），五聚體以上的稱(chēng)為多聚原花青素（PPC），OPC與PPC相比，OPC在抗氧化、酶抑制、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎止痛、止血、增進(jìn)免疫調(diào)節(jié)以及促進(jìn)心臟缺血后復(fù)蘇、防止動(dòng)脈硬化、減少對(duì)皮膚的刺激和抗糖尿病等方面有顯著的生物活性^[5]，其在體內(nèi)的抗氧化能力是VE的50倍、Vc的20倍^[6]。Gu等對(duì)41種食品中原花青素的含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)肉桂中原花青素含量最高，但其中高聚原花青素占49.3%，低聚原花青素占50.0%，多聚原花青素由于受到空間位阻的影響，生物活性降低^[7]。因此為了有效發(fā)揮原花青素的抗氧化性，對(duì)原花青素進(jìn)行分級(jí)處理，富集原花青素低聚體成分，能夠提高原花青素生物功效。該試驗(yàn)采用資源豐富的廣西肉桂皮為原材料，研究大孔吸附樹(shù)脂HP20對(duì)肉桂原花青素按聚合度進(jìn)行分離，為下一步肉桂原花青素高聚體降解后的分離提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)水乙醇、甲醇、香草醛、鹽酸（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司），（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素、原花青素（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢定所）、2-巰基乙醇、TU1810DASP C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、Agilent 1200series 高效液相色譜儀、BS-100A自動(dòng)部分接收器、大孔吸附樹(shù)脂HP20（北京慧德易科技有限責(zé)任公司）。

1.2 肉桂原花青素的制備

稱(chēng)取5.04 g（80～120目）肉桂皮粉末于500 ml三口燒瓶中，再向三口燒瓶中加入150 ml 60%乙醇，置于預(yù)先預(yù)熱的50 ℃恒溫水浴鍋中，安裝好冷凝管、磁力攪拌器攪拌，啟動(dòng)攪拌裝置提取1.5 h，隨后取出燒瓶并冷卻至室溫，過(guò)濾后，濾液利用石油醚萃取，萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45±5 ℃減壓干燥，得到干燥原花青素初提物。

1.3 分級(jí)處理試驗(yàn)

將1 g肉桂原花青素原料溶解在少量60%乙醇中，制得的濃溶液勻速加入吸附柱中，依次用20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，分批收集不同百分比濃度乙醇的洗脫液。

1.4 原花青素的回收率以及含量測(cè)定

對(duì)各部分洗脫液于45±5 ℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，所得樣品分別標(biāo)為F20、F40、F60、F80、F100，在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下利用香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素的含量，配制200 μg/ml的樣品甲醇溶液，取0.5 ml樣品加入10 ml比色管中后，依次加入3 ml濃度為4.0 g/100ml的香草醛-甲醇溶液，1.5 ml濃鹽酸，加塞搖勻，在20±1 ℃避光條件下反應(yīng)15 min后，于500 nm處測(cè)其吸光度，利用（+）-兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)液質(zhì)量濃度，從而計(jì)算樣品純度^[8]。

1.5 聚合度測(cè)定

1.5.1 色譜分析條件。色譜柱為Agilent Analytical Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm ，0.5 μm）；流動(dòng)相為A：水（含TFA 0.1%），B：乙腈體系（含TFA 0.1%）；梯度洗脫為0～40 min（4%～25% B）、40～45 min（25%～30% B）、45～55 min（30%～95% B）、55～65 min（95%～4% B）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.5.2 （+）-兒茶素和（-）-表兒茶標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。配制不同濃度的（+）-兒茶素溶劑溶液，過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析，以（+）-兒茶素質(zhì)量或（-）-表兒茶素質(zhì)量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.5.3 硫解目標(biāo)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.5.3.1 硫解反應(yīng)。

1.5.3.1.1 樣品溶液配制。精確稱(chēng)取部分樣品10 mg置于10 ml容量瓶，用 60%乙醇定容，得到濃度為1 mg/ml的樣品溶液。

1.5.3.1.2 2-巰基乙醇反應(yīng)液的配置。分別精確量取2.5 ml 2-巰基乙醇、27.5 ml乙醇、16 ml蒸餾水、4 ml 4%鹽酸水溶液，充分混勻。

1.5.3.1.3 硫解反應(yīng)。分別取100 μl樣品溶液、400 μl 2巰基乙醇反應(yīng)液于試管內(nèi)，充分混勻，以100 μl 60%乙醇、400 μl 2-巰基乙醇反應(yīng)液為對(duì)照。于70 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)4 h，放置室溫冷卻。

1.5.3.2 硫解產(chǎn)物的HPLC分析及產(chǎn)物的制備。利用硫解反應(yīng)液、 2巰基乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相色譜分析，得到反應(yīng)產(chǎn)生的新化合物的波峰。將硫解反應(yīng)擴(kuò)大，反應(yīng)后溶液經(jīng)大孔樹(shù)脂HP20吸附，用蒸餾水洗脫，除去剩余的2-巰基乙醇、鹽酸等，利用甲醇洗脫后溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干后既得到硫解產(chǎn)物。將樣品用少量蒸餾水溶解，上Sephadax柱，依次用400 ml 20%、40%、60%、80%甲醇洗脫，以薄層層析為指導(dǎo)合并洗脫液，再以高效液相色譜分析為指導(dǎo)，找到目標(biāo)產(chǎn)物，將目標(biāo)產(chǎn)物干燥；然后將目標(biāo)產(chǎn)物用少量蒸餾水溶解上CG161M柱進(jìn)行純化，依次用200 ml 10%、30%、50%、70%、80%甲醇洗脫，以薄層層析為指導(dǎo)合并洗脫液，再以高效液相色譜分析為指導(dǎo)，找到目標(biāo)產(chǎn)物，將目標(biāo)產(chǎn)物命名為2MEec^[9]。

1.5.3.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以制備的目標(biāo)產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析，以目標(biāo)產(chǎn)物為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.5.4 平均聚合度的計(jì)算方法。待測(cè)樣品按照“1.5.3.1”硫解反應(yīng)的方法處理以后，經(jīng)高效液相色譜分析檢測(cè)得到其相對(duì)應(yīng)的（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素、2MEec的峰面積，再根據(jù)相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的量，由公式mDP=計(jì)算出其平均聚合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級(jí)處理試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。以（+）-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，擬合回歸線性方程為y=353.516 2x-14.230 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，其中y為質(zhì)量濃度，μg/ml；x為吸光度。

2.1.2 分級(jí)處理試驗(yàn)中各部分純度及回收率。

大孔吸附樹(shù)脂對(duì)肉桂原花青素進(jìn)行吸附，經(jīng)20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，得到五部分樣品，標(biāo)記為F20、F40、F60、F80、F100，從表1可以看出，在五部分中總質(zhì)量最大的是F80部分，其總質(zhì)量為0.27 g，純度為74.81%；純度最高的是F40部分，其純度為82.65%，其總質(zhì)量為0.19 g；在五部分中總量以及純度最低的是F100部分，其總質(zhì)量為0.02 g，純度為65.11%，整個(gè)過(guò)程回收率為89%。

3 結(jié)論與討論

（1） 利用大孔吸附樹(shù)脂HP20分離肉桂原花青素，分離產(chǎn)生五部分樣品F20、F40、F60、F80、F100，總質(zhì)量最大的是F80部分，其總質(zhì)量為0.27 g，純度為74.81%；純度最高的是F40部分，其純度為82.65%，總質(zhì)量為0.19 g；在五部分中總量以及純度最低的是F100部分，其總質(zhì)量為0.02 g，純度為65.11%，整個(gè)過(guò)程回收率為89%。

（2） 用不同濃度乙醇對(duì)吸附在HP20樹(shù)脂上的原花青素進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液中原花青素的平均聚合度隨乙醇濃度的提高而升高，當(dāng)乙醇濃度<40%時(shí)洗脫液中原花青素的平均聚合度為2～5，可以認(rèn)為主要為低聚體；當(dāng)乙醇濃度>60%時(shí)，洗脫液中原花青素的平均聚合度為>5，可以認(rèn)為主要為原花青素高聚體。

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