RNAi體外沉默淋巴管內皮祖細胞VEGFR—3基因表達

陳永春??金海峰??謝立平??王麗芳??張梅??李珅??高喜仁??李靜平

[摘要] 目的 應用聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）包裹淋巴管內皮祖細胞（lymphatic endothelial progenitor cells，LEPCs）血管內皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）基因siRNA，體外沉默VEGFR-3基因表達，研究抑制LEPCs分化抗腫瘤淋巴管新生的作用。 方法 Ficoll法分離人臍血單個核細胞，流式細胞儀、免疫熒光分選并鑒定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并轉染入LEPCs，流式細胞儀檢測轉染效率。RT-PCR和Western blot檢測mRNA和蛋白質水平VEGFR-3基因沉默效果。 結果 VEGFR-3siRNA成功轉入LEPCs，轉染效率30%。VEGFR-3siRNA轉染組LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表達均降低（P<0.05）。 結論 體外經(jīng)由PEI介導的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表達，為以LEPCs為靶點抑制腫瘤淋巴管新生提供了實驗依據(jù)。

[關鍵詞] 淋巴管內皮祖細胞；VEGFR-3；聚乙烯亞胺；siRNA；淋巴管新生

[中圖分類號] R737.14 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）18-11-04

腫瘤淋巴管的新生與腫瘤轉移有密切的聯(lián)系，能否有效抑制腫瘤淋巴管新生成為腫瘤治療的研究熱點。2005年，Wang等[1]繼Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+細胞為LEPCs。在趨化因子的作用下，LEPCs動員、遷移至病變組織，血管內皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）通過VEGF-C/VEGFR-3信號途徑誘導其向淋巴管內皮細胞分化，進而促使新的淋

巴管生成[3-4]。Religa等[5]對淋巴管炎癥角膜小鼠進行輻射處理后輸入骨髓源性的細胞，發(fā)現(xiàn)VEGFR-3+細胞出現(xiàn)在新生淋巴管中；Bogos等[6]檢測到小細胞肺癌患者血中CD34與VEGFR-3雙陽性細胞明顯增多，且與癌細胞淋巴結轉移呈正相關。上述結果提示，VEGFR-3在LEPCs參與的腫瘤淋巴管的新生中起重要作用[7]，如果我們靶向阻斷VEGFR-3來抑制VEGF-C/VEGFR-3信號途徑參與的腫瘤淋巴管新生，可達到抗腫瘤淋巴轉移的目的。

RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補的dsRNA導入細胞，特異性地降解靶基因的mRNA，從而產(chǎn)生相應的功能表型缺失的技術。本實驗應用RNAi技術，擬將與VEGFR-3同源的siRNA轉染入LEPCs，抑制其分化為淋巴管內皮細胞，從而達到抗淋巴管新生的目的，為抗腫瘤淋巴管新生提供實驗依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM（Gibco），兔抗人VEGFR-3（Santa cruz），小鼠抗人CD133、CD34（Diagnostica），胎牛血清（四季青，杭州天杭生物科技有限公司），羊抗兔IgG FITC（Chemicon），羊抗小鼠IgG PE（Chemicon），羊抗兔IgG TRITC（Jackson），Trizol（Invitrogen），cDNA反轉錄試劑盒（Fermentas），Ladder DNA、蛋白質marker（Bio-rad），蛋白提取試劑盒（pierce），PEI（25kDa，Sigma Aldrich）。

流式細胞儀（FACS Calibur，F(xiàn)ACSAria，BD）；PCR儀（9600型，PE）；轉膜儀和蛋白電泳儀（Bio-rad）；恒溫培養(yǎng)箱（Heraeu）；Olympus熒光顯微鏡、相差倒置顯微鏡（Nikon）。

1.2 單個核細胞的分離

取50～60mL足月正常分娩胎兒臍血，加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度離心法[8]分離單個核細胞。將靜置后的上部血液等量稀釋后加于Ficoll液面上，F(xiàn)icoll液與稀釋血液的比例約為1∶2，離心（360g，25min）。將含有單個核細胞的液段移至另一離心管，PBS混懸后離心（250g，12min），收集細胞。

1.3 LEPCs的分選

用PBS（含1%BSA）清洗細胞，PBS混懸細胞，調整細胞密度1×107個/mL，加兔抗人VEGFR-3（1∶100），4℃孵育55min。用PBS洗3次，加1∶100 TRITC標記的羊抗兔IgG，4℃孵育30min。PBS清洗后，用DMEM（含2.5%FBS）重懸細胞[9]，F(xiàn)ACS Aria流式細胞儀分選VEGFR-3陽性細胞。將分選出的細胞培養(yǎng)后進行免疫熒光鑒定CD34和CD133的表達[4]。

1.4 VEGFR-3 siRNA抑制率的檢測

1.4.1 VEGFR-3 siRNA的設計（表1）與合成（上海生工）

1.4.2 體外轉染 （1）siRNA/PEI溶液的制備：將制得的PEI載體溶液（1mg/mL）滴加入siRNA溶液（1μg）中（N/P=8），振蕩，室溫孵育30min。（2）每

孔4×104個細胞接種于24孔板至細胞匯合度40%～60%，PBS清洗，加入無血清的DMEM。（3）將siRNA/PEI溶液分別加入細胞中輕輕混勻，轉染6h后，更換完全培養(yǎng)基。熒光顯微鏡觀察后消化細胞，流式細胞儀分析轉染效率。

1.4.3 半定量RT-PCR 實驗分五組：空白轉染組、對照轉染組、siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組。體外轉染同上，各組細胞數(shù)1×107，更換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至48h[10]。將Trizol 1mL加入培養(yǎng)皿中，吹打數(shù)次，將細胞裂解液轉至1.5mL EP管中，室溫靜置5min；加入氯仿0.2mL，振蕩15s，室溫放置10min，12 000rpm，4℃離心10min；將上層液體移至另一個1.5mL EP管中，加異丙醇0.5mL，冰上放置10min，12 000rpm，4℃離心10min；棄上清加75%乙醇1mL渦旋振蕩，8000rpm，4℃離心5min。棄去上清，干燥沉淀，加入40μL DEPC水溶解RNA。RT的反應條件：30℃10min，45℃ 30min，99℃ 5min，4℃ 5min；PCR反應條件：94℃ 2min，然后94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，30個循環(huán)。VEGFR-3引物序列（f）5'TTTGTGGAGGGAAAGAATAAGA3'（r）5'GGACAGGTTGAGGGGCTA3'由上海生工合成，擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。每組分別取3個樣本，實驗重復3次。endprint

1.4.4 Western blot 轉染步驟同上，轉染后培養(yǎng)72h，棄培養(yǎng)基，用0.01M PBS浸洗2次。加入RIPA蛋白提取試劑，冰上裂解25min；用刮勺將細胞刮取至1.5mL EP管中（冰上操作），12 000rpm，4℃離心12min，上清液轉移至EP管中，BCA法測蛋白含量。各組上樣量相同，SDS-PAGE電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白用濕式電轉移到PVDF膜上，用含3%BSA封閉液封閉，然后1mL兔抗人VEGFR-3抗體稀釋液（1∶200）處理，以同樣的方式加入HRP標記的羊抗兔IgG孵育2h。用ECL法顯影。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件進行處理，用（）表示；多組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外轉染結果

N/P=8時，流式細胞儀檢測siRNA/PEI轉染組轉染效率為30%。

2.2 各組VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表達的分析

2.2.1 半定量RT-PCR結果分析 各組VEGFR-3mRNA表達結果顯示，空白與陰性轉染組之間無差異，siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉染組和陰性轉染組比較均有顯著差異，其中siRNA a組抑制效率最高（圖1）。

Marker 空白 陰性 a b c

GAPDH（590bp）

VEGFR-3（261bp）

A

B

A：VEGFR-3siRNA/PEI轉染LEPCs48h各組VEGFR-3mRNA的表達。B：統(tǒng)計學結果siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉染組和陰性轉染組比較有統(tǒng)計學意義，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa組與siRNAb組、siRNAc組比有統(tǒng)計學意義P<0.05

圖1 半定量RTPCR結果分析

2.2.2 Western blot檢測結果分析 轉染各組細胞VEGFR-3蛋白表達結果顯示，空白與陰性轉染組之間無差異siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉染組和陰性轉染組比較均有顯著差異，其中siRNA a組抑制效率最高（圖2）。此結果在蛋白水平上符合半定量RT-PCR的實驗結果。

空白 陰性 a b c

VEGFR-3165KD

β-actin 43KD

C

D

C：VEGFR-3siRNA/PEI轉染LEPCs72h各組VEGFR-3蛋白的表達。D：統(tǒng)計學結果siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉染組和陰性轉染組比較有統(tǒng)計學意義，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa組與siRNAb組、siRNAc組比有統(tǒng)計學意義，P<0.05

圖2 Westem blot 檢測結果

3 討論

在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞可經(jīng)新生的淋巴管轉移[11]，抑制腫瘤淋巴管新生對腫瘤治療至關重要。LEPCs參與腫瘤淋巴管新生已成為研究熱點[12]。LEPCs可遷移和定居到腫瘤，參與腫瘤淋巴管新生[3，13-14]。關于LEPCs參與淋巴管新生的機制尚未完全明確。本實驗在體外將VEGFR-3siRNA轉染入LEPCs。裸siRNA分子易降解且靶向性差，目前多采用借助載體給藥，陽離子聚合物具有較低的免疫原性和細胞毒性多被應用于研究[15]。PEI是一種被廣泛用于DNA和siRNA等的陽離子聚合物載體，通過形成納米粒包裹siRNA后給藥[16]。

本研究采用分子量為25KDa的PEI為載體介導VEGFR-3siRNA的轉染，成功轉染VEGFR-3siRNA進入LEPCs內，用RT-PCR和Western blot檢測mRNA和蛋白質表達，證實了VEGFR-3siRNA對靶基因VEGFR-3的沉默效果。說明通過利用RNAi技術能夠在體外靶向抑制LEPCs VEGFR-3的表達，進而干擾VEGF-C/VEGFR-3信號途徑，抑制其分化和淋巴管新生。如果以體外實驗結果作為基礎，將VEGFR-3siRNA導入LEPCs并靶向于腫瘤，可能會抑制淋巴管新生引起的腫瘤轉移。

[參考文獻]

[1] Wang H，Tan Y，Zhang M，et al.Vascular endothelial growth factor-C induced differentiation of CD34+ CD133+ VEGFR-3 EPCs towards lymphatic endothelial cells[J].Jpn J Lymphol，2005，28（2）：71-73.

[2] Salven P，Mustjoki S，Alitalo R，et al.VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD 34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells[J].Blood，2003，101（1）：168-172.

[3] Norrmén C，Tammela T，Petrova TV. et al. Biological basis of therapeutic lymphangiogenesis. Circulation[J].2011，123：1335-1351.

[4] Tan YZ，Wang HJ，Zhang MH，et al.CD34+ VEGFR-3+ progenitor cells have a potential to differentiate towards lymphaticendothelial cells[J]. Cell Mol Med，2014，18（3）：422-433.endprint

[5] Religa P，Cao R，Bjorndahl M，et al. Presence of bone marrow derived circulating progenitor endothelial cells in the newly formed lymphatic vessels[J].Blood，2005，106（13）： 4184-4190.

[6] Bogos K，Renyi-Vamos F，Dobos J，et al.High VEGFR-3-positive circulating lymphatic/vascular endothelial progenitor cell level is associated with poor prognosis in human small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（5）：1741-1746.

[7] 王海杰，譚玉珍.淋巴管內皮祖細胞在淋巴管新生中的作用及其機制[J].解剖科學進展，2011，17（6）：593-596.

[8] González-González M，Rito-Palomares M，Méndez Quintero O. Partition behavior of CD133（+） stem cells from human umbilical cord blood in aqueous two-phase systems： In route to establish novel stem cell primary recovery strategies[J].Biotechnol Prog，2014，30（3）：700-707.

[9] Wu JH，Wang HJ，Tan YZ. et al.Characterization of rat very small embryonic-like stem cells and cardiac repair after cell transplantation for myocardial infarction[J].Stem Cells Dev，2012，21（8）：1367-1379.

[10] Zhang DY，Wang HJ，Tan YZ.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through the DNA damage response and the p53/p21 pathway[J].PLoS One，2011，6（6）：e21397.

[11] Moore XL，LU J，Sun L，et al.Endothelial progenitor cells “homing”specificity to brain tumors[J].Gene Theraphy，2004，11（10）：811-818.

[12] 王海杰，譚玉珍.淋巴管新生及其在疾病發(fā)生和治療中的意義[J].解剖學報，2007，38（2）： 250-252.

[13] Hiasa K，Ishibashi M，Ohtani K，et al.Gene transfer of stromal cell-derived factor-1：enhances ischemic vasculogenesis and angiogenesis via vascular endothelial growth factor/endothelial nitric oxide synthase-related pathway[J].Circulation，2004，109（20）：2454-2461.

[14] Ingber DE. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology[J].CireRes，2002：92（10）：877-887.

[15] Pecot CV，Calin GA，Coleman RL，et al.RNA interference in the clinic： challenges and future directions[J].Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[16] Goldsmith M，Mizrahy S，Peer D.Grand challenges in modulating the immune response with RNAi nanomedicines[J].Nanomedicine，2011，6（10）：1771-1785.

（收稿日期：2014-06-18）endprint

[5] Religa P，Cao R，Bjorndahl M，et al. Presence of bone marrow derived circulating progenitor endothelial cells in the newly formed lymphatic vessels[J].Blood，2005，106（13）： 4184-4190.

[6] Bogos K，Renyi-Vamos F，Dobos J，et al.High VEGFR-3-positive circulating lymphatic/vascular endothelial progenitor cell level is associated with poor prognosis in human small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（5）：1741-1746.

[7] 王海杰，譚玉珍.淋巴管內皮祖細胞在淋巴管新生中的作用及其機制[J].解剖科學進展，2011，17（6）：593-596.

[8] González-González M，Rito-Palomares M，Méndez Quintero O. Partition behavior of CD133（+） stem cells from human umbilical cord blood in aqueous two-phase systems： In route to establish novel stem cell primary recovery strategies[J].Biotechnol Prog，2014，30（3）：700-707.

[9] Wu JH，Wang HJ，Tan YZ. et al.Characterization of rat very small embryonic-like stem cells and cardiac repair after cell transplantation for myocardial infarction[J].Stem Cells Dev，2012，21（8）：1367-1379.

[10] Zhang DY，Wang HJ，Tan YZ.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through the DNA damage response and the p53/p21 pathway[J].PLoS One，2011，6（6）：e21397.

[11] Moore XL，LU J，Sun L，et al.Endothelial progenitor cells “homing”specificity to brain tumors[J].Gene Theraphy，2004，11（10）：811-818.

[12] 王海杰，譚玉珍.淋巴管新生及其在疾病發(fā)生和治療中的意義[J].解剖學報，2007，38（2）： 250-252.

[13] Hiasa K，Ishibashi M，Ohtani K，et al.Gene transfer of stromal cell-derived factor-1：enhances ischemic vasculogenesis and angiogenesis via vascular endothelial growth factor/endothelial nitric oxide synthase-related pathway[J].Circulation，2004，109（20）：2454-2461.

[14] Ingber DE. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology[J].CireRes，2002：92（10）：877-887.

[15] Pecot CV，Calin GA，Coleman RL，et al.RNA interference in the clinic： challenges and future directions[J].Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[16] Goldsmith M，Mizrahy S，Peer D.Grand challenges in modulating the immune response with RNAi nanomedicines[J].Nanomedicine，2011，6（10）：1771-1785.

（收稿日期：2014-06-18）endprint

[5] Religa P，Cao R，Bjorndahl M，et al. Presence of bone marrow derived circulating progenitor endothelial cells in the newly formed lymphatic vessels[J].Blood，2005，106（13）： 4184-4190.

[6] Bogos K，Renyi-Vamos F，Dobos J，et al.High VEGFR-3-positive circulating lymphatic/vascular endothelial progenitor cell level is associated with poor prognosis in human small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（5）：1741-1746.

[7] 王海杰，譚玉珍.淋巴管內皮祖細胞在淋巴管新生中的作用及其機制[J].解剖科學進展，2011，17（6）：593-596.

[8] González-González M，Rito-Palomares M，Méndez Quintero O. Partition behavior of CD133（+） stem cells from human umbilical cord blood in aqueous two-phase systems： In route to establish novel stem cell primary recovery strategies[J].Biotechnol Prog，2014，30（3）：700-707.

[9] Wu JH，Wang HJ，Tan YZ. et al.Characterization of rat very small embryonic-like stem cells and cardiac repair after cell transplantation for myocardial infarction[J].Stem Cells Dev，2012，21（8）：1367-1379.

[10] Zhang DY，Wang HJ，Tan YZ.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through the DNA damage response and the p53/p21 pathway[J].PLoS One，2011，6（6）：e21397.

[11] Moore XL，LU J，Sun L，et al.Endothelial progenitor cells “homing”specificity to brain tumors[J].Gene Theraphy，2004，11（10）：811-818.

[12] 王海杰，譚玉珍.淋巴管新生及其在疾病發(fā)生和治療中的意義[J].解剖學報，2007，38（2）： 250-252.

[13] Hiasa K，Ishibashi M，Ohtani K，et al.Gene transfer of stromal cell-derived factor-1：enhances ischemic vasculogenesis and angiogenesis via vascular endothelial growth factor/endothelial nitric oxide synthase-related pathway[J].Circulation，2004，109（20）：2454-2461.

[14] Ingber DE. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology[J].CireRes，2002：92（10）：877-887.

[15] Pecot CV，Calin GA，Coleman RL，et al.RNA interference in the clinic： challenges and future directions[J].Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[16] Goldsmith M，Mizrahy S，Peer D.Grand challenges in modulating the immune response with RNAi nanomedicines[J].Nanomedicine，2011，6（10）：1771-1785.

（收稿日期：2014-06-18）endprint