微小RNA—21在乳腺癌細(xì)胞中的作用

李振宇+馮云+盧秀波

【摘要】 目的：探討微小RNA（miR）-21在乳腺癌細(xì)胞（MCF7）中的作用。方法：對(duì)MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后程序性細(xì)胞凋亡4（PDCD4）表達(dá)；用噻唑藍(lán)（MTT）比色法測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21后MCF7細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MCF7細(xì)胞凋亡。結(jié)果：經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，轉(zhuǎn)染組未見染色，對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色，轉(zhuǎn)染組PDCD4的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力增加（P<0.05）。轉(zhuǎn)染組的凋亡率為（3.14±0.24）%，明顯低于空白組、空質(zhì)粒組的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PDCD4是miR-21的靶基因之一，miR-21的高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌； 微小RNA-21； 程序性細(xì)胞死亡因子4

The Role of MicroRNA-21 in Human Breast Cancer Cells/LI Zhen-yu，F(xiàn)ENG Yun，LU Xiu-bo.//Medical Innovation of China，2014，11（28）：004-006

【Abstract】 Objective：To investigate the role of microRNA（miR）-21 in the human breast cancercells（MCF7）.Method：The MCF7 transfection of miR-21 was transited，programmed cell death 4（PDCD4） expression after transfection was detected by immunohistochemical，transfected with miR-21 MCF7 cell proliferation measured by tetrazolium（MTT） assay；transfected MCF7 cells withered die was detected by flow cytometry.Result：The control group was detected by immunohistochemistry，cytoplasmic brown color，the transfection group showed no staining，transfected group programmed cell death 4（PDCD4） expression was significantly lower than the control group，MTT assay transfected cell viability was significantly be promoted（P<0.05）.Transfection group apoptosis rate was（3.14±0.24）%，it was significantly lower than （8.04±0.02）%，（9.41±0.53）% in a blank group and empty plasmid group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：PDCD4 is a miR-21 target genes of high expression of miR-21 can promote the development of human breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； miRNA-21； PDCD4

First-authors address：Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang 471009，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.28.002

微小RNA（miRNAs）是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生性RNAs，長(zhǎng)度大約為21～25個(gè)核苷酸，廣泛存在于哺乳動(dòng)物基因組中，具有高度的保守性[1]。現(xiàn)已明確，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。筆者通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21于人乳腺癌細(xì)胞系MCF7中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖、凋亡及PDCD4的表達(dá)，探討兩者的關(guān)系及在乳腺癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MCF7購(gòu)自南京科諾生物有限公司、Hyclone胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自TM公司（寶信生物科技有限公司分裝）、真核質(zhì)粒pEZX-eGFP-miR-21（廣州復(fù)能基因有限公司）、質(zhì)粒抽提試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為公司）、膠回收試劑盒（TaKaRa公司）、兔PDCD4IgG（Abcam公司）、抗兔抗體（Santa Cruz公司）、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，實(shí)驗(yàn)室配制）、噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（Sigma公司）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基公司）。

1.2 MCF7細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 MCF7細(xì)胞于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，熒光顯微鏡于轉(zhuǎn)染24 h內(nèi)觀察并估算轉(zhuǎn)染效率。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定后，在3%過氧化氫-甲醇溶液條件下，常溫孵育10 min；10%山羊血清室溫孵育10 min；滴加1∶200稀釋的兔PDCD4 IgG單抗后，37 ℃孵育1 h；滴加抗兔生物素化二抗50 μL，37 ℃孵育30 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液于鏡下觀察顏色控制時(shí)間3 min。復(fù)染、脫水、透明、封片。endprint

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將細(xì)胞分為3組，每組6孔，于轉(zhuǎn)染后l、2、3、4、5、6、7 d測(cè)量各組吸光度（A）值，比色時(shí)，每孔加MTT溶液（5 g/L）20 μL，37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，結(jié)晶充分溶解，以空白調(diào)零，選擇570 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的A570值，比較各組細(xì)胞的增殖抑制率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡 按照凋亡試劑盒說明書，轉(zhuǎn)染后48 h按說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩樣本比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)兩兩比較t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 MCF7細(xì)胞中較大比例梭型細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率（%）=每高倍鏡視野發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)/同一視野細(xì)胞總數(shù)×100%，24 h轉(zhuǎn)染效率為（0.834±0.062）%，各組轉(zhuǎn)染效率的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 鏡下3組細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異，以細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEZX組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色；轉(zhuǎn)染pEZX-eGFP-miR-21組結(jié)果為陰性。

2.3 MTT法鑒定細(xì)胞增殖活性 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組可以明顯促進(jìn)MCF7細(xì)胞的增殖。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組的細(xì)胞數(shù)均有所增加，但轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖更快，見圖1。

圖1 MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21增殖變化

2.4 細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染組的凋亡率為（3.14±0.24）%，明顯低于空白組、空質(zhì)粒組的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

miRNA是一類由基因組DNA編碼，具有高度保守性的非編碼小分子RNA片段，它通過與目標(biāo)mRNA特異性的堿基配對(duì)，引起目標(biāo)mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化調(diào)控、傷口愈合、免疫系統(tǒng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。miRNA與腫瘤密切相關(guān)，半數(shù)以上的miRNA編碼基因位于腫瘤相關(guān)基因位點(diǎn)和脆性染色體區(qū)域，在不同腫瘤組織中miRNA異常表達(dá)且具有組織特異性[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤等多種實(shí)體腫瘤中的表達(dá)上調(diào)，尤其是在人高度惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，miR-21水平可高出癌旁組織5～10倍[7]。但是，miR-21在個(gè)別腫瘤中也會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)，如促腎上腺皮質(zhì)素分泌型垂體瘤的miR-21表達(dá)量較正常垂體組織低2.4倍，這可能是由于miR-21在不同組織中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能所致[8]。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是Shibahara等[9]1995年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因。通過原位雜交法測(cè)得人PDCD4基因定位于10q24，cDNA全長(zhǎng)3.5 kb，其中編碼區(qū)約1.4 kb[10]。既往多項(xiàng)研究結(jié)果表明，PDCD4是一種腫瘤抑制因子，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生成的作用[11]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義PDCD4后，其增殖加速，細(xì)胞凋亡受到抑制，提示PDCD4能抑制肝癌細(xì)胞系Huh7的增殖，促進(jìn)其凋亡。Hwang等[13]發(fā)現(xiàn)用PDCD4氣溶膠治療肺癌小鼠后，肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期明顯延長(zhǎng)，凋亡顯著加快。Leupold等[14]發(fā)現(xiàn)PDCD4能夠通過抑制尿激酶受體（u-PAR）的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管的生成，降低腫瘤的侵襲性，改善患者的預(yù)后。在大多數(shù)正常組織細(xì)胞中，PDCD4蛋白主要位于細(xì)胞核，當(dāng)內(nèi)環(huán)境改變時(shí)也可以通過核輸出信號(hào)而表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。研究表明，PDCD4在肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌中的表達(dá)受到抑制[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21后分裂增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡受到抑制，提示miR-21與乳腺癌的進(jìn)展可能有關(guān)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21的MCF7中PDCD4明顯降低，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)PDCD4是miR-21的重要靶蛋白，提示在乳腺癌中，miR-21可能是通過作用于其靶蛋白PDCD4來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡能力，這為進(jìn)一步研究miR-21在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。在乳腺癌中，miRNA-21高表達(dá)可能導(dǎo)致抑癌基因PDCD4的失活或低表達(dá)，從而促進(jìn)MCF7細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，這將為乳腺癌的進(jìn)一步的靶向治療提供位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]沈雷.微小RNA與乳腺癌干細(xì)胞的關(guān)系[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，32（2）：110-114.

[2]趙雋，韓宇.microRNA與腫瘤細(xì)胞耐藥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（29）：155-157.

[3]張暢，寧勇.MicroRNA與惡性腫瘤[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（1）：159-161.

[4] Giovannetti E，F(xiàn)unel N，Peters G J，et al.MicmRNA-21 in pancreatic cancer：correlation with clinical outcome and pharmacologic aspects underlying its role in the modulation of gemeitabine activity[J].Cancer Res，2010，70（11）：4528-4538.

[5] Zhu L，Yan W，Rodriguez-Canales J，et al.MicroRNA analysis of mierodissected normal squamous esophageal epithelium and tumor ceils[J].Am J Cancer Res，2011，1（5）：574-584.endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞程序性細(xì)胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達(dá)[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，22（18）：2775-2778.

（收稿日期：2014-03-05） （本文編輯：歐麗）endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞程序性細(xì)胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達(dá)[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，22（18）：2775-2778.

（收稿日期：2014-03-05） （本文編輯：歐麗）endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞程序性細(xì)胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達(dá)[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，22（18）：2775-2778.

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