衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)有機(jī)農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用

熊琳等

摘要：近年來，農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)取得了較快的發(fā)展，其中色譜法由于具有高效、高靈敏度、便捷的優(yōu)點(diǎn)，成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)最主要的手段。但由于受到檢測(cè)儀器的限制，常規(guī)的色譜法對(duì)一些農(nóng)藥殘留無法測(cè)定，通過殘留物與衍生化試劑的化學(xué)反應(yīng)，使這些殘留物能夠被檢測(cè)儀器檢測(cè)，這就顯著地?cái)U(kuò)大了色譜法的使用范圍。對(duì)衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)有機(jī)農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用作了較為全面的闡述，旨在為農(nóng)產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更好地服務(wù)。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留；衍生化；色譜法

中圖分類號(hào)：O657.7；S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）16-3725-06

Abstract： In recent years， the technologies of detecting pesticide residues have been developed rapidly. The chromatography becomes the main method for detecting pesticide residual due to its high efficiency， sensitivity and convenience. Limited by the detector， the conventional chromatographic method can not detect all residues. Detecting the residues through the chemical reaction between the residues and the derivation reagents can it greatly expand the scope of application of chromatography. Derivatization in detecting organic pesticide residues with chromatography was reviewed in this paper.

Key words： pesticide residues； derivatization； chromatography

有機(jī)農(nóng)藥可以分為有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等四大類。隨著農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和廣泛使用，農(nóng)藥殘留問題日益突出，造成了嚴(yán)重的農(nóng)藥污染問題，對(duì)人體健康也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1，2]。目前測(cè)定農(nóng)藥殘留的主要方法有色譜法、毛細(xì)管電泳法[3]、免疫分析法[4]、生物傳感器法等[5]。毛細(xì)管電泳法所采用的儀器為一些普及度較低的特殊儀器，所用試劑一般價(jià)格昂貴，還不能大規(guī)模地推廣使用；生物傳感器法是近年來才出現(xiàn)的新方法，應(yīng)用范圍不廣，僅限于有機(jī)磷等少數(shù)農(nóng)藥殘留檢測(cè)，并且該方法靈敏度和準(zhǔn)確度都不太穩(wěn)定；免疫分析法同樣僅限于少數(shù)農(nóng)藥殘留檢測(cè)，一次只能檢測(cè)1種化合物，而且需要大量板管等器件，成本較高。而色譜法具有高選擇性、高分離效能、高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，因而是農(nóng)藥殘留檢測(cè)最常用、最有效的方法。但色譜法也有自身的缺點(diǎn)，有些農(nóng)藥殘留物對(duì)檢測(cè)儀器沒有響應(yīng)或響應(yīng)較弱，不能直接檢測(cè)，需要進(jìn)行衍生化處理。衍生化技術(shù)可以擴(kuò)大檢測(cè)物的范圍，提高樣品在檢測(cè)儀器上的靈敏度，改善樣品混合物在色譜柱上的分離效果[6]。衍生化技術(shù)對(duì)于增加農(nóng)藥殘留檢測(cè)的種類、降低檢測(cè)成本和儀器采購(gòu)?fù)度?、保障飲食安全、提升中?guó)農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

1 有機(jī)農(nóng)藥殘留檢測(cè)中衍生化技術(shù)簡(jiǎn)介

有機(jī)農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的色譜法可以分為：薄層色譜法[7]、氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9，10]、超臨界流體色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]和液相色譜-質(zhì)譜法[12]等。其中氣相色譜法、液相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)部門分析農(nóng)藥殘留的主要方法[13]。薄層色譜法常用于快速定性檢測(cè)，一般不涉及衍生化問題；超臨界流體色譜法在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較少。氣相色譜法適合分析有足夠揮發(fā)性的物質(zhì)，對(duì)極性強(qiáng)、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)往往不能直接進(jìn)樣分析，但如果進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理[14]，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物就可以檢測(cè)，擴(kuò)大了氣相色譜法的測(cè)定范圍[15]；液相色譜法在分析中一般要求被測(cè)樣品有紫外吸收[16]或能被激發(fā)產(chǎn)生熒光，對(duì)于無紫外吸收或紫外吸收較弱，不發(fā)熒光或熒光較弱的樣品靈敏度很低，甚至不能檢測(cè)，也需要進(jìn)行衍生化處理。

1.1 農(nóng)藥殘留檢測(cè)中衍生化機(jī)理

常用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的衍生化試劑有：硅烷化試劑、烷基化試劑、?；噭?、紫外衍生試劑、熒光衍生試劑等。硅烷化試劑可以將硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氫，降低化合物的極性，減少氫鍵束縛，所形成的硅烷化衍生物更容易揮發(fā)。同時(shí)由于含活性氫的反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)目減少，化合物的穩(wěn)定性也得以加強(qiáng)，被檢測(cè)性能增強(qiáng)。適用于羥基化合物，也可用于含羧基、巰基、胺基等官能團(tuán)的化合物；烷基化試劑與硅烷化試劑類似，是將烷基官能團(tuán)（脂肪族或芳香族）添加到活性官能團(tuán)（H）上，以烷基基團(tuán)代替氫的重要性在于生成的衍生物與原來化合物相比極性大為下降。該類試劑常用于改良含有酸性氫的化合物，如羧酸類和苯酚類；酰基化試劑可通過羧酸或共衍生物的作用將含有活潑氫（例如-OH、-SH、-NH）的化合物轉(zhuǎn)化為酯、硫酯或酰胺，可以作為烷基化試劑的替代方法；紫外衍生試劑和熒光衍生試劑都屬于改善檢測(cè)性能的衍生化試劑。一般當(dāng)物質(zhì)在200～400 nm有紫外吸收時(shí)，考慮用紫外檢測(cè)儀器，紫外衍生化試劑可以改善物質(zhì)的紫外吸收效應(yīng)。熒光檢測(cè)儀器只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)，靈敏度也高，適合于多環(huán)芳烴及各種熒光物質(zhì)的痕量分析。不發(fā)熒光的物質(zhì)，經(jīng)熒光衍生試劑處理后可轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕镔|(zhì)，而后進(jìn)行分析。

1.2 農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常見衍生化試劑

在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，可根據(jù)待測(cè)農(nóng)藥試樣所含官能團(tuán)的種類選擇適宜的衍生試劑，各種常見衍生試劑的種類、代表物以及特點(diǎn)如表1所示。

2 衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥中的應(yīng)用

有機(jī)氯農(nóng)藥屬于神經(jīng)毒物，在外界環(huán)境或有機(jī)體內(nèi)均不易分解[17]，容易造成殘留，致人慢性中毒，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人體健康。由于有機(jī)氯農(nóng)藥的高殘留特點(diǎn)，在食品農(nóng)藥殘留研究中最受重視[18]。鹵素具有較強(qiáng)的電負(fù)性，因此多數(shù)有機(jī)氯農(nóng)藥使用帶有電子捕獲檢測(cè)儀器的氣相色譜儀可以直接測(cè)定，部分電負(fù)性較弱或揮發(fā)性不好的有機(jī)氯農(nóng)藥需要進(jìn)行衍生化處理，常見的是（硅）烷基化衍生試劑，例如三甲硅基重氮甲烷、五氟苯基重氮甲烷、五氟芐基溴等。有機(jī)氯農(nóng)藥與這些試劑反應(yīng)可以增加親電力，提高揮發(fā)性，使之適合于靈敏的電子捕獲檢測(cè)儀器。趙守成等[19]用氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大米中3，5-二氯苯甲酸、麥草畏、2，4-D丙酸、2，4-D、五氯苯酚等12種酸性除草劑，其中有8種是有機(jī)氯農(nóng)藥，樣品用重氮甲烷乙醚溶液衍生化，該法回收率>80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%，最低檢測(cè)限為0.01～0.05 mg/kg，檢測(cè)限低、回收率比較理想，滿足殘留檢測(cè)的要求。Moy等[20]用高效液相色譜法測(cè)定水中百草敵、2，4-D等多種有機(jī)氯除草劑和其他幾種酸性除草劑，用三甲基硅烷化重氮甲烷作為衍生化試劑。黎源倩等[21]用帶有電子捕獲檢測(cè)儀器的氣相色譜儀分析糧食中綠麥隆殘留量，提純凈化后的洗脫液經(jīng)濃縮后用七氟丁酸酯直接衍生。

3 衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中的應(yīng)用

有機(jī)磷農(nóng)藥能夠抑制體內(nèi)的膽堿酶，使其失去分解乙酰膽堿的能力，從而造成體內(nèi)乙酰膽堿的積累，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)[22]，使各項(xiàng)功能失調(diào)，引起生理紊亂，因此對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)是十分必要的，而且有機(jī)磷農(nóng)藥殘留是中國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重點(diǎn)[23]，氣相色譜法被中國(guó)及世界上大多數(shù)國(guó)家作為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法或仲裁方法。用氣相或液相檢測(cè)都可能涉及到衍生化的問題，其中氣相衍生化試劑主要是利用烷基化試劑和酰基化試劑，將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為酯類或者醚類化合物，提高有機(jī)磷的揮發(fā)性。在液相色譜檢測(cè)中主要是用熒光衍生化試劑熒光胺、丹酰氯、芴代甲氧基酰氯等，在這些衍生化試劑中使用最多、衍生條件最成熟的是芴代甲氧基酰氯，衍生化反應(yīng)方程式如圖1所示。劉錚錚等[24]先用芴代甲氧基酰氯衍生水中的草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸等，再用配有熒光檢測(cè)儀器的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確地測(cè)定水中痕量新型有機(jī)磷除草劑的分析方法，平均加標(biāo)回收率分別為94.2%、90.8%、98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.80%、0.68%、2.80%，定性下限和定量下限分別為0.050、0.040、0.009 μg/L和0.16、0.12、0.03 g/L。Freuze等[25]在研究水中草甘膦、氨甲基磷酸與多價(jià)陽(yáng)離子絡(luò)合作用的影響時(shí)，也使用芴代甲氧基酰氯作為衍生化試劑，帶有熒光檢測(cè)儀器的高效液相色譜儀檢測(cè)。曹趙云等[26]采用液相色譜-質(zhì)譜法建立稻米中草甘膦及氨甲基磷酸殘留量的測(cè)定方法，試樣經(jīng)水提取和C18固相萃取柱凈化后，在硼酸緩沖液中與芴代甲氧基酰氯進(jìn)行衍生反應(yīng)。

另外，Zhou等[27]用帶有激光感應(yīng)熒光檢測(cè)儀器的膠束電動(dòng)色譜分析法（MEKC），全自動(dòng)檢測(cè)河水中的有機(jī)磷農(nóng)藥，試驗(yàn)中采用毛細(xì)管柱衍生法對(duì)有機(jī)磷樣品進(jìn)行在線衍生，首次采用4-氟-7-硝基苯并噁唑作為衍生化試劑，草銨膦和草甘膦的檢出限分別是2.8 ng/mL和32.2 ng/mL，比傳統(tǒng)的柱前衍生要好。鄔春華等[28]采用毛細(xì)管氣相色譜法，測(cè)定尿樣中二烷基磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物的含量，樣品提取物與五氟溴芐苯（PFBBr）衍生化，衍生化反應(yīng)主要分兩步進(jìn)行，首先衍生試劑的溴原子脫離，形成帶正電荷的基團(tuán)，再與離子化的二烷基（硫代）磷酸酯結(jié)合生成衍生物，反應(yīng)方程式如圖2所示。樣品的加標(biāo)回收率為70.2%～93.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%。該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

4 衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類廣譜性殺蟲劑，具有高效、低毒、生物降解性好等優(yōu)點(diǎn)。它們是酯類化合物，具有較低的沸點(diǎn)，大多數(shù)是液體和低沸點(diǎn)固體，容易液化，因此大多數(shù)使用氣相色譜法[29，30]、氣相色譜-質(zhì)譜法[31]等檢測(cè)，待測(cè)樣品一般沒有衍生化的要求。

5 衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用

氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有高效、低殘留、殺蟲譜廣、低毒、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)替代高毒農(nóng)藥得到廣泛應(yīng)用[31]。但是這類農(nóng)藥一旦進(jìn)入人體內(nèi)，可生成具有致癌作用的亞硝基化合物，因此氨基甲酸酯類農(nóng)藥并不是絕對(duì)安全的。目前測(cè)定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[32]、液相色譜-質(zhì)譜法[33]和液相色譜法[34]等。自從1977年Moye等首次采用液相色譜柱后衍生測(cè)定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留以來，利用液相色譜柱后水解或柱后衍生法對(duì)復(fù)雜介質(zhì)中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量進(jìn)行檢測(cè)越來越普遍。近年來多采用液相色譜柱后衍生技術(shù)，使氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的甲氨基團(tuán)在堿液作用下生成的甲胺與衍生試劑反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，再用高靈敏度的熒光檢測(cè)儀器檢測(cè)。該方法具有選擇性高、基質(zhì)干擾小的優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥最有效、最靈敏的方法。使用最廣泛的衍生化試劑是鄰苯二甲醛和巰基乙醇，首先氨基甲酸酯類農(nóng)藥在堿性條件下水解產(chǎn)生甲胺，甲胺再與鄰苯二甲醛、巰基乙醇反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，以熒光檢測(cè)儀器檢測(cè)，反應(yīng)方程如圖3所示。于彥彬等[35]用液相色譜柱后衍生熒光法測(cè)定蔬菜和水果中的13種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，衍生化試劑為鄰苯二甲醛和巰基乙醇，發(fā)現(xiàn)當(dāng)巰基乙醇和鄰苯二甲醛的體積比為10∶100時(shí)，熒光響應(yīng)值達(dá)最大值，該方法相關(guān)系數(shù)大于0.994，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%～0.22%，檢測(cè)下限為2.00～2.28 mg/kg。孫磊等[36]采用柱后衍生酸酯類農(nóng)藥殘留，樣品用丙酮提取，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化，通過柱后衍生系統(tǒng)，最后用熒光檢測(cè)儀器測(cè)定，衍生化試劑為巰基乙醇和鄰苯二甲醛，該方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～7.0%，檢測(cè)限為0.01 mg/kg，具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

另外，King等[37]將超臨界二氧化碳流體作為溶劑，把全氟丁酸酐、HFBA、嘧啶等衍生化劑溶解進(jìn)行衍生化反應(yīng)，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的衍生產(chǎn)物同時(shí)被提取到超臨界二氧化碳流體里面，進(jìn)一步促進(jìn)衍生化反應(yīng)，具有非常高的靈敏性，并且消除有機(jī)溶劑在衍生化反應(yīng)中的使用。孟凡立等[38]建立測(cè)定黃瓜、西紅柿及土壤中福美雙殘留的衍生化高效液相色譜法，首先福美雙在堿性EDTA-Na2溶液中降解，再用碘甲烷進(jìn)行甲基化處理，最后用HPLC測(cè)定該甲基化產(chǎn)物。在黃瓜、西紅柿和土壤中福美雙的添加濃度在0.05～2.00 mg/kg，平均回收率分別為74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，變異系數(shù)分別為0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在農(nóng)藥殘留測(cè)定所允許的范圍內(nèi)，衍生化反應(yīng)方程式如圖4所示。

6 衍生化技術(shù)在色譜法檢測(cè)其他農(nóng)藥中的應(yīng)用

在實(shí)際生產(chǎn)中還有很多農(nóng)藥不屬于上述四類，在檢測(cè)中也會(huì)涉及到衍生化的問題。Yu等[39]同時(shí)檢測(cè)水中除草劑苯噻草胺及其代謝物，將標(biāo)準(zhǔn)多組分液用甲硅烷基衍生化試劑N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生，該方法回收率在78.6%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～9.2%，準(zhǔn)確度和精確度都較高。Díez等[40]用氣相色譜法檢測(cè)溴草腈等酸性除草劑，為提高酸性除草劑的揮發(fā)性，用三甲基氫氧化硫（TMSH）對(duì)其進(jìn)行衍生化。第一步在高溫條件下將酸甲基化，第二步同樣條件下酯化。許行義等[41]以五氟芐基溴（PFB-Br）為衍生化試劑，檢測(cè)了水樣中的多菌靈組分，在分析結(jié)果的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度和方法的檢出限方面，均獲得了非常滿意的結(jié)果。程永等[42]建立測(cè)定土壤中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的柱前衍生化高效液相色譜熒光測(cè)定方法，采用三氟乙酸酐（TFAA）-甲基咪唑（NMIM）-乙腈（ACN）作為衍生化試劑?？傊?，當(dāng)在殘留檢測(cè)中需要衍生化處理，可根據(jù)農(nóng)藥本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)，選擇合適的衍生試劑進(jìn)行反應(yīng)。

7 小結(jié)

隨著越來越多農(nóng)藥殘留問題的不斷出現(xiàn)，人們對(duì)檢測(cè)儀器和方法的要求也越來越高。色譜法作為現(xiàn)在最有效、最成熟的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法是其他諸多方法不可替代的。單純的色譜法由于受到檢測(cè)儀器的限制，能夠檢測(cè)物質(zhì)的種類是有限的，而衍生化技術(shù)可以很好地彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，只要通過合適的衍生化反應(yīng)就可以把待檢物轉(zhuǎn)化為適合色譜法檢測(cè)的物質(zhì)。顯著地?cái)U(kuò)大了被檢測(cè)物質(zhì)的范圍，可避免一些昂貴儀器的購(gòu)買，特別適合配備一般的氣相和液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)監(jiān)督機(jī)構(gòu)使用?，F(xiàn)有衍生化試劑種類不多，通用性不強(qiáng)，使用受到一定的限制。因此以后對(duì)衍生化技術(shù)的研究將會(huì)更加受到人們的重視，而且會(huì)向著以下的方向發(fā)展：①提高衍生化技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確度。由于衍生化的實(shí)質(zhì)是化學(xué)反應(yīng)，很難實(shí)現(xiàn)百分之百的轉(zhuǎn)化率，存在一定的誤差，要不斷地降低誤差，達(dá)到高靈敏度和準(zhǔn)確度；②衍生化試劑具有通用性?，F(xiàn)有的衍生化試劑通用性不強(qiáng)，一般只針對(duì)一種或一類待檢物，因此要開發(fā)通用性強(qiáng)的衍生化試劑；③操作簡(jiǎn)單化。衍生化過程需要一定的設(shè)備，開發(fā)出更加先進(jìn)的、專用的集成衍生化設(shè)備，可以使操作更加簡(jiǎn)單、快速，提高檢測(cè)效率。

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